一种产多种脂肽类抗生物质的甲基营养型芽孢杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及微生物发酵及生物防治技术领域，具体设及一种产多种脂肤类抗生物 质的甲基营养型芽抱杆菌B肥1及其应用。
【背景技术】
[0002] 随着化学农药和传统抗生素的大量使用，食品安全和环境问题越发突出，生物防 治在农业生产中的应用逐渐受到重视。近年来，微生物来源的脂肤被用于抗真菌病方面的 研究有了很大的进展，相对于化学农药和传统抗生物质而言，脂肤类具有对动植物无害、可 生物降解W及不易使病原微生物产生，其中枯草芽抱杆菌(Bacillus.subtilis)、地衣芽抱 杆菌(B. Iicheniformis) W及蜡状芽抱杆菌(B.cereus)是产脂肤的主要菌种，产生的脂肤 类抗生素主要有表面活性素 （Surfact in)、伊枯草菌素 （Itur in)和丰原素(Fengycin)S大 类。
[0003] 不同类型的脂肤类抗生物质往往具有不同的生物活性。Iturins和fengycins 对真菌具有较强的括抗能力；SUrfactins主要对细菌、病毒和支原体有抑制作用，对真菌没 有太大的抑制作用，但其能够增强Iturins或fengycins对真菌的医治效果，还能在植物 根部形成一层生物膜保护植物根部免受病原菌的入侵。
[0004] 不同的菌种产生的脂肤类物质不同，曹云（SQR9微生物有机肥防治黄瓜±传枯萎 病的效应与机制研究，南京农业大学，2011)发现SQR9菌株含有Bacil Iomycin和化ngcin两 种脂肤类抗生素，Ye等（Identification of antifungal substance (Iturin A2) produced by Bscillus subtiI is B47 曰nd its effect on Southern Corn Lesf BlightJournal of Integrative Agriculture,2012,11(1):90-99.)鉴定枯草芽抱杆菌 B47发酵液的主要成分为Iturin。
[0005] 目前关于甲基营养型芽抱杆菌产脂肤类物质的研究较少，中国专利 ZL20 1 3 10466625 . 2公开了一种产脂肤类抗生物质的甲基营养型芽抱杆菌B . methylotrophicus 9912,其产生的脂肤化合物为6-Abu C16fengycin、anteis〇-ClSsurfactin和anteiso-ClSsurfactin methyl ester，良P仅包含Surfactin和Fengcin两 种类型的脂肤，对黄瓜灰霉病及苹果腐烂病等有防治效果。
【发明内容】
[0006] 基于W上技术现状，本发明的目的是提供一株新的甲基营养型芽抱杆菌BH-21，并 提供其应用，该菌株能产生多种脂肤类物质，对番茄灰霉病具有显著的防治效果。
[0007] 本发明采用的技术方案如下： 一种产多种脂肤类抗生物质的甲基营养型芽抱杆菌Baci Ilusmethy IotrophiCUS BH21，该甲基营养型芽抱杆菌于2015年12月09日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中屯、进行了保藏，保藏号为CGMCC No. 11840，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。
[000引该甲基营养型芽抱杆菌BH21的16sRNA序列在Genebank的登录号为KT889363,其 gy巧基因序列在Genebank的登录号为KT889364。
[0009] 该甲基营养型芽抱杆菌BH21含有产生脂肤类抗生物质的基因，包括ituA、ituB、 ;UuC、ituD，fenD，srfAB 和yndj 基因。
[0010] 该甲基营养型芽抱杆菌BH21产生Iturin类、Fengycin类、Sufactin类和化dj类脂 肤类抗生物质。
[0011] 本发明还提供了所述的甲基营养型芽抱杆菌B肥1在防治番茄灰霉病中的应用。
[0012] 具体地，将所述甲基营养型芽抱杆菌BH21的发酵液用于生物防治，所述发酵液由 W下步骤制得:按体积比3%的接种量将培养好的种子液接种到大量发酵培养基中，180 r/ min，32°C培养72h，得到发酵液，即可用于生物防治。
[0013] 所述种子液通过下述方法获得:将保存的甲基营养型芽抱杆菌BH21划线转接到 ZoBell's 2216E培养基平板中，置于培养箱28°C恒溫培养2天;将获得的甲基营养型芽抱杆 菌BH21的菌苔接种到PB液体培养基中，28°C摇床振荡培养1她得到种子液。
[0014] 所述的大量发酵培养基中包含:薦糖20 g，NH4N〇3 2 g，K出P〇4 3 g，化抽K)4 10邑， MgS〇4.7H2〇 0.2 g，酵母粉 0.2 g，CaCl2 0.7 yg，MnS〇4*4出0 I yg，蒸馈水 1000 血，pH 7.0~7.2。
[0015] 本发明菌株能产生多种脂肤类抗生物质，具有显著的防治番茄灰霉病的效果，防 效可高达95%W上。
【附图说明】
[0016] 图1是PDA平板上B肥1对番茄灰霉病菌的括抗作用； 图2是甲基营养型芽抱杆菌B肥1菌落形态； 图3是甲基营养型芽抱杆菌B肥1菌体形态； 图4是基于ieSrDNA序列的册21系统发育树； 图5是基于gy巧基因序列的册21系统发育树； 图6是册21中脂肤类抗生物质的分子鉴定； 图7甲基营养型芽抱杆菌册21发酵液的HPlX指纹图谱。
