专利名称：用甲基营养菌生产l－氨基酸的方法
发明
背景技术：
领域本发明涉及一种用于生产氨基酸的微生物工程技术，更具体地说，是一种利用发酵生产L-赖氨酸或者L-精氨酸的方法。本发明还涉及用于该生产方法的微生物。
背景技术：
工业上利用短杆菌属(Brevibacterium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、埃希氏菌属(Escherichia)、链霉菌属(Streptomyces)、假单胞菌属(Pseudomonas)、节杆菌属(Arthrobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)、青霉菌属(Penicillium)、假丝酵母属(Candida)等微生物发酵生产L-氨基酸，比如L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-苏氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-苯丙氨酸。为了提高这些微生物的产率，通常使用天然分离的菌株或者这些菌株的人工突变体。此外，通过用重组DNA技术提高这些菌株L-氨基酸生物合成酶活性以增加L-氨基酸产量的各种技术已经公开。
通过培育如上面提到的微生物以及改进相关的生产方法，L-氨基酸的产量已经得到很大提高。然而，为了满足未来增加的需求量，发展以更低成本提供更高产量的方法显然仍十分必要，因此仍然需要发展相关技术。
甲醇是一种已知的发酵原材料，用低成本即可大量获得。用甲醇发酵生产L-氨基酸的方法是已知的，包括利用产碱菌属(Achromobacter)或者假单胞菌属(JP45-25273 A)，精朊杆菌属(Protaminobacter)(JP49-125590 B)，精朊杆菌属或者甲烷单胞菌属(Methanomonas)(JP50-25790 A)，屈曲杆菌属(Microcyclus)(JP52-18886 A)，甲基小杆菌属(methylobacillus)(JP4-91793A)，芽孢杆菌属(JP3-505284 A)等微生物进行的方法。本发明的发明人发展出了通过人工诱变和DNA重组技术培育嗜甲基菌属和甲基小杆菌属细菌生产L-氨基酸的方法(国际申请WO00/61723；JP2001-120269 A)。
近年来，已经鉴定出了一些能够将某种特定L-氨基酸分泌到细胞外或者微生物体外的蛋白质及其编码基因。特别是，Vrljic等已经鉴定了一个与棒杆菌属细菌分泌L-赖氨酸到细胞外有关的基因(Moleucular Microbiology 22815-826(1996))。该基因被命名为lysE，据报道通过增加细菌中这个基因的表达量可以提高棒杆菌属细菌生产L-赖基酸的能力(国际申请WO97/23597)。还已知增加大肠杆菌中氨基酸分泌蛋白的表达量可以提高几种氨基酸的产量(JP 2000-189180 A)。例如，据报道提高大肠杆菌中ORF306基因的表达量可以提高胱氨酸、半胱氨酸等的产量(EP885962 A)。
然而，至今为止，还未有报道明确表明，提高甲醇同化细菌(methanol-assimilating bacteria)发酵过程中L-氨基酸的分泌量可以增加L-氨基酸的产量。此外，有关甲醇同化细菌中表现分泌活性的氨基酸分泌基因尚无报道。
发明概述本发明的一个发明目的是提供一种利用丰富而且廉价易得的甲醇高效生产L-赖氨酸或者L-精氨酸的方法。
本发明的另一目的是提供一种编码棒状细菌中lysE蛋白突变体或者相关同源蛋白的DNA，其中当所述突变体或其同源蛋白被导入甲醇同化细菌时，会赋予该细菌产生L-赖氨酸类似物抗性的能力。
本发明的另一目的是提供一种如上所述的DNA，其中所述突变体是一种定义为下面(A)或者(B)的蛋白质(A)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白质，其中至少第56位的甘氨酸残基被其它氨基酸取代，或者(B)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白质，其中至少第56位的甘氨酸残基被其它氨基酸取代，并且除56位氨基酸残基以外有一个或者几个氨基酸残基被取代、缺失、插入或者添加，当所述突变体被导入甲醇同化细菌时，会对L-赖氨酸类似物产生抗性。
本发明还有一个发明目的是提供如上所述的DNA，其中所述DNA选自A)一种具有SEQ ID NO1核苷酸序列的DNA，其具有一个突变导致至少被编码蛋白质的第56位甘氨酸残基被其它氨基酸取代，或者B)一种在严格条件下能与SEQ ID NO1核苷酸序列杂交的DNA，或者由所述核苷酸序列制备的探针，当其被导入甲醇同化细菌时，会对L-赖氨酸类似物产生抗性。
本发明还有一个发明目的是提供如上所述的DNA，其中所述其它氨基酸残基是丝氨酸残基。
本发明还有一个发明目的是提供如上所述的DNA，其中所述L-赖基酸类似物是S-(2-氨乙基)半胱氨酸。
本发明还有一个发明目的是提供如上所述的DNA，其中所述甲醇同化细菌是属于嗜甲基菌属或甲基小杆菌属的细菌。
本发明还有一个发明目的是提供一种属于嗜甲基菌属或甲基小杆菌属的细菌，当上述DNA以可表达形式被导入该细菌时，该细菌能够生产L-赖氨酸或者L-精氨酸。
本发明还有一个发明目的是提供一种生产L-赖氨酸或者L-精氨酸的方法，包括如下步骤A)在培养基中培养上述的细菌，以在培养物中积累L-赖氨酸或者L-精氨酸，和B)从培养物中收集L-赖氨酸或者L-精氨酸。
本发明还有一个发明目的是提供如上所述的方法，其中培养基含有甲醇，作为主要碳源。
根据本发明，甲醇同化细菌的L-氨基酸产率，特别是L-赖氨酸和L-精氨酸的产率能够得到提高。
图1显示了有tac启动子的pRStac质粒图谱和将lysE基因插入pRStac质粒而构建的pRSlysE质粒图谱。
发明详述本发明的发明人通过辛勤的研究达到了本发明上述的发明目的。最初，他们发现当用甲醇同化细菌，特别是嗜甲基菌属和甲基小杆菌属的细菌生产L-氨基酸，尤其是L-赖氨酸或者L-精氨酸时，细胞不能向外分泌这些L-氨基酸。后来，发明人成功地获得了表现有氨基酸分泌活性的基因，尤其是在以上这些微生物中，因此发现利用这些获得的基因可有效生产氨基酸。
本发明的发明人将已知的来源于棒杆菌属细菌的lysE基因导入一种甲醇同化细菌，并检测它的氨基酸产率。发现将lysE基因导入甲醇同化细菌导致突变或者缺失，因而使lysE丧失功能。负责分泌的蛋白质通常需要进入细胞膜内以发挥功能，因此蛋白质和膜的条件，比如脂质的组分，必须相互适合。可以推断，表达异源膜蛋白比如lysE以便使它发挥功能是困难的，前述的结果可以支持这个结论。
因此，本发明的发明人在研究前述的L-氨基酸和分泌基因时，发现一个突变基因能够在甲醇同化细菌中发挥功能。此外，他们发现这个突变基因用于甲醇同化细菌生产氨基酸时有明显的效果。他们作了进一步研究，成功地获得了多个能在甲醇同化细菌中发挥功能的突变基因。
在下文中，本发明将作详细的解释。
本发明的DNA本发明的DNA编码来源于棒状细菌lysE蛋白的一种突变体或者同源蛋白，但当它被导入一种甲醇同化细菌时，能够表现lysE蛋白的功能。
这里所说的“lysE蛋白的功能”是指至少具有如下(1和/或2)定义的一种功能(1)当前述编码突变体的DNA被导入甲醇同化细菌时，表现出对L-赖氨酸类似物有抗性的功能。
这里所说的细菌“对有L-赖氨酸类似物有抗性”是指当上述编码lysE突变体的DNA被导入上述甲醇同化细菌时，与不含有该DNA的细菌例如野生型的甲醇同化细菌相比，这种细菌能够在更高浓度L-赖氨酸类似物存在的情况下生长。例如，在含有一定浓度L-赖氨酸类似物的琼脂培养基中培养一段时间后，导入了上述DNA的甲醇同化细菌的转化菌株能够形成菌落，而非转化菌株则不能形成菌落，上述转化菌株被赋予了对L-赖氨酸类似物的抗性。L-赖氨酸类似物的例子包括S-(2-氨乙基)半胱氨酸。
(2)当上述突变体被导入甲醇同化细菌时，具有提高L-赖氨酸或者L-精氨酸中一种或者两种的细胞外分泌量的功能。
这里所说的“提高L-赖氨酸或者L-精氨酸中一种或者两种的细胞外分泌量”是指当培养一种含有本发明DNA的甲醇同化细菌时，与不含有本发明DNA的甲醇同化细菌相比，分泌到培养基中的L-赖氨酸或者L-精氨酸的量有所提高，或者这两种氨基酸的量均有所增加。DNA转化的结果表明在培养过程中，含有本发明DNA的甲醇同化细菌与不含有本发明DNA的甲醇同化细菌相比，培养基中累积的L-氨基酸的浓度增加，说明了L-氨基酸胞外分泌量有所提高。此外，将本发明DNA导入甲醇同化细菌后，检测到细胞内L-氨基酸浓度的下降也能证明L-氨基酸胞外分泌量的提高。
