一种脂肽检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种脂肽检测方法，该方法包括以下步骤：a)将待检测样品溶液pH调为1～2，然后用乙醚萃取，萃取物用NaOH溶液洗涤溶解，调节所得溶解液的pH调为1～2，用乙醚二次萃取，得到待检样品中的脂肽提取物；b)将脂肽提取物水解得到氨基酸，氨基酸进行硅烷化反应，反应产物用GC/MS检测，色谱图积分得到氨基酸(亮氨酸)峰面积；c)依据氨基酸(亮氨酸)计算脂肽含量。与现有技术相比，本发明脂肽检出限达到ppm级，解决了复杂体系中微量脂肽检测的技术难题。
【专利说明】一种脂肽检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种脂肽检测方法，具体是一种复杂体系中微量脂肽的检测方法。
【背景技术】
[0002]脂肽是一类重要的生物表面活性剂，具有良好的表面活性及生物活性，被广泛应用于食品、化妆品、药品、油田开发等领域，目前已经受到广泛关注。
[0003]在实际应用过程中，含脂肽的应用体系一般具有如下特点:1)由于脂肽具有较强的表界面活性，脂肽用量一般较低；2)为了强化作用效果，通常脂肽会和化学表面活性剂、聚合物等物质复合使用；3)复合使用的体系或待分析样品中又往往含有机酸、烃类有机物、无机盐等杂质。因此，对于这样的低含量、多杂质并存的复杂体系，准确定量分析其中的微量脂肽具有非常大的技术难度。
[0004]现有技术检测脂肽的方法有重量法、薄层色谱法、高效液相色谱法等方法。
[0005]重量法是利用脂肽在酸性条件下可以形成沉淀的原理，通过离心分离沉淀物，干燥称重的方法来分析脂肽的量。由于复杂体系中杂质较多，有些杂质本身可以在酸性条件下沉淀，重量法测定时杂质会对测定结果产生很大影响，导致误差较大；同时，对于脂肽含量很低(102ppm级)的体系，该方法无法检测，因此重量法是一种脂肽的常规、常量检测方法。
[0006]薄层色谱法是采用TLC将样品色谱分离，在层析板上得到脂肽分离的斑点，脂肽斑点采用水解及显色剂显色，通过定量分析斑点显色情况，确定脂肽量。复杂体系中的一些化学添加剂(表面活性剂如石油磺酸盐、烷基苯磺酸盐，微量原油等化学杂质)，可能会影响脂肽的TLC分离，同时又会干扰脂肽水解产物的显色，因此，依据斑点显色进行定量分析误差较大，甚至导致检测失败。
[0007]高效液相色谱法检出限较高(102ppm级)，且考虑到分离效果及对色谱柱的伤害，高效液相色谱法仅适用于检测比较纯净的脂肽样品。而复杂体系中物质繁杂，物质理化性质差异大，不仅干扰检测，严重时会伤害色谱柱，导致柱效降低，定量不准。对于复杂体系中微量的脂肽，浓度低于高效液相色谱检出限，检测无法进行。此外，高效液相色谱法检测还需要脂肽标准物质，而目前已知的脂肽化合物有23个族，单就考虑分子量和肽链部分，就有近90个不同分子化合物，如果再考虑脂肪链的不同，不同分子化合物的数量将更大，这进一步加大了获取标准物质的难度。即使超出检出限，因无对应的标准物质，也无法准确地定量分析。由上可见，现有技术在进行复杂体系中微量脂肽的检测方面，存在着检出限高、检出能力低、样品要求及伤害仪器等一项或多项缺陷，无法进行准确的计量检测。
[0008]本发明利用脂肽在酸性条件下不溶，碱性条件可溶的特点，通过降低待检测样品溶液的PH，降低脂肽溶解度，在此基础上采用乙醚萃取，萃取物采用碱液洗涤，将脂肽复溶到碱液中；溶解液调低PH后再次用乙醚萃取，有效地将脂肽从复杂体系中分离出来；之后将获得的脂肽提取物水解为氨基酸，氨基酸硅烷化反应后利用GC/MS检测，通过定量分析其中的氨基酸(峰面积)，根据氨基酸峰面积和脂肽量的对应关系，(脂肽中氨基酸所占的比例是确定的、已知的)，特异性地计算样品中脂肽的量。该方法极大地提高了脂肽的检出限，实现了特异性检测。
【发明内容】
[0009]本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种可定量分析的脂肽检测方法。
[0010]本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:一种脂肽检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤:
[0011]a)将待检测样品溶液pH调为I?2，然后用乙醚萃取，萃取物用NaOH溶液洗涤溶解，调节所得溶解液的PH调为I?2，用乙醚二次萃取，得到待检样品中的脂肽提取物；
