甲基营养型芽孢杆菌株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物的开发和应用领域，具体地说涉及一种甲基营养型芽孢杆菌株 及其应用。
【背景技术】
[0002] 随着农业生产集约化、可持续发展的要求，作物病虫害已经成为制约现代农业可 持续发展的瓶颈。尤其是土传病害中的枯萎病、黄萎病、根腐病、菌核病、青枯病等，它们通 过土壤传播，引起作物根部及全株发病，给农业生产造成严重损失。而现在大量使用的化学 农药造成了土壤、水资源污染，严重威胁着人们的健康，抗病品种的选育周期又很长，由于 以上传统方法的局限性，使得寻找一种环境友好、安全无毒无污染的生物防治新途径显得 迫切重要，而分离筛选高效拮抗菌株是进行生物防治研究的基础。
[0003] 国内外的学者已经分离筛选到了许多拮抗菌株并进行了相关研究，哈茨木霉 (Trichodermahar-zianum)、粘帚霉（Gliocladium)、青霉菌（Penicillium)、毛壳菌 (Chaetomium)等属的真菌均已被开发为真菌杀菌制剂用于多种植物病害的防治。郝晓娟 等证实铜绿假单胞菌对香蕉、番茄、西瓜、甜瓜枯萎病菌、番茄灰霉病菌、油菜菌核病菌等 均有良好的离体诘抗效果。王刚等和KazempourM.N.运用焚光假单胞菌Pseudomonas fluorescens防治黄瓜和水稻立枯病也取得了很好的效果。ZhengY.等筛选到了能够诘抗 棉花黄萎病的高效菌株镜刀菌FusariumoxysporumstrainByl25，Nectriahaematococca Bx247 和拟莖点霉属Phomopsissp.By231。
[0004] 在众多的生防拮抗菌株中细菌类的芽孢杆菌属是土壤优势微生物种群之一，由 于能够产生芽孢，有着很强的抗逆能力和抗菌防病作用。它广泛分布于不同的环境中， 除在土壤和植物表面存在外，还能在植物体内定殖。目前发现的有应用价值的芽孢杆菌 主要有扭脱芽孢杆菌（B.extorquens)、胶质芽孢杆菌（B.mucilgiosns)、环状芽孢杆菌 (B.circulans)、巨大芽抱杆菌（B.megaterium)、侧抱芽抱杆菌（B.laterosporus)等。但这 些芽孢杆菌的功能大都比较单一，分离筛选对多种植物病原菌具有拮抗作用的的高效菌株 是目前研究的热点和关键问题。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种对多种植物病原菌具有良好拮抗作用的 甲基营养型芽孢杆菌株。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种从宣城地区杨柳地土壤中筛选出的甲基 营养型芽孢杆菌株，该菌株的保藏号为：CGMCCNo. 10779,保藏日期为2015年5月4日，中 文名（拉丁文学名）为甲基营养型芽孢杆菌（Bacillusmethylotrophicus)，保藏单位为中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中 国科学院微生物研究所。
[0007] 保藏号是CGMCCNo. 10779的甲基营养型芽孢杆菌株的形态特征为：该菌株为革 兰氏阳性菌，形状为杆状，鞭毛特征明显，单菌落为圆形，污白色、不透明、中央隆起、边缘整 齐，后期有褶皱。
[0008] 本发明还提供保藏号是CGMCCNo. 10779的甲基营养型芽孢杆菌株在拮抗植物病 原菌中的应用，尤其是在拮抗麦冬炭疽病病原菌中的应用。
[0009] 本发明还提供防治植物病害的生物菌剂，它含有保藏号是CGMCCNo. 10779的甲基 营养型芽孢杆菌株。
[0010] 本发明还提供防治植物病害的杀菌制剂，它为保藏号是CGMCCNo. 10779的甲基营 养型芽孢杆菌株的发酵液或发酵液的上清液。