本发明中，甲醇同化细菌即甲基营养菌，是一种能利用甲醇作为主要碳源生长的细菌，当其中导入了本发明DNA时，将表达lysE蛋白的功能。具体的例子包括嗜甲基菌属细菌，例如甲基营养型嗜甲基菌，以及甲基小杆菌属细菌，例如产糖甲基小杆菌和鞭毛甲基小杆菌。
甲基营养型嗜甲基菌的例子包括但不限于AS1菌株(NCIMB10515)等等。甲基营养型嗜甲基菌AS1菌株(NCIMB10515)可在工业和海洋细菌国际保藏中心得到(地址NCIMB Lts.，Torry Research Station，135，Abbey Road，AberdeenAB9 8DG，United Kingdom)。
产糖甲基小杆菌的例子包括但不限于T-11菌株(NCIMB11375)，ATCC21276菌株，ATCC21371菌株，ATR80菌株(在Appl.Microbiol.Biotechnol.42，pp.67-72(1994)中有描述)，A513菌株(在Appl.Microbiol.Biotechnol.42，pp.67-72(1994)中有描述)等等。产糖甲基小杆菌NCIMB11375菌株在工业和海洋细菌国际保藏中心可以得到(地址NCIMB Lts.，Torry Research Station，135，Abbey Road，Aberdeen AB9 8DG，United Kingdom)。鞭毛甲基小杆菌的例子包括但不限于KT菌株(在Arch.Microbiol.，149，pp.441-446(1998)中有描述)等等。
本发明DNA的一个具体例子是一种编码具有SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白质的DNA，其中至少第56位甘氨酸残基被其它氨基酸取代。
此外，本发明DNA一个更加具体的例子是一种编码具有SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白质的DNA，并且含有以下任何一种情况的突变(i)SEQ ID NO2中第56位甘氨酸残基被其它氨基酸取代；(ii)SEQ ID NO2中第56位甘氨酸残基和第55位丙氨酸残基都被其它氨基酸取代；(iii)SEQ ID NO2中第56位甘氨酸残基和第137位天冬氨酸残基都被其它氨基酸取代。
第56位取代的具体例子包括但不限于用丝氨酸残基取代甘氨酸残基。第55位取代的具体例子包括但不限于用苏氨酸残基取代丙氨酸残基。第137位取代的具体例子包括但不限于用甘氨酸残基取代天冬氨酸残基。
本发明中编码具有上述取代的蛋白质的DNA的更加具体的例子是命名为lysE562、lysE564、lysE565的DNA，在实施例中描述了这些DNA。它们是分离自乳发酵短杆菌的基因突变体，与报道的棒状细菌的lysE基因是同源基因。因此，本发明的DNA也被称作“lysE突变体”，为了方便，本发明DNA编码的蛋白质被称作“LysE突变体”。
作为一种编码棒状细菌LysE蛋白的DNA，野生型谷氨酸棒杆菌lysE的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
在lysE564编码的蛋白质中发现，与野生型lysE编码的SEQ ID NO2氨基酸序列相比，其氨基末端第56位氨基酸由甘氨酸变成了丝氨酸。在lysE562编码的蛋白质中发现，与野生型lysE编码的SEQ ID NO2氨基酸序列相比，其氨基末端第56位氨基酸由甘氨酸变成丝氨酸，第137位氨基酸由天冬氨酸变成甘氨酸。在lysE565编码的蛋白质中发现，与野生型lysE编码的SEQ IDNO2氨基酸序列相比，其氨基末端第56位氨基酸由甘氨酸变成丝氨酸，第55位氨基酸由丙氨酸变成苏氨酸。发现它们共有的突变点是第56位的甘氨酸被丝氨酸取代。推断该位点的变化，对甲基营养菌中有分泌L-赖氨酸活性的分泌载体的生产尤其具有重要意义。
本发明的DNA可以编码除第55位、第56位、第137位位点之外的一个或者几个氨基酸残基被取代、缺失、插入或者添加的氨基酸序列，只要编码的LysE突变体属于上述突变形式，并且在甲醇同化细菌中表现LysE蛋白的功能。这里用的术语“几个”依据氨基酸残基在蛋白质三维结构中的位置和氨基酸种类而定。然而，优选指2-10个氨基酸残基，更优选是2-5个，最优选是2-3个。
编码与上述LysE突变体实质相同的蛋白质的DNA可以通过修饰lysE突变体的核苷酸序列获得。例如，使用定向突变可在某一特定位点进行氨基酸取代、缺失、插入或者添加。此外，上述经修饰的DNA可以通过常用已知的突变手段获得。这样的突变手段例子包括一种在突变处理前，用羟胺等体外处理DNA的处理方法，一种微生物的处理方法，例如，将一种含有DNA的埃希氏菌在突变处理前，用紫外光或者常用的诱变试剂比如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine)(NTG)或者亚硝酸处理等等。Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.在“分子克隆实验指南，第二版”，Cold Spring HarborLaboratory Press(1989)等中描述了这些方法。
编码与上述LysE突变体实质相同的蛋白质的DNA，可以通过在一种甲醇同化细菌中表达任何一种上述突变体和检测表达产物的活性获得。
本发明中，氨基酸残基的位置不一定是在每个LysE蛋白中的绝对位置，而是在氨基酸序列SEQ ID NO2中的相对位置。例如，当SEQ ID NO2氨基酸序列第56位氨基酸N-末端一侧的某个氨基酸残基被缺失时，那么上述的第56位氨基酸残基就变成了N-末端的第55位氨基酸残基。在这种情况下，既然N-末端第55位氨基酸残基对应的是SEQ ID NO2中第56位氨基酸残基，那么它就是第“56”位氨基酸残基。
编码棒状细菌LysE蛋白或者同源蛋白的DNA，即lysE基因或者同源基因，可以在任何微生物中获得，只要该生物有能够在甲醇同化细菌中表达L-赖氨酸分泌活性的各种基因。具体来说，这些微生物的例子包括，但不限于，棒状细菌例如谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)和乳发酵短杆菌(brevibacterium lactofermentum)，埃希氏菌属细菌例如大肠杆菌(Escherichiacoli)，假单胞菌属细菌例如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，分枝杆菌属细菌例如结核分枝杆菌(Mycobacterium tubercalosis)等等。
lysE同源基因的例子包括一种在严格条件下能够与具有SEQ ID NO1核苷酸序列或其部分序列的探针杂交的编码蛋白质的DNA，其编码的蛋白质在甲醇同化细菌中表现出LysE蛋白的功能，该功能是由于前述的氨基酸取代而引起。因此可作为上述氨基酸的替代物。上述“严格条件”包括一种只形成特异性杂交，而不形成非特异性杂交的条件。这种条件很难用数值参数表示清楚。然而，举例来说，严格条件包括这样的条件该条件下，有高度同源性的DNA，例如有80％或者以上的同源性，优选是90％或者以上，更优选是95％或者以上的DNA，可以相互杂交，然而低于以上同源性的DNA则不能相互杂交。换句话说，相互杂交的DNA在DNA印迹中洗脱时常用的盐浓度条件，即1×SSC，0.1％SDS，优选60℃，0.1×SSC，0.1％SDS可作为严格条件的例子。
SEQ ID NO1核苷酸序列的部分序列也可作为探针。用基于SEQ ID NO1所示核苷酸序列的寡聚核苷酸作引物，用含有SEQ ID NO1所示核苷酸序列的DNA片段作模板，利用PCR生产探针。当使用大约300bp长度的DNA片段作为探针，杂交的洗脱条件可以是，例如50℃，2×SSC，0.1％SDS。
为了提高lysE突变体基因在甲醇同化细菌例如嗜甲基菌属细菌或者甲基小杆菌属细菌中的表达量，将含有lysE突变体基因的基因片段连接到可在甲醇同化细菌中发挥功能的载体上，优选多拷贝载体，以制备重组DNA，用于转化比如甲醇同化细菌的宿主。换句话说，可以将lysE突变体基因插入转座子，并导入染色体。此外，可将在甲醇同化细菌中能够有效诱导转录的启动子连接到lysE突变体基因的上游。