[0012]b)将脂肽提取物水解得到氨基酸，氨基酸进行硅烷化反应，反应产物用GC/MS检测，色谱图积分得到氨基酸(亮氨酸)峰面积；
[0013]c)依据氨基酸(亮氨酸)计算脂肽含量。
[0014]步骤a)所述的NaOH溶液的浓度为0.2mol/L?0.8mol/L。
[0015]步骤a)所述的pH调为I?2所用的试剂为6M HCl。
[0016]步骤b)所述的脂肽提取物水解所用试剂为6M HCl，水解温度为90?110°C，时间为20?24h。
[0017]步骤c)所述的依据氨基酸(亮氨酸)计算脂肽含量为依据GC/MS检测到的氨基酸硅烷化反应产物的峰面积与脂肽浓度关系曲线计算脂肽含量。
[0018]步骤b)所述的氨基酸进行娃烧化反应参照文献(Quantitative Analyses of theIsoforms of Surfactin Produced by Bacillus subtilis HS0121Using GC-MS)提供的方法进行硅烷化反应。
[0019]与现有技术相比，本发明用乙醚萃取-NaOH溶液洗涤溶解-乙醚二次萃取的方法分离得到待检样品中的脂肽提取物。即利用脂肽在酸性条件下不溶，碱性条件溶解的特点，通过降低待检测样品溶液的PH，降低脂肽溶解度，在此基础上采用乙醚萃取，萃取物采用碱液洗涤，将脂肽复溶到碱液中；溶解液调低PH后再次用乙醚萃取，有效地将脂肽从复杂体系中分离出来；之后将获得的脂肽提取物水解为氨基酸，氨基酸硅烷化反应后利用GC/MS检测，通过定量分析其中的氨基酸(峰面积)，根据氨基酸峰面积和脂肽量的对应关系，(月旨肽中氨基酸所占的比例是确定的、已知的)，特异性地计算样品中脂肽的量。该方法极大地提高了脂肽的检出限，实现了特异性检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1为本发明技术GC/MS测定某油田现场污水配制的复杂体系样品(实施例1)中氨基酸(亮氨酸)离子色谱图。
【具体实施方式】
[0021]下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
[0022]实施例1
[0023]某油田现场污水配制的复杂体系样品:其中含有微量脂肽、石油磺酸盐、原油、无机盐离子、小分子有机酸等杂质。
[0024]取IOOmL复杂体系样品于分液漏斗I,用盐酸(6M)调节pH = I后乙醚萃取3次，取乙醚层于分液漏斗2。再用0.2mol/LNa0H溶液洗涤分液漏斗2中的萃取物3次，取碱液层于分液漏斗3。最后再用盐酸(6M)调节分液漏斗3中的样品至pH = 1.5，调节后用乙醚萃取3次，取乙醚层于安培瓶中，吹干乙醚，获得脂肽提取物。向提取出的脂肽提取物中加Λ 0.5mL6M HC1，90°C水解24h。反应完毕后，水解液全部转移至气质小瓶，完全干燥后，参照文献(Quantitative Analyses of the Isoforms of Surfactin Produced by Bacillussubtilis HS0121Using GC-MS)提供的方法进行硅烷化反应。所得硅烷化产物采用Agilent的气相色谱-质谱联用仪(6890GC，5975MSD)进行检测，色谱图积分得到氨基酸(亮氨酸)峰面积为3.002(单位:Χ106μ V.S)，如图1。由亮氨酸峰面积(y，单位:Χ106μν.S)与脂肽含量(X，单位:g/L)关系标准工作曲线I = 3.2043X+0.0045，计算可得分析样品中脂肽含量为:0.935g/L(935ppm)。
[0025]实施例2
[0026]聚驱油田产出液样品:其中含有微量脂肽、聚合物、原油、无机盐离子、短链脂肪酸等杂质。
[0027]取IOOmL复杂体系样品于分液漏斗1，用盐酸(6M)调节pH = 1.5后乙醚萃取3次，取乙醚层于分液漏斗2。再用0.4mol/L NaOH溶液洗涤分液漏斗2中的萃取物3次，取碱液层于分液漏斗3。最后再用盐酸(6M)调节分液漏斗3中的样品至pH = 1.0,乙醚萃取3次，取乙醚层于安培瓶中，吹干乙醚，获得脂肽提取物。向提取出的脂肽提取物中加入0.5mL6M HC1，90°C水解24h。反应完毕后，水解液全部转移至气质小瓶，完全干燥后，参照文献(Quantitative Analyses of the Isoforms of Surfactin Produced by Bacillussubtilis HS0121Using GC-MS)提供的方法进行硅烷化反应。所得硅烷化产物采用Agilent的气相色谱-质谱联用仪^890GC，5975MSD)进行检测。得到氨基酸(亮氨酸)峰面积为0.402 (单位:X IO6 μ V.S)，由亮氨酸峰面积(y，单位:X IO6 μ V.S)与脂肽含量(X，单位:g/L)关系标准工作曲线y = 3.2043X+0.0045，计算可得分析样品中脂肽含量为:0.124g/L(124ppm)。