[0011] 本发明还提供所述的防治植物病害的杀菌制剂的制备方法，包括以下步骤：将保 藏号为CGMCCNo. 10779的甲基营养型芽孢杆菌株接种于牛肉膏蛋白胨培养基，在160~ 240rpm、3(TC的条件下，进行恒温发酵培养，培养所得的发酵液或发酵液的上清液即为所述 防治植物病害的杀菌制剂。
[0012] 本发明有益效果体现在：
[0013] 1.本发明甲基营养型芽孢杆菌株CGMCCNo. 10779对多种植物病原菌，如西瓜枯 萎病、棉花枯萎病、玉米小斑病病原菌具有拮抗作用，尤其是对麦冬炭疽病病原菌具有非常 高效的拮抗作用，是一种防治植物病害效果高、环境友好、生物防治大的拮抗菌株，具有良 好的开发应用前景。
[0014] 2?本发明甲基营养型芽孢杆菌株CGMCCNo. 10779的耐盐能力强，在氯化钠含量 达9 %的培养基上依然能够生长，抗逆能力强，可适用于环境较为恶劣的土地，潜在应用价 值高。
[0015] 3.本发明甲基营养型芽孢杆菌株CGMCCNo. 10779应用方便，其菌株体和发酵液 均可用于防治植物病害。
[0016] 4.本发明甲基营养型芽孢杆菌株CGMCCNo. 10779能够产生芽孢，增加了耐热等 抵抗恶劣环境的能力，使用范围更广，降低了对该菌剂储存运输环境的要求，使用更加方 便。
[0017] 5.本发明甲基营养型芽孢杆菌株CGMCCNo. 10779的菌体细胞、菌液、发酵上清液 均有拮抗功效，使用范围广。
【附图说明】
[0018] 图1是菌株N5的扫描电镜观察形态图。
[0019] 图2是菌株N5的菌落形态图。
[0020] 图3是依据16SrDNA序列构建的菌株N5同属相关种的系统发育树图。
[0021] 图4是甲基营养型芽孢杆菌株CGMCCNo. 10779对黑线炭疽菌、胶胞炭疽菌、西瓜 枯萎病菌、棉花枯萎病菌、玉米小斑病菌生长的影响。
[0022] 图5是甲基营养型芽孢杆菌株CGMCCNo. 10779的发酵液上清对西瓜枯萎病病原 菌生长的影响。
[0023] 图6是甲基营养型芽孢杆菌株CGMCCNo.10779对黑线炭疽菌菌丝的影响。
[0024] 图7是甲基营养型芽孢杆菌株CGMCCNo.10779对西瓜枯萎病病原菌菌丝的影响。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合实施例对本发明作进一步描述：
[0026] 实施例1
[0027] 甲基营养型芽孢杆菌株CGMCCNo. 10779的筛选及鉴定，包括以下步骤：
[0028] (1)病原菌的活化
[0029] 接种针以无菌操作勾取少量待活化黑线炭疽菌的菌丝与培养基接种到PDA平板 的中央，分别接种3块，在26°C的条件下进行恒温培养，制备孢子悬液；
[0030] (2)样品采集与土壤悬液的制备
[0031] 从宣城地区杨柳地土壤中采集细菌样品，采集土样时，先去除表土，取5~20cm处 深的土样；利用稀释法进行分离，称取10.0g土样倒入含有100ml无菌水的三角瓶中摇匀， 然后放入80°C的水浴锅中加热中（每隔3min摇匀一次），20min后放入冷水中降温，依次梯 度稀释，制得土壤悬液；
[0032] (3)涂平板
[0033] 吸取50y1黑线炭疽菌的孢子悬液与50y1土壤悬液同时涂布于PDA培养基上， 在28°C的条件下进行恒温培养；
[0034] 挑选具有抑菌圈的菌株划线分离纯化，分离出的菌株以菌株N5作为暂时命名。
[0035] (4)菌株N5的鉴定
[0036] <4A>形态学鉴定：革兰氏染色及菌落形态观察