参考文献WO97/23597公开了lysE，但只表明棒状细菌的lysE基因可被导入棒状细菌。此外，它只提到L-赖氨酸是分泌型氨基酸，并公开了一个新的蛋白质分泌体系，其中包括含有6个跨膜螺旋结构的LysE。然而，本发明的发明人证明来源于棒状细菌的LysE在甲醇同化细菌中根本不发挥功能。
此外，本发明获得了一种新的L-赖氨酸分泌载体，其包含特定位点的氨基酸替换突变，而这些因素是根本无法从先前有关lysE的专利说明书推知的。本发明的甲醇同化细菌本发明的甲醇同化细菌是一种以可表达形式导入了本发明上述DNA的、并且具有L-赖氨酸或者L-精氨酸生产活性的甲醇同化细菌。本发明的甲醇同化细菌可通过将本发明的DNA导入一种具有L-赖氨酸或者L-精氨酸生产活性的甲醇同化细菌而获得。本发明的甲醇同化细菌也可以通过使导入了本发明DNA的甲醇同化细菌获得L-赖氨酸或者L-精氨酸生产活性而得到。此外，本发明的甲醇同化细菌可通过以可表达形式导入本发明DNA而被赋予L-赖氨酸或者L-精氨酸生产活性。
甲醇同化细菌的例子包括，但不限于上述的嗜甲基菌属细菌或者甲基小杆菌属细菌。
一种具有L-赖氨酸或者L-精氨酸生产能力的甲醇同化细菌可通过使一种甲醇同化细菌的野生型菌株获得L-赖氨酸或者L-精氨酸生产能力的方式来获得。棒状细菌和埃希氏菌属细菌等等的传统培育方法可以用于赋予L-赖氨酸或者L-精氨酸的生产能力。例如，这些方法包括但不限于，获得营养缺陷型突变株、类似物抗性株或者代谢调节突变株，制备L-赖氨酸或者L-精氨酸生物合成系统酶有所增加的重组菌株(见“氨基酸发酵”，the Japan Scientific Societies Press[Gakkai Shuppan Center]，1stEdition，published on May 30，1986，pp.70 to 100)等等。当制备L-赖氨酸或者L-精氨酸生产细菌时，可分别赋予营养缺陷型、类似物抗性、代谢调节突变等特性中的一种，也可以赋予两种或更多结合的特性。生物合成系统酶可被单独增加，或者两种或以上的酶同时被增加。此外，营养缺陷型、类似物抗性、代谢调节突变等特性可和生物合成系统酶的增加结合起来。
例如，L-赖氨酸生产细菌能被培育成L-高丝氨酸或者L-苏氨酸和L-甲硫氨酸的营养缺陷型(JP 48-28078和JP56-6499)，或者培育成肌醇或乙酸营养缺陷型(JP 55-9784 A和JP56-8692 A)，或者培育成溶菌素、异羟肟酸赖氨酸(lysinehydroxamate)、S-(2-氨乙基)-半胱氨酸、γ-甲基赖氨酸、α-氯代己内酰胺、DL-α-氨基-ε-己内酰胺、α-氨基-月桂内酰胺、天冬氨酸类似物、磺胺类药物、醌型化合物或者N-月桂亮氨酸抗性菌株。
生产L-精氨酸的细菌可以被培育成对某一特定试剂具有抗性，例如，磺胺类药物、2-噻唑丙氨酸、α-氨基-β-羟基戊酸或者类似物；培育成除对2-噻唑丙氨酸有抗性之外，还具有L-组氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸或者L-色氨酸营养缺陷型(JP 54-44096 A)；对酮丙二酸、氟丙二酸或者单氟乙酸有抗性(JP 57-18989 A)；对精氨基醇(argininol)有抗性(JP62-24075A)；对X-胍有抗性(X代表脂肪酸或者脂肪链的衍生物，JP2-186995 A)；对5-氮尿嘧啶、6-氮尿嘧啶、2-硫脲嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氮杂胞嘧啶(azacytosine)、6-氮杂胞嘧啶等等有抗性；对异羟肟酸精氨酸(argininehydroxamate)和2-硫脲嘧啶有抗性；对异羟肟酸精氨酸和6-氮尿嘧啶有抗性(见JP57-150381 A)；对组氨酸类似物或者色氨酸类似物有抗性(见JP52-114092A)；至少一种甲硫氨酸、组氨酸、苏氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、腺嘌呤、鸟嘌呤和尿嘧啶(或者尿嘧啶前体)营养缺陷(见JP52-99289 A)；对异羟肟酸精氨酸有抗性(见JP51-6754)；琥珀酸营养缺陷型或者对核酸碱基类似物有抗性(见JP58-9692 A)；不能代谢精氨酸、对精氨酸拮抗物和刀豆氨酸有抗性以及赖氨酸营养缺陷型(见JP57-8729 A)；对精氨酸、异羟肟酸精氨酸、高精氨酸、D-精氨酸和刀豆氨酸有抗性，或者对异羟肟酸精氨酸和6-氮尿嘧啶有抗性(见JP53-143288 A)；对刀豆氨酸有抗性(见JP53-3586 A)等等。
在下文中，用例子说明了通过增加L-氨基酸生物合成酶基因以赋予或者提高L-氨基酸生产能力的方法。
例如，L-赖氨酸的生产能力可通过提高二氢吡啶二羧酸合成酶(dihydrodipicolinate)和天冬氨酸激酶的活性而获得。通过用重组DNA转化甲醇同化细菌宿主的方法可以提高甲醇同化细菌中二氢吡啶二羧酸合成酶和天冬氨酸激酶的活性，其中所述重组DNA可通过将编码二氢吡啶二羧酸合成酶基因和天冬氨酸激酶基因的片段连接到一个能在甲醇同化细菌中发挥功能的载体上(优选其多拷贝载体)而制备得到。二氢吡啶二羧酸合成酶和天冬氨酸激酶活性的提高是转化细菌中编码酶的基因的拷贝数增加的结果。在下文中，二氢吡啶二羧酸合成酶、天冬氨酸激酶和天冬氨酸激酶III被分别称为DDPS、AK和AKIII。
任何微生物都可提供编码DDPS和AK的基因，只要所选的微生物具有能够在甲醇同化细菌中表达DDPS和AK活性的基因。这些微生物可以是野生型菌株或者由它们衍生的突变株。具体来说，这些微生物的例子包括但不限于，大肠杆菌(E.coli)(Escherichia coli)K-12菌株，甲基营养型嗜甲基菌AS1菌株(NCIMB10515)、产糖甲基小杆菌T-11菌株(NCIMB11375)等等。这些基因可用PCR获得，在已知的DDPS(dapA，Richaud，F.et al.，J.Bacteriol.，297(1986))和AKIII(lysC，Cassan，M.，Parsot，C.，Cohen，G.N.and Patte，J.C.，J.Biol.Chem.，261，1052(1986))的核苷酸序列基础上合成引物，用例如E.coli K-12的微生物染色体DNA作为模板，使用PCR获得这些基因。具体的例子包括，但不限于本文所述的来源于E.coli的dapA和lysC。
更优选地，本发明所用的DDPS和AK不会受到L-赖氨酸的反馈抑制。已知E.coli野生型的DDPS会受到L-赖氨酸的反馈抑制(见US5,661,012和US6,040,160)，E.coli野生型的AKIII会受到L-赖氨酸的阻抑反馈抑制。因此，dapA和lysC分别编码DDPS和AKIII，它们各含有一个在导入甲醇同化细菌之后，能够消除L-赖氨酸反馈抑制的突变。在下文中，含有一个能够消除L-赖氨酸反馈抑制的突变的DDPS也可称为“DDPS突变体”，而编码DDPS突变体的DNA也可称为“dapA突变体”或者“dapA*”。含有一个能够消除L-赖氨酸反馈抑制的突变的大肠杆菌AKIII也可称为“AKIII突变体”，而编码AKIII突变体的DNA也可称为“lysC突变体”。
然而，在本发明中DDPS和AK的突变不一定是必须的。例如，已知来源于棒杆菌属细菌的DDPS不会受L-赖氨酸的反馈抑制(见KR92-8382，US5,661,012和US6,040,160)。
来源于E.coli的野生型dapA的核苷酸序列如SEQ ID NO3所示，由它编码的野生型DDPS的氨基酸序列如SEQ ID NO4所示。
编码不受L-赖氨酸反馈抑制的DDPS突变体的DNA可以是编码具有SEQID NO4氨基酸序列的DDPS的DNA，其中SEQ ID NO4中第118位的组氨酸残基被酪氨酸残基取代。此外，编码不受L-赖氨酸反馈抑制的AKIII突变体的DNA可以是编码其氨基酸序列中第352位苏氨酸残基被异亮氨酸残基取代的AKIII的DNA(AKIII序列见US5,661,012和US6,040,160)。
用于基因克隆的质粒可以是任何可在微生物比如埃希氏菌属细菌中复制的质粒。具体来说，这样的细菌例子包括pBR322、pTWV228、pMW119、pUC19等等。
在嗜甲基菌属细菌中能够发挥功能的载体包括，例如，一种能在嗜甲基菌属细菌中自主复制的载体。具体来说，例子包括RSF1010及其衍生物，它是一种拥有广谱宿主的载体，以及pAYC32(Chistorerdov，A.Y.，Tsygankov，Y.D.Plasmid，16，161-167(1986))、pMFY42(Gene，44，53(1990))、pRP301、pTB70(Nature，287，396，(1980))等等。