[0028]实施例3[0029]复杂体系样品:微量脂肽、烷基苯磺酸盐、原油、无机盐离子、杂质。
[0030]取IOOmL复杂体系样品于分液漏斗1，用盐酸(6M)调节pH = 2后乙醚萃取3次，取乙醚层于分液漏斗2。再用0.6mol/LNa0H溶液洗涤分液漏斗2中的萃取物3次，取碱液层于分液漏斗3。最后再用盐酸(6M)调节分液漏斗3中的样品至pH = 1.6，乙醚萃取3次，取乙醚层于安培瓶中，吹干乙醚，获得脂肽提取物。向提取出的脂肽提取物中加入0.5mL6M HC1，100°C水解22h。反应完毕后，水解液全部转移至气质小瓶，完全干燥后，参照文献(Quantitative Analyses of the Isoforms of Surfactin Produced by Bacillussubtilis HS0121Using GC-MS)提供的方法进行硅烷化反应。所得硅烷化产物采用Agilent的气相色谱-质谱联用仪^890GC，5975MSD)进行检测。得到氨基酸(亮氨酸)峰面积为
0.024 (单位:X IO6 μ V.S)，由亮氨酸峰面积(y，单位:X IO6 μ V.S)与脂肽含量(X，单位:g/L)关系标准工作曲线y = 3.2043X+0.0045，计算可得分析样品中脂肽含量为:0.0061g/L (6.1 ppm) ο[0031]实施例4
[0032]复杂体系样品:微量脂肽、石油磺酸盐、聚合物、无机盐离子、杂质
[0033]取IOOmL复杂体系样品于分液漏斗I,用盐酸(6M)调节pH = 2后乙醚萃取3次，取乙醚层于分液漏斗2。再用0.8mol/L NaOH溶液洗涤分液漏斗2中的萃取物3次，取碱液层于分液漏斗3。最后再用盐酸(6M)调节分液漏斗3中的样品至pH =2，乙醚萃取3次，取乙醚层于安培瓶中，吹干乙醚，获得脂肽提取物。向提取出的脂肽提取物中加入
0.5mL6M HC1，110°C水解20h。反应完毕后，水解液全部转移至气质小瓶，完全干燥后，参照文献(Quantitative Analyses of the Isoforms of Surfactin Produced by Bacillussubtilis HS0121Using GC-MS)提供的方法进行硅烷化反应。所得硅烷化产物采用Agilent的气相色谱-质谱联用仪^890GC，5975MSD)进行检测。得到氨基酸(亮氨酸)峰面积为
0.232 (单位:X IO6 μ V.S)，由亮氨酸峰面积(y，单位:X IO6 μ V.S)与脂肽含量(X，单位:g/L)关系标准工作曲线y = 3.2043X+0.0045，计算可得分析样品中脂肽含量为:0.071g/L(71ppm)。`
【权利要求】
1.一种脂肽检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: a)将待检测样品溶液pH调为I?2，然后用乙醚萃取，萃取物用NaOH溶液洗涤溶解，调节所得溶解液的PH调为I?2，用乙醚二次萃取，得到待检样品中的脂肽提取物； b)将脂肽提取物水解得到氨基酸，氨基酸进行硅烷化反应，反应产物用GC/MS检测，色谱图积分得到氨基酸(亮氨酸)峰面积； c)依据氨基酸(亮氨酸)计算脂肽含量。
2.根据权利要求1所述的一种脂肽检测方法，其特征在于，步骤a)所述的NaOH溶液的浓度为 0.2mol/L ?0.8mol/L。
3.根据权利要求1所述的一种脂肽检测方法，其特征在于，步骤a)所述的pH调为I?2所用的试剂为6M HCl。
4.根据权利要求1所述的一种脂肽检测方法，其特征在于，步骤b)所述的脂肽提取物水解所用试剂为6M HCl，水解温度为90?110°C，时间为20?24h。
5.根据权利要求1所述的一种脂肽检测方法，其特征在于，步骤c)所述的依据氨基酸(亮氨酸)计算脂肽含量为依据GC/MS检测到的氨基酸硅烷化反应产物的峰面积与脂肽浓度关系曲线计算脂肽含量。
【文档编号】G01N30/02GK103743841SQ201410020272
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年1月16日 优先权日:2014年1月16日
【发明者】牟伯中, 杨世忠, 刘金峰, 刚洪泽, 朱原意 申请人:华东理工大学