【具体实施方式】
[0017] 实施例1甲基营养型芽抱杆菌B肥1的筛选 从采自中国勸海的海水和海泥中分离细菌，分离培养基(ZoBel 1' S 2216E)为:蛋白腺 5邑，酵母膏Ig，憐酸高铁0.Olg,琼脂16g，陈海水1000 mL,pH值7.6-7.8。从分离平板 上挑取菌落形态不同的菌株，分别与番茄灰霉病菌做平板对時实验，将能出现抑菌圈的菌 株定为有括抗作用，共筛选出41株有括抗作用的细菌，依次编号为BH1-BH41。采用平板对時 法进行复筛并记录抑菌圈直径，其中册21抑菌带达到15mm(图1)，对灰霉病菌的括抗作用显 著。
[0018] 实施例2括抗菌株B肥1的菌落形态及生理生化鉴定 根据《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》中记载的实验内容和实验方 法，对筛选的保藏号为CGMCCNo . 11840的菌株进行菌种鉴定。
[0019] 菌落形态观察在ZoBell's 2216E细菌培养基上划线，于恒溫培养箱中28±2°C培 养3天，观察菌落形态。保藏号为CGMCCNo. 11840的菌株的菌落呈凸起、乳白色、边缘缺刻状 (图2)。挑取培养3天的菌落进行革兰氏染色后，在光学显微镜的100倍油镜下观察，保藏号 为CGMCC No. 11840的菌株的菌体长杆状、中生芽抱、革兰氏染色阳性(图3)。
[0020] 耐盐试验：向培养基中分别加入化Cl,使含盐量为2.5%、5%、7.5%，。甲基营养型芽 抱杆菌B肥1在含NaC12.5%、5%、7.5%的培养基中生长良好，在含NaCl 10%，12.5%的培养基中 生长缓慢，7天后长出菌苔。
[0021] 耐甲醇试验：向培养基中分别加入甲醇溶液，使甲醇含量为5%、10%、。培养3天甲基 营养型芽抱杆菌BH21在甲醇含量为5%、10%的培养基生长良好，在15%、20%、25%的培养基生 长缓慢;7天后，全部长出菌苔。
[0022] 初步鉴定该菌株为芽抱杆菌。
[0023] 实施例3 B肥1菌株的16S rDNA鉴定 1 6 S rDNA的扩增和测序采用菌体PCR的方法，PCR的扩增引物为2 7F : 5 / -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和 1492R 5'-TACGGCTACC TTGTTACGACTT-3' JCR反应条件：95 °C预变性5 min;94 °C变性 1 min，55 °C退火 1 min，72 °C延伸 1 min，30 个循环;72 °C延 伸10 min。
[0024] 扩增产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，将扩增产物条带正确的PCR产物交由 上海立菲生物技术有限公司纯化测序。测序结果显示，保藏号为CGMCCNo. 11840的菌株具有 1450bp。
[00巧]通过NCBI提供的GenBank的BLAST 化ttp: //blast. ncbi . nlm. nih. gov/Blast. Cgi 进行在线比对发育相似度。序列对齐采用化USTAL.W，系统发育树（图4)的构建采用MEGA6.0 程序，计算方'法为nei 邑 hbour-jo inin 邑和maximum-par simony ,bootstrap values 是 1000 次。经分析显示，保藏号为CGMCCNo. 11840的菌株属于甲基营养型芽抱杆菌。
[0026] 实施例4 B肥1菌株的gy巧鉴定 g y r B的扩增采用菌体P C R的方法，P C R的扩增引物为U P 1 5 '-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYG CNGGNGGNAARTTYGA-3^ 和 UP2r 5'-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNG C RTCNGTC AT-3\gy巧基因的PCR 反应条件：94 °C预变性5 min，94°C变性 1 min，58°C退火 1 min，72°C延伸 1 111111，35个循环，72°(：延伸 10min〇
[0027] 扩增产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，将扩增产物条带正确的PCR产物交由 上海立菲生物技术有限公司纯化测序。测序结果显示，保藏号为CGMCCNo. 11840的菌株具有 1162bp〇
[00巧]通过NCBI提供的GenBank的BLAST 化ttp: //blast. ncbi . nlm. nih. gov/Blast. Cgi 进行在线比对发育相似度。序列对齐采用化USTAL.W，系统发育树(图5)的构建采用MEGA6.0 程序，计算方'法为nei 邑 hbour-jo inin 邑和maximum-par simony ,bootstrap values 是 1000 次。经分析显示，保藏号为CGMCCNo. 11840的菌株属于甲基营养型芽抱杆菌。
[00巧]实施例5菌株B肥1的培养 (I)B肥1的种子培养基和培养条件 培养基:膜蛋白腺10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，蒸馈水1000血，pH 7.0。
[0030