此外，能够在甲基小杆菌属细菌中发挥功能的载体例子包括，例如，一种能在甲基小杆菌属细菌中自主复制的载体。具体来说，例子包括RSF1010，它是一种有广谱宿主的载体，以及它的衍生物例如pMFY42(Gene，44，53(1990))。
为了通过连接dapA和lysC到一个能在甲醇同化细菌中发挥功能的载体上来制备重组DNA，用适合作用含dapA和lysC的DNA片段末端的限制性内切酶消化该载体。常用T4 DNA连接酶进行连接。dapA和lysC基因可并入不同或相同的载体。
广谱宿主载体质粒RSFD80是已知的(WO95/16042)，可用作本发明容纳编码DDPS突变体的dapA突变基因和编码AKIII突变体的lysC突变基因的质粒。用该质粒转化的E.coli JM109菌株被命名为AJ12396，并于1993年10月28日保藏在National Institute of Bioscience of Advanced Industrial Science andTechnology，其保藏号为FERM P-13936。然后，在1994年11月1日，根据布达佩斯条约转为国际保藏，保藏号为FERM BP-4859。RSFD80可用已知的方法由AJ12396菌株获得。
含有dapA突变基因的RSFD80，其中如SEQ ID NO3所示的野生型dapA的核苷酸序列中第597位由C变成T。以上核苷酸替换的结果是具有SEQ IDNO4的野生型DDPS的第118位的组氨酸残基变成酪氨酸残基，其中所述野生型DDPS由具有SEQ ID NO3的野生型dapA编码。此外，含有lysC突变基因的RSFD80，其野生型lysC核苷酸序列的第1638位由C变成T。该突变形成了突变体AKIII，其第352位的苏氨酸残基变成了异亮氨酸残基。
可使用任何方法将如上制备的重组DNA导入嗜甲基菌属细菌或者甲基小杆菌属细菌，只要它能提供足够的转化效率。例如，可使用电穿孔(Canadian Journalof Microbiolgy，43，197(1997))。
可通过将基因的多个拷贝导入嗜甲基菌属细菌的染色体DNA来获得目的基因的提高表达。dapA和lysC的多个拷贝可以用同源重组的方法导入嗜甲基菌属细菌染色体DNA。这可以通过靶定染色体DNA有多个拷贝的序列来完成。可转座元件末端的重复DNA或反向重复序列可用作这种多拷贝的染色体DNA序列。换句话说，正如JP 2-109985 A公开的，通过将目的基因的多个拷贝并入转座子将其转移的方法，可使它们导入染色体DNA。在这两种方法中，转化子细菌中目的基因拷贝数的增加导致了目的基因活性的增强。
除了上述基因放大的方法，通过替换表达控制序列的方法，例如更强的dapA和lysC启动子(见JP1-215280 A)，也可提高目的基因的表达量。强启动子的例子包括lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、λ嗜菌体的PR启动子和PL启动子、tet启动子、amyE启动子和spac启动子等等。使用这些启动子可以提高目的基因的表达，因此这些基因产物的活性得以增强。这些增加基因表达量的方法可和上述基因扩增(增加目的基因的拷贝数)的方法结合使用。
制备重组DNA可以通过利用相应于基因片段末端的限制性内切酶消化载体，再将基因片段连接到载体上来完成。连接通常使用T4DNA连接酶来完成。那些对所属技术领域技术人员来说常用的已知方法可用作消化方法，包括DNA的连接、染色体DNA的制备、PCR、质粒DNA的制备、转化、引物寡聚核苷酸的设计等等。这些方法在Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.著的“分子克隆实验指南，第二版”，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)等等中有描述。
为了增强DDPS和AK基因的表达或者其活性，还可能需要增强参与L-赖氨酸生物合成的其它酶。这样的酶包括二氨基庚二酸盐途径酶，如二氢吡啶二羧酸还原酶，二氨基庚二酸盐脱羧酶，二氨基庚二酸盐脱氢酶(所有前述的酶参见WO96/40934)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(JP60-87788A)，天冬氨酸转氨酶(JP6-1020280A)，二氨基庚二酸盐差向酶和天冬氨酸半醛脱氢酶；氨基己二酸途径酶如高乌头酸水合酶等等。
WO00/61723描述了来源于甲基营养型嗜甲基菌的天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、二氨基庚二酸盐脱羧酶。
此外，本发明的微生物可能已降低了催化从L-赖氨酸生物合成路径中分支出去的产生L-赖氨酸以外化合物反应的酶活性，或者是该酶缺陷。此处所说催化从L-赖氨酸生物合成路径中分支出去的产生L-赖氨酸以外化合物反应的酶可以是高丝氨酸脱氢酶(见WO95/23864)。
前述的增强L-赖氨酸的相关生物合成酶活性的技术可同样用于L-精氨酸。
通过增强乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶活性，N-乙酰谷氨酸-g-半醛脱氢酶活性，N-乙酰谷氨酸激酶活性以及精氨琥珀酸酶的活性可提高L-精氨酸的生产能力(见JP5-23750)。
通过增强谷氨酸脱氢酶(EP1057893A1)，精氨琥珀酸合成酶(EP0999267A1)，氨甲酰磷酸合成酶(EP1026247A1)或N-乙酰谷氨酸合成酶(JP57-5693A)的活性，或者是通过破坏编码精氨酸抑制物的基因(argR)，可提高L-精氨酸的生产能力。
L-赖氨酸或者L-精氨酸的生产可以通过培养一种能够生产L-赖氨酸或者L-精氨酸的甲醇同化细菌，例如嗜甲基属细菌或者甲基小杆菌属细菌，生产L-赖氨酸或者L-精氨酸。经过生产和积累，L-赖氨酸或者L-精氨酸可以从如上述所说的培养基中获得，然后可以从培养物中收集L-赖氨酸或者L-精氨酸。
本发明的微生物可以利用一种典型的甲醇同化细菌培养方法培育。本发明的培养基可使用天然培养基或合成培养基，只要它含有碳源，氮源，无机离子和其它所需的痕量有机成分。
如果使用甲醇用作主要碳源，可以降低L-赖氨酸和L-精氨酸的生产成本，如果使用甲醇作为主要碳源，培养基中甲醇的添加浓度是0.001-30％。至于氮源，可将硫酸铵等添加到培养基中。除此之外，还可以少量添加痕量成分，例如磷酸钾、磷酸钠、硫酸镁、硫酸亚铁和硫酸锰。
培养通常通过振荡或搅拌在有氧条件下进行，pH值维持5-9之间，温度维持20-45℃之间，培养通常在24-120小时内完成。
L-赖氨酸或者L-精氨酸通常可以通过结合使用离子交换树脂方法、沉淀方法以及其它已知方法来收集。
实施例下文中，我们将以优选的实施例的方式，来进一步阐述本发明。
除非另有说明外，本发明所使用的试剂均由Wako Pure Chemical Industriesof Nalarai Tesque生产。实施例中所用培养基的组分如下，其pH值是用NaOH、KOH，或HCl来调节。
LB培养基Bacto蛋白胨(Difco) 10g/L酵母提取物(Difco) 5g/LNaCl 10g/LpH7.0120℃高压蒸气灭菌20分钟。
LB琼脂培养基LB培养基Bacto琼脂 15g/L120℃高压蒸气灭菌20分钟。
SEII培养基K2HPO41.9g/LNaH2PO41.56g/LMgSO4·7H2O 0.2g/L(NH4)2SO45g/LCuSO4·5H2O 5μg/LMnSO4·5H2O 25μg/lZnSO4·7H2O 23μg/LCaCl2·2H2O 72mg/LFeCl3·6H2O 9.7mg/LCaCO3(Kanto Kagaku) 30g/L甲醇2％(v/v)pH7.0除甲醇外的其它组分于121℃高压蒸气灭菌15分钟，待其冷却后再加入甲醇。
SEII琼脂培养基
K2HPO41.9g/LNaH2PO41.56g/LMgSO4·7H2O 0.2g/L(NH4)2SO45g/LCuSO4·5H2O 5μg/LMnSO4·5H2O 25μg/lZnSO4·7H2O 23μg/LCaCl2·2H2O 72mg/LFeCl3·6H2O 9.7mg/L甲醇 0.5％(v/v)pH7.0Bacto琼脂(Difco) 15g/L除甲醇外的其它组分于121℃高压蒸气灭菌15分钟，待其冷却后再加入甲醇。
