一种甲基营养型芽孢杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物病害生物防治技术领域，特别是涉及一种甲基营养型芽孢杆菌及 其应用。
【背景技术】
[0002] 油菜是我国重要的油料作物之一，其种植面积和产量均位居世界第一。由核盘菌， 即Sclerotinia sclerotiorum，侵染引起的油菜菌核病是一种重要病害，居我国油菜三大 病害之首，在五大洲近一百多个国家都有发生和流行。近年来，随着油菜免耕直播栽培技术 的推广，油菜菌核病的发生呈逐年上升趋势，长江流域地带年平均发病率上升到15-30%。 油菜菌核病的发生会严重影响油菜的产量和品质，造成重大的经济损失，一般年份发病率 为10% -40%之间，严重年份可高达80%，严重威胁我国油菜的生产。
[0003]目前，关于油菜菌核病的防治尚无免疫的油菜品种，虽然农业防治，如，轮作、降低 田间湿度，一定程度上可以降低该病害的发生，但通常受到地理结构或种植模式的限制，难 以大面积推广。化学防治虽然能迅速有效抑制病原菌丝生长及孢子萌发，但长期大量使用 化学药剂，不仅容易使病原菌产生抗药性，而且造成生态环境污染及油菜籽的农药残留问 题。生物防治对人类和环境友好，是防治油菜菌核病较为理想的一种防治方法，近年来逐渐 受到科研工作者的亲睐。因此，寻找防治油菜菌核病的拮抗微生物具有重要意义。
[0004] 利用生防菌株防治植物病害在国内外均有报道，至今美国已有4种芽孢杆菌制 备的生防菌剂获得了生产许可证；经检索，申请者在现有的专利和非专利文献中检索到一 些关于甲基营养型芽孢杆菌的文献报道和专利。例如，专利申请号为2014106017754公 开了"甲基营养型芽孢杆菌及其在防治禾谷镰刀菌方面的应用"，利用甲基营养型芽孢杆 菌防治禾谷镰刀菌侵染引起的病害。专利申请号为2014104032209公开了 "一种甲基营 养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus)三炬-04及其应用"，利用甲基营养型芽孢 杆菌三炬-04防治辣椒青枯病、柑橘炭疽病，均具有较为稳定的防治效果。专利申请号为 201210498378X公开了 "一株人参病害生物防治菌株的获得及应用"，利用甲基营养型芽孢 杆菌NJ13的发酵菌液及其滤液防治人参灰霉病、黑斑病等常见7种病害，均具有良好的防 治效果。专利申请号为2012102472347公开了"一种防控香蕉枯萎病的甲基营养型芽孢杆 菌菌株4-L-16及其应用"，利用甲基营养型芽孢杆菌4-L-16制备防控香蕉枯萎病的微生物 菌剂。但目前并没有对油菜菌核病菌有抑制效果的甲基营养型芽孢杆菌的报道。
【发明内容】
[0005] 为改进现有防治技术的不足，本发明的目的在于提供一种甲基营养型芽孢杆菌及 其应用，该甲基营养型芽孢杆菌对油菜菌核病菌、水稻纹枯病菌、核桃根腐病菌、西瓜枯萎 病菌等多种病原菌具有显著的拮抗作用。
[0006] 本发明第一方面提供了一种甲基营养型芽孢杆菌，其于2015年5月15日保藏于 武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2015297,命名为甲基营养型芽孢杆 菌（Bacillus methylotrophicus)XK_4〇
[0007] 甲基营养型芽孢杆菌XK-4的菌学特性：
[0008] a、形态特征：ΧΚ-4为革兰氏阳性菌，呈杆状，芽孢椭圆，在LB平板上形成的菌落成 圆形，乳白色，表面粗糙，边缘呈锯齿状，隆起，湿润，有光泽。
[0009] b、生理生化特征：水解淀粉，周生鞭毛，氧化酶阴性，接触酶阳性。
[0010] 对甲基营养型芽孢杆菌XK-4的16S rDNA序列进行检测与Genbank上已报道序列 进行比对，最终确定菌株)(K-4为甲基营养型芽孢杆菌。
[0011] 本发明第二方面提供了甲基营养型芽孢杆菌)(Κ-4在抑制油菜菌核病菌、水稻纹 枯病菌、核桃根腐病菌、西瓜枯萎病菌中的应用。
[0012] 本发明第三方面提供了甲基营养型芽孢杆菌ΧΚ-4的筛选方法，具体步骤包括：
[0013] (1)将油菜菌核病的菌核培养后用无菌水配制为悬浮液，涂平板后培养，选取单菌 落；
[0014] (2)用平板对峙法从步骤（1)选取的单菌落中筛选出对油菜菌核病菌有抑菌作用 的菌株。
[0015] 本发明第四方面提供了一种甲基营养型芽孢杆菌)(Κ-4菌剂，所述菌剂为甲基营 养型芽孢杆菌Hi-4经活化、种子培养、发酵后得到的菌剂。
