发病面积占叶片表面积的31% -50% ;
[0074] 4级：高度发病，发病面积占叶片表面积的50% -70% ;
[0075] 5级：高度发病，发病面积占叶片表面积的70%以上；
[0076] 病情指数=[Σ (各级病叶数X相应病级数V(调查总叶数X最高级数 值）]X100
[0077] 相对防治效果=[(对照病情指数一处理对照病情指数）/对照病情指数]X100%
[0078] 甲基营养型芽孢杆菌)(K-4对油菜菌核病的室内盆栽防治试验结果见表3,对照的 发病率为81. 4,病情指数为66. 0, ΧΚ-4菌剂处理的油菜发病率为23. 1，病情指数为12. 0， 其相对防治效果达81. 8%。
[0079] 表3 :甲基营养型芽孢杆菌)(Κ-4对油菜菌核病的室内防治效果
[0080]
[0081] (3)甲基营养型芽孢杆菌XK-4防治油菜菌核病的大田试验
[0082] 将所制备的ΧΚ-4菌剂用保藏液，即(λ 25% Tween20,配成稀释液L 0 X 10scfu/mL， 0D6。。= 0. 82-0. 84,用于油菜菌核病的大田防治试验。
[0083] 试验安排在油菜连作田块，试验区常年菌核病发病率在30-50%，并随着连作年限 增加发病率呈上升趋势。油菜品种为中双10号，该品种为公开推广的油菜品种。油菜田设 置小区，30m2/小区，在油菜始花期喷施上述)(K-4菌剂稀释液，直至油菜叶片表面有一层液 膜，每株油菜约喷雾25mL，设置清水对照处理，每处理3个小区重复，各小区随机分布。20d 后调查油菜菌核病的发病情况，采取5点取样，每点调查20株，记载总株数、病株数及每株 病级，病级参照以下标准，病情指数及相对防治效果计算同实施例5中所述。
[0084] 油菜菌核病分级标准：
[0085] 0级：无病；
[0086] 1级：轻微发病，发病面积占主茎表面积的5%以下；
[0087] 2级：轻度发病，发病面积占主茎表面积的6% -15% ;
[0088] 3级：中等发病，发病面积占主茎表面积的16% -30% ;
[0089] 4级：高度发病，发病面积占主茎表面积的31 % -50% ;
[0090] 5级：高度发病，发病面积占主茎表面积的50%以上；
[0091] 甲基营养型芽孢杆菌XK-4对油菜菌核病的大田防治试验结果见表4, XK-4菌剂处 理的油菜病情指数为17. 1，对照的病情指数为67. 9,其相对防治效果达74. 8%。
[0092] 表4 :甲基营养型芽孢杆菌XK-4对油菜菌核病的田间防治效果
[0094] 实施例2
[0095] 实施例2与实施例1基本相同，区别在于：
[0096] 本实施例按照以下主要步骤完成甲基营养型芽孢杆菌XK-4菌剂的制备：
[0097] (1)将所述的甲基营养型芽孢杆菌ΧΚ-4接种于LB固体培养基，于30°C下培养 22h，活化菌株；LB固体培养基配制：酵母提取物5g，胰化蛋白胨10g，氯化钠10g，琼脂粉 20g，NaOH 调 pH 至 7. 1，121°C、20min 高压灭菌。
[0098] (2)将步骤（1)活化的菌株接入LB液体培养基中，于30°C下155r/min振荡培养 22h，制成种子液；LB液体培养基配制：酵母提取物5g，胰化蛋白胨10g，氯化钠10g，NaOH调 pH 至 7. 1，121°C、20min 高压灭菌。
[0099] (3)将步骤（2)所获的种子发酵液按体积比5%接种于LB液体发酵培养基中，于 30°C下 140r/min 振荡培养 42h。
[0100] 按以上步骤即制得甲基营养型芽孢杆菌Hi-4菌剂，将所得甲基营养型芽孢杆菌 ΧΚ-4菌剂稀释至有效成分含量1.0 X 107cfu/mL后使用。
[0101] 实施例3
[0102] 实施例3与实施例1基本相同，区别在于：
[0103] 本实施例按照以下主要步骤完成甲基营养型芽孢杆菌)(K-4菌剂的制备：
[0104] (1)将所述的甲基营养型芽孢杆菌ΧΚ-4接种于LB固体培养基，于30°C下培养 24h，活化菌株；LB固体培养基配制：酵母提取物5g，胰化蛋白胨10g，氯化钠10g，琼脂粉 20g，NaOH 调 pH 至 7. 2,121°C、20min 高压灭菌。
[0105] (2)将步骤（1)活化的菌株接入LB液体培养基中，于30°C下165r/min振荡培养 24h，制成种子液；LB液体培养基配制：酵母提取物5g，胰化蛋白胨10g，氯化钠10g，NaOH调 pH 至 7. 2,121°C、20min 高压灭菌。