实施例1突变体lysE基因文库的构建首先，将已知能增强棒状细菌体内L-赖氨酸分泌的基因的同源基因lysE从短杆菌细菌内克隆出来，并使其在嗜甲基菌细菌体内表达。
(1)pRSlysE的构建为了将lysE基因导入到嗜甲基菌属细菌体内，本发明采用了已知质粒pRS(见JP3-501682)来构建质粒pRSlysE以表达lysE。pRS质粒是具有pVIC40质粒的载体片段的一种质粒(见国际公开专利WO90/04636，JP3-501682)，通过缺失pVIC40中一个编码苏氨酸操纵子的DNA片段而获得。pVIC40质粒来源于一个具有广谱宿主的载体质粒pAYC32(Chistorerdov，A.Y.，Tsygankov，Y.D.，Plasmid，1986，16，161-167)，该质粒来源于RSF1010。
具体而言，pRS是通过如下方式构建的。将pVIC40质粒用EcoRI酶切，然后加入到苯酚/氯仿溶液中，混合终止反应。离心反应液，收集上清液，再用乙醇沉淀收集DNA，并在0.8％琼脂糖凝胶上电泳分离。通过使用EASY TRAPVer.2可收集到一个包含载体部分的大约8千个碱基对(以下简称“kbp”)的DNA片段。通过DNA连接试剂盒Ver.2(Takara Shuzo)使上述pVIC40质粒的载体片段进行自身连接。用连接反应液转化大肠杆菌(E.coli JM109感受态细胞，Takara Shuzo)细胞，并将细胞涂布于含20mg/L链霉素的LB琼脂培养基上37℃过夜培养，并将琼脂培养基上形成的克隆接种于含20mg/L链霉素的LB液体培养基中，37℃下振荡培养8小时。使用碱性SDS方法从每份培养液中抽提质粒DNA，并通过限制性内切酶酶切来证实并获得pRS。
接下来，根据图1所示方案来构建包含tac启动子的质粒pRStac。其构建如下。首先，使用限制性内切酶EcoRI和PstI消化载体pRS，然后加入到苯酚/氯仿溶液中混合终止反应。离心反应液，收集上清液，再用乙醇沉淀收集DNA，并在0.8％琼脂糖凝胶上电泳分离，通过使用EASY TRAP Ver.2可收集到一个包含载体部分的大约8千个碱基对(以下简称“kbp”)的DNA片段。另一方面，以pKK223-3质粒(表达载体，Pharmacia)为模板，以SEQ ID NO7和8所示序列为引物，通过PCR扩增tac启动子序列(一个循环包括94℃变性20秒，55℃退火30秒，72℃延伸60秒，如此进行30个循环)。PCR反应中使用PyrobestDNA聚合酶。使用PCR prep(Promega)来纯化含有扩增启动子的DNA片段，再对预先设计的引物中限制性酶位点(即EcoRI和EcoT22I位点)进行限制性酶切。再加入到苯酚/氯仿溶液中混合终止反应。离心反应液，收集上清液，再用乙醇沉淀收集DNA，并在0.8％琼脂糖凝胶上电泳分离，通过使用EASY TRAPVer.2可收集到一个大约0.15kbp的DNA片段。
将上述制备的pRS载体和tac启动子片段的消化产物通过DNA连接试剂盒Ver.2(Kakara Shuzo)连接起来。用连接反应液转化大肠杆菌(E.Coli JM109感受态细胞，Takara Shuzo)细胞。并将细胞涂布于含20mg/L链霉素的LB琼脂培养基上37℃过夜培养。将琼脂培养基上形成的克隆接种于含20mg/L链霉素的LB液体培养基中，37℃下振荡培养8小时。使用碱性SDS方法从每份培养液中抽提质粒DNA，并通过限制性内切酶酶切来证实并获得pRStac。选择出pRS载体上链霉素抗性基因的转录方向和tac启动子一致的质粒，即为pRStac。
将上面所述的pRStac用Sse8387I(Takara Shuzo)和SapI(New England Biolabs)消化，加入到苯酚/氯仿溶液中混合终止反应。离心反应液，收集上清液，再用乙醇沉淀收集DNA，并在0.8％琼脂糖凝胶上电泳分离，获得大约9.0kbp的DNA片段。
同样，以从乳发酵短杆菌2256菌株(ATCC13869)中提取的染色体为模板，以SEQ ID NO9和10所示序列为引物，通过PCR技术扩增lysE基因(94℃变性20秒，55℃退火30秒，72℃延伸90秒)。PCR反应中使用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo)。为了使lysE基因能够在嗜甲基菌细菌体内表达，引物的设计使得距离lysE基因翻译起始密码子9-15个碱基对的核苷酸被嗜甲基菌细菌内的一个已知功能序列所取代(Wyborn，N.R.，Mills.j.，Williamis，S.G.and Jones，C.W.，Eur，J.Biochem.，240，314-322(1996))。通过PCR prep(Promega)纯化所获得目的片段，并用Sse8387I和SapI消化。加入到苯酚/氯仿溶液中混合终止反应。离心反应液，收集上清液，再用乙醇沉淀收集DNA，并通过0.8％琼脂糖凝胶进一步收集。
将上述制备的pRStac载体和lysE基因片段的消化产物通过DNA连接试剂盒Ver.2(Takara Shuzo)进行连接。用连接反应液转化大肠杆菌(E.Coli JM109感受态细胞，Takara Shuzo)细胞。将细胞涂布于含20mg/L链霉素的LB琼脂培养基上37℃过夜培养。将琼脂培养基上形成的克隆接种于含20mg/L链霉素的LB液体培养基中，37℃下振荡培养8小时。使用碱性SDS方法从培养液中抽提质粒DNA，并通过限制性内切酶酶切来证实每个质粒的结构，并确定核苷酸序列获得pRSlysE(图1)。在pRSlysE中，lysE基因的安置方向使得其转录方向与tac启动子的一致。
(2)pRSlysE向嗜甲基菌细菌中的导入将如上所获的pRSlysE通过电穿孔方法导入甲基营养型嗜甲基菌AS1菌株(NCIMB10515)(Canadian Journal of Microbiology，43，197(1997))。此外，以与pRSlysE同样的方式，将pRS也导入AS1菌株中作为对照。结果，pRS对照组中1μgDNA形成了上千个克隆，而pRSlysE却仅获得几个克隆。
从估计导入了pRSlysE的转化菌株中提取质粒，并研究其核苷酸序列，发现，在所有被研究质粒的编码lysE基因序列中都引入了一个自发突变，在有些质粒中该突变为无意突变，即一个编码氨基酸的密码子被终止翻译的终止密码子替代。此外，在其它一些质粒中，还观察到lysE基因的缺失。从而认为由该质粒所携带的lysE基因应该不具备功能。
如上所述，携带全长lysE基因的质粒pRSlysE被导入到甲基营养型嗜甲基菌中的几率是非常低的，只有含有突变因而丧失功能的lysE突变基因才能被被导入。综合考虑这些事实，我们认为lysE基因的导入起到致命效应。这表明lysE基因对于异源细菌中L-赖氨酸的分泌不能普遍发挥作用。
将含有引入突变的质粒pRSlysE的甲基营养型嗜甲基菌AS1涂布于含有50mg/L链霉素的SEII培养基上37℃过夜培养。然后，从培养基表面刮取大约10cm2的细胞接种于含有50mg/L链霉素的SEII生产培养基中(20ml)，37℃振荡培养34小时。培养结束后，离心去除细胞，并使用氨基酸分析仪来测定培养基上清液中L-赖氨酸的浓度(Nihon Bunko，高效液相色谱)。结果表明，尽管导入了突变lysE基因，但没有任何菌株的L-赖氨酸分泌有所增强。
如上所述，将来源于棒杆菌细菌的已知基因lysE导入甲醇同化细菌导致了致命效应。在这些仅导入了少量lysE基因的菌株中，被导入的lysE基因或突变，或缺失，从而不能发挥作用。由于负责氨基酸分泌的蛋白只有当其进入到细胞膜中才发挥功能，因此蛋白和细胞膜的条件，如磷脂的组成，必须相互匹配。因此，认为很难以此种维持蛋白功能的方式来表达来源于异源组织的细胞膜蛋白。相应地，我们估计，如果使用人工突变导入方法，那么与自然突变相比，将会得到更多阳性突变，从这些突变中很可能成功获得具有L-赖氨酸分泌能力的突变lysE菌株。基于这一设想，我们使用本文所述的羟胺突变导入方法来构建突变体lysE文库。
此外，本发明的发明人认为，如果在甲醇同化细菌中表现出L-赖氨酸分泌活性的突变lysE基因被导入到甲醇一吸收细菌中，对AEC(S-(2-氨乙基)半胱氨酸)，即化合物L-赖氨酸的类似物的抗性程度可能会有所提高。基于这一观念，发展了本文所述的筛选系统。首先，将详细描述突变体lysE文库的构建。