[0016] 本发明的有益效果是：
[0017] (1)本发明提供的甲基营养型芽孢杆菌ΧΚ-4是一株油菜根际微生物，对人、畜、农 作物安全，对环境友好。
[0018] (2)本发明提供的甲基营养型芽孢杆菌)(Κ-4具有较广的抑菌谱，对常见的病原 菌，如油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum)、水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani)、 西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum)、核桃根腐病菌（Fusarium solani)等，均具有较好的 抑制效果，抑制率分别达到83. 8%、78. 6%、79. 2%、73. 9%，对油菜菌核病菌菌丝生长具有 明显抑制作用，造成菌丝溶解，断裂，生长点膨大等畸形。
[0019] (3)本发明提供的甲基营养型芽孢杆菌)(K-4制备成的菌剂对油菜菌核病具有显 著的防治效果，生产周期短，成本低，使用简单，在植物病害的生物防治中具有十分广阔的 应用前景。
【附图说明】
[0020] 图1为甲基营养型芽孢杆菌ΧΚ-4在LB固体培养基上生长的菌落形态；
[0021] 图2为甲基营养型芽孢杆菌)(Κ-4对油菜菌核病菌的拮抗作用示意图；
[0022] 图3为甲基营养型芽孢杆菌)(Κ-4对水稻纹枯病菌的拮抗作用示意图；
[0023] 图4为甲基营养型芽孢杆菌ΧΚ-4对西瓜枯萎病菌的拮抗作用示意图；
[0024] 图5为甲基营养型芽孢杆菌)(Κ-4对核桃根腐病菌的拮抗作用示意图；
[0025] 图6为甲基营养型芽孢杆菌ΧΚ-4对油菜菌核病菌菌丝生长的致畸作用示意图，其 中，A为未经甲基营养型芽孢杆菌ΧΚ-4处理的对照组，B为经甲基营养型芽孢杆菌ΧΚ-4处 理的实验组。
【具体实施方式】
[0026] 本发明第一方面提供了一种甲基营养型芽孢杆菌，其于2015年5月15日保藏于 武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2015297,命名为甲基营养型芽孢杆 菌（Bacillus methylotrophicus)XK_4〇
[0027] 本发明第二方面提供了甲基营养型芽孢杆菌)(K-4在抑制油菜菌核病菌、水稻纹 枯病菌、核桃根腐病菌、西瓜枯萎病菌中的应用。
[0028] 本发明第三方面提供了甲基营养型芽孢杆菌ΧΚ-4的筛选方法，具体步骤包括：
[0029] (1)将油菜菌核病的菌核培养后用无菌水配制为悬浮液，涂平板后培养，选取单菌 落；
[0030] (2)用平板对峙法从步骤（1)选取的单菌落中筛选出对油菜菌核病菌有抑菌作用 的菌株。
[0031] 优选的，步骤（1)所述菌核培养为灭菌后于28-30°C下振荡培养40-50h，加无菌水 配制为悬浮液后涂布于LB平板，28-30°C下培养23-26h，挑取单菌落；步骤（2)所述平板对 峙法具体步骤为：将油菜菌核病菌接种在PDA平板中心，将步骤（1)所得单菌落呈三角状对 称接入PDA平板，距离中心l-3cm，26°C下培养，得到有抑菌作用菌株，转入LB平板上培养保 存。
[0032] 本发明第四方面提供了一种甲基营养型芽孢杆菌)(K-4菌剂，所述菌剂为甲基营 养型芽孢杆菌Hi-4经活化、种子培养、发酵后得到的菌剂。
[0033] 优选的，所述活化为将甲基营养型芽孢杆菌ΧΚ-4接种于培养基中，于28-30°C下 培养 20-24h。
[0034] 更加优选的，所述培养基为LB固体培养基，其配置方法为酵母提取物5g，胰化蛋 白胨l〇g，氯化钠 l〇g，琼脂粉20g，用NaOH调pH至7. 0-7. 2,于121°C下高压灭菌20min。
[0035] 优选的，所述种子培养为将经活化后的甲基营养型芽孢杆菌)(K-4接种于培养基 中，于 28-30°C、155-165r/min 下振荡培养 20-24h。
[0036] 优选的，所述发酵为将经种子培养后的甲基营养型芽孢杆菌ΧΚ-4以5%的接种比 例接种于培养基中，于28-30°C、135-145r/min下振荡培养40-44h。
[0037] 更加优选的，所述培养基为LB液体培养基，其配置方法为酵母提取物5g，胰化蛋 白胨10g，氯化钠10g，用NaOH调pH至7. 0-7. 2,于121°C下高压灭菌20min。
[0038] 优选的，所述甲基营养型