[0037] 取培养24h的菌株N5单菌落，涂于载玻片上进行革兰氏染色并用显微镜下观察； 取培养14h的菌株N5的菌液lml，3000rpm离心收集菌株N5菌体，经pH7. 0的磷酸缓冲液 (PBS)漂洗 3 次，4%戊二醛固定过夜、0?lmol/LPBS漂洗 3 次，用 30%、50%、70%、95%、 100 %梯度乙醇脱水、丙酮置换后二氧化碳临界点干燥喷金后扫描电镜观察菌株N5菌体 的形态特征，鉴定方法参阅东秀珠等人编著的《常见细菌鉴定收藏》（北京：科学出版社， 2001 :349-398)。测定结果见图1和图2,从图1和图2可以看出：
[0038] 菌株N5为杆状细菌，有鞭毛，为革兰氏阳性菌，但菌落为圆形、污白色、不透明，不 易挑起，菌落直径2-3mm、中央隆起，边缘整齐、表面后期有褶皱。
[0039] <4B>生理生化特性鉴定：
[0040] 生理生化特征的测定方法参阅《植物病研究方法》（北京：农业出版社，1977 : 161-224)
[0041] 测定结果如下：
[0042] 菌株N5最适培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，最适生长30°C，适宜生长pH为5~ 10;在含有9%的氯化钠固体培养基上生长良好；可以利用葡萄糖、蔗糖、淀粉、甘露醇、麦 芽糖、乳糖、果糖、鼠李糖、木糖作为碳源，不能利用半乳糖作为碳源；菌株N5过氧化氢试验 为阳性反应；可以使明胶液化；甲基红试验呈阳性反应；VP试验为阴性反应。
[0043] 其中，所述最适牛肉膏蛋白胨培养基配方为：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，调 pH值至7. 2,定容至1000ml。
[0044] 进一步对菌株N5的其它生理生物化学反应进行检测，其生物学特性如表1所示。
[0045] 表 1
[0046]
[0047] 注：" I"表示生长缓慢，" II"代表生长一般，" III"代表生长旺盛，" + "代表阳性反 应，代表阴性反应。
[0048] 〈40分子生物学鉴定
[0049] 采用SDS蛋白酶K法提取细菌基因组DNA，PCR引物采用细菌16SrDNA通用引物， 27F(5 ' -AGAGTITGATCCTGGCTCAG) ; 1492R(5 ' -TACGGCTACCTTGTTAGGACTT)。PCR反应体系： lOXTaqDNA聚合酶buffer2.5yl，25mM氯化镁溶液 1.5yl，引物 27F和 1492R(10mM)各 0.5yl，2.5mMdNTP2yl，5U/ylTaq酶 0? 15yl，模板DNA0.5yl，补水至 25yl;PCR扩 增条件：94°C预变性5min，94°C变性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸lmin，30个循环；然后 72°C延伸lOmin。将扩增后的产物进行琼脂糖凝胶电泳实验。将进行PCR扩增后的基因组 送至生工进行测序，测试的菌株N5 16SrDNA序列（1411bp)如下：
[0051] 将测序结果用bioedit去除载体序列后，登陆eztaxon-e.ezbiocloud网站， 进行序列相似性分析；所有序列先用Clustal软件比对分析，MEGA4. 0软件分析生成 系统发育树，结果见图3,结果显示菌株N5与数据库中Bacillusmethylotrophicus CBMB205T(EU194897)相似性为 100 %，菌株N5 与Bacillusmethylotrophicus CBMB205T(EU194897)聚为一支，结合菌株N5的菌落形态特征、生理生化特征、同源性和系统 发育分析，菌株N5被鉴定为甲基营养型芽孢杆菌株（Bacillusmethylotrophicus)。
[0052] 实施例2
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