(3)pRSlysE质粒的突变处理将含有携带着野生型lysE(从Takara Shuzo获得)基因的pRSlysE质粒的E.coliJM109菌株接种于含有20mg/L链霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养8小时，再用碱性SDS方法从每管培养基中提取质粒DNA。
接下来，使用羟胺进行体外突变法，将突变引入制备好的pRSlysE中。也就是说，将浓度为250mM的磷酸钾缓冲液pH调节为6.0，将浓度为400mM的羟胺溶液pH调节为6.0，这两个浓度均为其终浓度，取2μg pRSlysE质粒和200μl水，并于75℃培养2小时或3小时。接下来，使用EASY TRAP Ver.2方法(DNA收集试剂盒，Takara Shuzo)从溶液中收集pRSlysE质粒。将与羟胺反应2个小时和3个小时的质粒混合在一起，获得质粒集合体，这些质粒以不同比例引入了突变。
以如上方法获得了突变体pRSlysE质粒集合体，该质粒集合体被认为在不同位置引入了突变，扩增质粒，用其转化大肠杆菌(E.coli JM109感受态细胞，Takara Shuzo)细胞，将细胞接种于含20mg/L链霉素的LB琼脂培养基中，37℃培养过夜，构建大肠杆菌文库。将琼脂培养基上形成的所有克隆刮下来，接种于含20mg/L链霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养8小时。通过碱性SDS方法从每份培养液中提取质粒DNA作为突变体pRSlysE质粒文库。突变体pRSlysE质粒向嗜甲基菌细菌中的导入过程以及L一氨基酸的产生。
(1)从带有人工突变体的lysE文库中筛选功能型lysE通过电穿孔方法将按上述方法获得的突变体pRSlysE质粒文库(CanadianJournal of Microbiology，43，197(1997))导入到甲基营养型嗜甲基菌AS1菌株(NCIMB10515)中。同时又将野生型质粒pRSlysE导入的AS1菌株作为对照。结果表明，作为对照的样品又再现了以前的检测结果，即1μgDNA只获得了几个克隆。而导入突变体质粒文库时，却产生了成百上千个克隆。到目前为止的检测结果表明，当导入野生型质粒时，所获得的几个克隆几乎全部都是由于引入了自然突变而使lysE丧失了功能。也就是说，携带全长lysE基因的pRSlysE导入到甲基营养型嗜甲基菌中的几率是非常低的，只有含有导致功能丧失的突变的lysE基因质粒才能够被导入。综合考虑这些事实，我们认为lysE基因向甲基营养型嗜甲基菌的导入产生了一个致命效应。另一方面，由于导入突变体pRSlysE质粒文库时，所产生的克隆要远远多于导入野生型质粒，因此通过羟胺处理而产生的突变体会达到一个很高的频率。
如上所述，我们获得了突变体lysE文库作为突变体pRSlysE质粒文库。那么，我们就建立了一个筛选系统来获得表现出细胞外分泌L-赖氨酸活性的功能型lysE。
将按上述方式获得的含有突变体pRSlysE质粒文库的甲基营养型嗜甲基菌菌株进行适当稀释，使得每个平板上能长出几百个克隆，并将其涂布于含有50mg/L的链霉素和3g/L苏氨酸的SEII琼脂培养基上，37℃培养48小时。将长出的克隆复制到含3g/L苏氨酸和0、5、7或10g/L AEC的SEII琼脂培养基上。当这些克隆被复制到不含有AEC的平板上时，所长出的克隆数目和最初平板中克隆的数目一致，而当它们被复制到含有AEC的平板上时，所长出的克隆的数目要远远低于最初平板中克隆的数目。将在含有AEC的复制平板上形成的克隆以其各自的浓度转移到新的含有AEC的SEII琼脂培养基上培养，观察发现，在同样的培养基上形成了单一菌落，基于该发现，我们证实其获得了AEC抗性。从这些菌株中，随机挑选100个菌株用于进一步筛选。
(2)利用引入突变体pRSlysE质粒的菌株来生产L-氨基酸。
在含有突变质粒pRSlysE(该突变质粒被预计能够以带有突变的形式被导入，并能够赋予宿主AEC抗性)的甲基营养型嗜甲基菌AS1菌株中，取出100个菌株涂布于含有50mg/L链霉素的SEII平板上37℃过夜培养，然后刮取培养基表面上约10cm2的细胞，接种于含有50mg/L链霉素的SEII(20ml)生产培养基中，37℃振荡培养48小时。培养结束后，离心去除细胞，通过薄层色谱分离培养液上清中含有的L-氨基酸，并利用水合印三酮检测法粗略定量分析。结果发现，L-赖氨酸和L-精氨酸以不同的浓度被分泌到胞外。根据它们的方式，可将这100个菌株大致分为5组。
从这5组中选择一个典型的菌株，并将它们体内的质粒分别命名为pRSlysE561、pRSlysE562、pRSlysE563、pRSlysE564、pRSlysE565。纯化这些质粒，并分析它们的lysE区域的核苷酸序列。结果发现，pRSlysE562和pRSlysE563，pRSlysE561和pRSlysE564的序列完全相同。因此，我们接下来着重研究pRSlysE562，pRSlysE564和pRSlysE565。
分析了pRSlysE562，pRSlysE564和pRSlysE565内LysE蛋白编码区域的核苷酸序列，我们发现，与SEQ ID NO1所示的野生型LysE碱基序列相比，lysE564在第166位上发生了碱基替换，即由A(腺嘌呤)替换了G(鸟嘌呤)。结果导致在SEQ ID NO2所示的野生型lysE的氨基酸序列中第56位上由Ser(丝氨酸)替换了Gly(甘氨酸)。还发现，lysE562的碱基也发生了替换，SEQID NO1所示的野生型LysEDNA序列中第166位上A(腺嘌呤)替换了G(鸟嘌呤)，第410位上A(腺嘌呤)替换了G(鸟嘌呤)，结果，导致SEQ ID NO2所示的野生型lysE的氨基酸序列中第56位上Ser(丝氨酸)替换了Gly(甘氨酸)，第137位上Gly(甘氨酸)替换了Asp(天冬氨酸)。研究还发现，lysE565的碱基替换为SEQ ID NO1所示的野生型LysE DNA序列中第166位上A(腺嘌呤)替换G(鸟嘌呤)，第163位上A(腺嘌呤)替换G(鸟嘌呤)，结果导致氨基酸的替换为SEQ ID NO2所示的野生型lysE的氨基酸序列中第56位上Ser(丝氨酸)替换了Gly(甘氨酸)，第55位上Thr(苏氨酸)替换Ala(丙氨酸)。当pRSlysE562，pRSlysE564和pRSlysE565被再一次导入菌株中时，这些质粒能以与pRS同样的频率进行转化。导入质粒后的菌株按上述方法进行培养，并使用氨基酸分析仪(Nihon Bμnko，高效液相色谱)对培养基上清液中的L-赖氨酸和L-精氨酸的浓度进行测定。测量结果见表1。
表1
以上结果显示，pRSlysE562，pRSlysE564和pRSlysE565具有显著增强L-赖氨酸和L-精氨酸分泌的活性，而且即使pRSlysE562，pRSlysE564和pRSlysE565被导入到AS1菌株中，增强L-赖氨酸和L-精氨酸分泌的活性仍然存在。因此，表明获得ACE抗性的菌株的突变被引入在质粒上，而不是在宿主细胞上。
与SEQ ID NO2所示的野生型lysE基因的氨基酸序列相比，pRSlysE562，pRSlysE564和pRSlysE565均在第56位引入了同义突变，即该位置的氨基酸由Ser(丝氨酸)替换了原来的Gly(甘氨酸)。转化了只有这一同义突变的质粒pRSlysE564的大肠杆菌菌株JM109被命名为AJ110086。根据布达佩斯国际公约对国际保藏的要求，此菌株已于2002年9月26日被保藏于国际专利生物保藏中心，national institute of advanced industrial science and technology，保藏号为FERM BP-8196。
本领域技术人员根据已知方法很容易从lysE564获得lysE562和lysE565。具体而言，可将来自pRSlysE564的lysE564编码区域的一个片段并入到例如pSELECTIM-1载体中来获得lysE562基因，其中所述pSELECTTM-1载体为由Promega公司生产的用于导入定点突变的载体，定点突变的引入是通过AlteredStesTM，其为Promega公司生产的用于引入位点一定向突变试剂盒，将SEQ IDNO1第410位由碱基G(鸟嘌呤)替换A(腺嘌呤)。例如，在上述过程中，将序列SEQ ID NO5的合成寡核苷酸作为引物。在野生型lysE基因中，SEQ IDNO5第20位核苷酸被替换。同样的，可通过在SEQ ID NO1的第166位上由A(腺嘌呤)替换G(鸟嘌呤)，得到lysE565。为了引入突变，使用例如SEQ IDNO6的合成寡核苷酸。野生型lysE基因中SEQ ID NO6的第16位和19位核苷酸被替换。