[0106] (3)将步骤（2)所获的种子发酵液按体积比5%接种于LB液体发酵培养基中，于 30°C下 140r/min 振荡培养 44h。
[0107] 按以上步骤即制得甲基营养型芽孢杆菌}(K-4菌剂，将所得甲基营养型芽孢杆菌 ΧΚ-4菌剂稀释至有效成分含量1.0 X 106cfu/mL后使用。
[0108] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和 原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种甲基营养型芽孢杆菌，其特征在于：其保藏号为CCTCC M 2015297,命名为甲基 营养型芽抱杆菌（Bacillus methylotrophicus))(K-4〇2. 权利要求1所述甲基营养型芽孢杆菌在抑制油菜菌核病菌、水稻纹枯病菌、核桃根 腐病菌、西瓜枯萎病菌中的应用。3. -种如权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌的筛选方法，其步骤包括： (1) 将油菜菌核病的菌核培养后用无菌水配制为悬浮液，涂平板后培养，选取单菌落； (2) 用平板对峙法从步骤（1)选取的单菌落中筛选出对油菜菌核病菌有抑菌作用的菌 株。4. 如权利要求3所述的甲基营养型芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于：步骤（1)所述 菌核培养为灭菌后于28-30°C下振荡培养40-50h，加无菌水配制为悬浮液后涂布于LB平 板，28-30°C下培养23-26h，挑取单菌落；步骤（2)所述平板对峙法具体步骤为：将油菜核盘 病菌丝块接种在PDA平板中心，将步骤（1)所得单菌落呈三角状对称接入PDA平板，距离中 心l-3cm，26°C下培养，得到有抑菌作用菌株，转入LB平板上培养保存。5. -种甲基营养型芽孢杆菌)(K-4菌剂，其特征在于：所述菌剂为甲基营养型芽孢杆菌 )(K-4经活化、种子培养、发酵后得到的菌剂。6. 如权利要求5所述的甲基营养型芽孢杆菌)(K-4菌剂，其特征在于：所述活化为将甲 基营养型芽孢杆菌XK-4接种于培养基中，于28-30°C下培养20-24h。7. 如权利要求5所述的甲基营养型芽孢杆菌)(K-4菌剂，其特征在于：所述种子培养为 将经活化后的甲基营养型芽孢杆菌XK-4接种于培养基中，于28-30°C、155-165r/min下振 荡培养20-24h。8. 如权利要求5所述的甲基营养型芽孢杆菌)(K-4菌剂，其特征在于：所述发酵为将经 种子培养后的甲基营养型芽孢杆菌XK-4以5%的接种比例接种于培养基中，于28-30°C、 135-145r/min 下振荡培养 40-44h。9. 如权利要求5至8任一项权利要求所述的甲基营养型芽孢杆菌)(K-4菌剂，其特征在 于：所述的甲基营养型芽孢杆菌XK-4菌剂稀释至有效成分含量1.0 X IO6-L OX Kfcfu/mL 后使用。
【专利摘要】本发明提供了一种甲基营养型芽孢杆菌，其保藏号为CCTCC？M2015297，命名为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus？methylotrophicus)XK-4，并进一步提供了甲基营养型芽孢杆菌XK-4的筛选方法及在抑制油菜菌核病菌、水稻纹枯病菌、核桃根腐病菌、西瓜枯萎病菌中的应用，以及一种甲基营养型芽孢杆菌XK-4菌剂。甲基营养型芽孢杆菌XK-4是一株油菜根际微生物，对人、畜、农作物安全，对环境友好，具有较广的抑菌谱，对常见的病原菌，如油菜菌核病菌、水稻纹枯病菌、核桃根腐病菌、西瓜枯萎病菌等菌丝生长均具有较好的抑制效果，对油菜菌核病菌菌丝生长具有明显抑制作用，造成菌丝畸形，进一步制备成的菌剂对油菜菌核病具有显著的防治效果，生产周期短，在植物病害的生物防治中具有十分广阔的应用前景。CCTCC M201529720150515
【IPC分类】A01N63/00, C12N1/20, A01P3/00, C12R1/07
【公开号】CN105018386
【申请号】CN201510462747
【发明人】孙正祥, 张长青, 马东方, 周京龙
【申请人】长江大学
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年7月31日