实施例2L-赖氨酸生物合成酶基因和lysE562、lysE564或lysE565基因向甲基营养型嗜甲基菌中的导入由于发现导入lysE562、lysE564或lysE565基因可增强L-赖氨酸的细胞外分泌，因此可通过导入lysE562、lysE564或lysE565来增强L-赖氨酸的生物合成，从而进一步提高它们的产量。
(1)携带dapA*基因的pRSdapA质粒的构建首先准备一个载体，该载体含有编码二氢吡啶二羧酸合成酶的基因作为L-赖氨酸生物合成体系酶基因，所述酶并不受L-赖氨酸(dapA*)的反馈抑制。
将实施例1中准备的pRStac用Sse8387I和XbaI消化，然后将其加入到苯酚/氯仿溶液中混合终止反应。离心反应液，收集上清液，再用乙醇沉淀收集DNA，并在0.8％琼脂糖凝胶上电泳分离，获得大约9kbp的DNA片段。
使用含有dapA*基因的已知质粒RSFD80(见WO90/16042)为模板，SEQ IDNO11和12所示序列为引物，通过PCR方法(94℃变性20秒，55℃退火30秒，72℃延伸60秒)扩增dapA*基因片段。PCR反应中使用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo)。将获得的dapA*扩增片段用PCR prep(Promega)纯化，再用限制性内切酶Sse8387I和XbaI消化。将反应混合物中加入到苯酚/氯仿溶液中混合终止反应。离心反应液，收集上清液，再用乙醇沉淀收集DNA，并在0.8％琼脂糖凝胶上电泳分离，获得大约01kbp的DNA片段。
将上述制备好的pRStac载体和dapA*基因片段酶切产物用DNA连接试剂盒Ver.2(Takara Shuzo)进行连接。用连接反应液转化大肠杆菌(E.coli JM109感受态细胞，Takara Shuzo)细胞。将细胞涂布于含20mg/L链霉素的LB琼脂培养基上37℃过夜培养。将琼脂培养基上形成的克隆接种于含20mg/L链霉素的LB液体培养基中，37℃下振荡培养8小时。使用碱性SDS方法从每份培养液中抽提质粒DNA，通过限制性内切酶酶切来证明每个质粒的结构，并确定核苷酸序列，得到pRSdapA质粒。在pRSdapA质粒中，dapA*基因安置的方向使得其转录方向与tac启动子的一致。
(2)含有dapA*基因和lysE562、lysE564或lysE565任一基因的质粒的构建为了评价lysE562、lysE564或lysE565任一基因与dapA*基因结合的效应，通过插入dapA*基因，构建质粒pRSlysE562、pRSlysE564和pRSlysE565。将实施例1中制备好的pRSlysE562、pRSlysE564和pRSlysE565质粒用限制性内切酶SapI消化，并使用DNA平头试剂盒(Kakara Shuzo)处理成平头末端。此外，用限制性内切酶EcoRI和SapI消化质粒pRSdapA，并通过0.8％琼脂糖凝胶电泳分离得到大约1kb的片段，该片段含有tac启动子和dapA*序列，用EASYTRAP Ver.2收集该片段。按上述方法平头处理该片段，用DNA连接试剂盒Ver.2(Takara Shuzo)将其连接到前面提及的pRSlysE562、pRSlysE564和pRSlysE565质粒消化产物上。
用先前提及的连接好的反应液转化大肠杆菌(E.coli JM109感受态细胞，Takara)，并将细胞涂布于含20mg/L链霉素的LB琼脂培养基上37℃过夜培养。将琼脂培养基上形成的克隆接种于含20mg/L链霉素的LB液体培养基中，37℃下振荡培养8小时。使用碱性SDS方法从培养液中抽提质粒DNA，并通过限制性内切酶酶切来证实每个质粒的结构，并确定核苷酸序列，得到pRSlysE562dapA，pRSlysE564dapA和pRSlysE565dapA质粒。在这些质粒中，lysE562，lysE564和lysE565的安置方向使得其转录方向与dapA*的转录方向相反。
当通过电穿孔法将按上述方法获得的pRSlysE562dapA，pRSlysE564dapA和pRSlysE565dapA质粒导入甲基营养型嗜甲基菌AS1菌株(NCIMB10515)中时，我们得到了pRSlysE562dapA和pRSlysE564dapA质粒的转化菌株，而没有得到pRSlysE565dapA质粒的转化菌株。这可能是因为该质粒在AS1菌株中稳定性降低的缘故。
(3)含有lysE562或lysE564和dapA*的嗜甲基属细菌中L-赖氨酸的生产将上述获得的导入了pRSlysE562dapA或pRSlysE564dapA质粒的AS1菌株，以及作为对照菌株的导入了pRSlysEdapA的AS1菌株涂布于含20mg/L链霉素的SEII培养基上37℃过夜培养，然后从培养基表面细菌中刮取0.3cm2的细胞，接种于含有20mg/L链霉素的SEII生产培养基(20ml)上，37℃振荡培养34小时。培养结束后，离心去除细胞，并通过氨基酸分析仪(Nihon Bunko，高效液相色谱)测量培养基上清液中L-赖氨酸的浓度。表2显示了测量结果。导入了pRSlysE562dapA或pRSlysE564dapA质粒的菌株L-赖氨酸的聚积有所提高。而且它们在培养基中的聚积程度明显超出了仅导入pRSlysE562或pRSlysE564质粒的菌株。因此，可以看出，分泌的限速因素已被消除，dapA*基因的增强效应被明显展现出来。
表2
实施例3lysE564基因向产糖甲基小杆菌的导入和L-氨基酸的生产(1)pRS-lysE564-Tc的制备接下来需要证实是，含有突变lysE的lysE562、lysE564和lysE565三个基因是否能够在甲基菌属细菌内发挥功能。为此，我们选择了lysE564，并将表达它的质粒pRSlysE564做了改进。pRSlysE564质粒携带有链霉素抗性基因。然而，由于产糖甲基小杆菌本身就具有链霉素抗性，所以，pRSlysE质粒不能被筛选出来。因此，通过在pRSlysE质粒中插入可在产糖甲基小杆菌中使用的四环素抗性基因来构建改进的质粒。
首先，从pRSlysE564质粒来构建携带有四环素抗性基因的pRS-lysE564-Tc质粒。将pRSlysE564质粒用限制性内切酶EcoRI消化，并加入到苯酚/氯仿溶液中混合终止反应。离心反应液，收集上清液，用乙醇沉淀收集DNA，使用DNA平头试剂盒(Takara Shuzo)将其消化的末端处理成平头。在0.8％琼脂糖凝胶上分离DNA片段，使用EASY TRAP Ver.2(DNA收集试剂盒，Takara Shuzo)收集一段大约9千碱基对(以下简称为“kbp”)的DNA片段。
此外，以pRK310质粒(Pansegrau et al.，J.Mol.Biol.239，623-663(1994))为模板，以SEQ ID NO13和14所示序列为引物，通过PCR技术扩增四环素抗性基因区域(一个循环包括94℃变性20秒，55℃退火30秒，72℃延伸60秒，如此进行30个循环)，PCR反应中使用PyrobestDNA聚合酶。用PCR prep(Promega)对扩增后的含有四环素抗性基因区域的DNA片段进行纯化，然后通过乙醇沉淀法收集DNA，并使用TaKaRa BKL试剂盒对其进行末端平头处理和磷酸化处理(Blunting Kination Ligation Kit，Takara Shuzo)，再加入到苯酚/氯仿溶液中混合终止反应。离心反应液，收集上清液，再用乙醇沉淀收集DNA，并在0.8％琼脂糖凝胶上电泳分离。通过使用EASYTRAP Ver.2可收集到一个大约1.5kbp的DNA片段。
可通过与上述类似的方法，使用其它质粒如pRK2质粒作为替代Prk310的模板，获得四环素抗性基因。
将如上制备的pRSlysE564载体片段和含有四环素抗性基因区域的DNA片段通过DNA连接试剂盒Ver.2(Takara Shuzo)连接起来。用连接反应液转化大肠杆菌(E.Coli JM109感受态细胞，Takara Shuzo)细胞。将转化后的细胞涂布于含有20mg/L链霉素和15mg/L四环素的LB琼脂培养基上37℃过夜培养。将琼脂培养基上形成的克隆接种于含20mg/L链霉素和15mg/L四环素的LB液体培养基中，37℃下振荡培养8小时。使用碱性SDS方法从每份培养液中提取质粒DNA，通过限制性内切酶消化来确认每个质粒的结构，得到pRSlysE-564-Tc。
(2)pRSlysE-564-Tc向甲基小杆菌属细菌中的导入和L-氨基酸的生产通过电穿孔方法将如上所获得的pRSlysE-564-Tc导入产糖甲基小杆菌菌株NCIMB11375中(Canadian Journal of Microbiology，43，197(1997))。将pRK310以同样的方式导入到产糖甲基小杆菌菌株NCIMB11375中，作为对照。结果发现，获得了与对照相同转化率的含pRSlysE-564-Tc的克隆。
通过在携带有野生型lysE基因的质粒pRSlysE中插入四环素抗性基因，构建得到了pRSlysET质粒，并试着将该质粒以同样的方式被导入到产糖甲基小杆菌菌株中。然而，并没有获得转化菌株，在甲基营养型嗜甲基菌AS1菌株中也观察到了同样的现象，因此，估计野生型lysE基因在甲基菌属细菌中也不能正常发挥功能。
将含有pRS-lysE-564-Tc质粒的产糖甲基小杆菌菌株NCIMB11375涂布于含有10mg/L四环素的SEII平板上30℃过夜培养，然后，从培养基表面刮取大约10cm2的细胞接种于含有10mg/L四环素的SEII生产培养基中(20ml)，30℃振荡培养60小时。培养结束后，离心去除细胞，并使用氨基酸分析仪来测定培养上清液中L-赖氨酸的浓度(Nihon Bunko，高效液相色谱)。结果如下表3
表3
(3)pRS-lysE564-dapA-Tc已发现lysE564基因导入到产糖甲基小杆菌菌株中可使L-赖氨酸在培养基中积聚，认为这是由于L-赖氨酸分泌的增强的缘故。
相应地，在产糖甲基小杆菌菌株中共同表达L-赖氨酸生物合成基因和lysE564基因而产生的增强效应根据与实施例2相同的方式检测。
按照与实施例3(1)相同的方法，将四环素抗性基因融入到在实施例2(2)中制备好的pRSlysE564dapA质粒中，来构建另一个质粒，该质粒被命名为pRS-lysE564-dapA-Tc。
(4)pRS-lysE564-dapA-Tc向产糖甲基小杆菌中的导入和L-氨基酸的生产通过电穿孔法，将按上述方法获得的质粒转导入到产糖甲基小杆菌菌株NCIMB11375中，并检测所获转化菌株(以下称为NCIMB11375/pRS-lysE564-dapA-Tc)的培养基上清液中L-氨基酸的浓度，使用上述导入了pRS-lysE564-Tc质粒的产糖甲基小杆菌菌株(以下称为NCIMB11375/pRS-lysE564-Tc)和导入了pRK310质粒的产糖甲基小杆菌菌株(以下称为NCIMB11375/pRS310)作为对照。
将每一个转化菌株培养于含有10mg/L四环素的SEII平板上，30℃培养两天。然后从培养基表面刮取10cm2细胞，接种于含有10mg/L四环素的SEII生产培养基上，30℃振荡培养60小时。培养结束后，离心去除培养基表面的细胞，使用氨基酸分析仪来测定培养基上清液中L-氨基酸的浓度。
表4显示了检测结果。在含有导入了NCIMB11375/pRS-lysE564-dapA-Tc质粒的菌株的培养基中，L-赖氨酸大量积聚，且该积聚程度与只导入了pRS-lysE564-Tc的菌株相比有所提高。因此，认为分泌的限速因素由于lysE564基因的导入而被消除，dap*基因的增强效应被展现出来。
表4
以上我们以优选的实施方式详细描述了本发明，对其进行各种修改以及等同手段的替换对于本领域技术人员来讲是显而易见的，并不脱离本发明的保护范围。上述的每篇文献均全文并入本文作为参考，其中包括作为外国优先权文本的JP2002-336315。
序列表解释SEQ ID NO1野生型lysE核苷酸序列SEQ ID NO2野生型lysE氨基酸序列SEQ ID NO3野生型dapA核苷酸序列SEQ ID NO4野生型DDPS氨基酸序列SEQ ID NO5和6用于lysE562点特异突变的引物SEQ ID NO7和8用于tac启动子扩增的引物SEQ ID NO9和10克隆lysE的引物SEQ ID NO11和12克隆dapA*的引物SEQ ID NO13和14扩增四环素抗性基因序列的引物序列表<110>味之素公司<120>用甲基营养菌生产L-氨基酸的方法<130>0P1627<140>
<141>2003-11-<150>JP 2002-336315<151>2002-11-20<160>14<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>711<212>DNA<213>乳发酵短杆菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(711)<400>1atg gtg atc atg gaa atc ttc att aca ggt ctg ctt ttg ggg gcc agt 48Met Val Ile Met Glu Ile Phe Ile Thr Gly Leu Leu Leu Gly Ala Ser1 5 10 15ctt tta ctg tcc atc gga ccg cag aat gta ctg gtg att aaa caa gga 96Leu Leu Leu Ser Ile Gly Pro Gln Asn Val Leu Val Ile Lys Gln Gly20 25 30att aag cgc gaa gga ctc att gcg gtt ctt ctc gtg tgt tta att tct 144Ile Lys Arg Glu Gly Leu Ile Ala Val Leu Leu Val Cys Leu Ile Ser35 40 45gac gtc ttt ttg ttc atc gcc ggc acc ttg ggc gtt gat ctt ttg tcc 192Asp Val Phe Leu Phe Ile Ala Gly Thr Leu Gly Val Asp Leu Leu Ser50 55 60aat gcc gcg ccg atc gtg ctc gat att atg cgc tgg ggt ggc atc gct 240Asn Ala Ala Pro Ile Val Leu Asp Ile Met Arg Trp Gly Gly Ile Ala65 70 75 80tac ctg tta tgg ttt gcc gtc atg gca gcg aaa gac gcc atg aca aac 288
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<221>CDS<222>(272)..(1153)<400>3ccaggcgact gtcttcaata ttacagccgc aactactgac atgacgggtg atggtgttca 60caattccacg gcgatcggca cccaacgcag tgatcaccag ataatgtgtt gcgatgacag 120tgtcaaactg gttattcctt taaggggtga gttgttctta aggaaagcat aaaaaaaaca 180tgcatacaac aatcagaacg gttctgtctg cttgctttta atgccatacc aaacgtacca 240ttgagacact tgtttgcaca gaggatggcc c atg ttc acg gga agt att gtc292Met Phe Thr Gly Ser Ile Val1 5gcg att gtt act ccg atg gat gaa aaa ggt aat gtc tgt cgg gct agc 340Ala Ile Val Thr Pro Met Asp Glu Lys Gly Asn Val Cys Arg Ala Ser10 15 20ttg aaa aaa ctg att gat tat cat gtc gcc agc ggt act tcg gcg atc 388
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<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>8cggatgcatc tagagttaac ctgcagggtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacac58<210>9<211>64<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>人工序列的描述引物<400>14gccgtgttgc taggatggtt gttcttggat ca3权利要求
1.一种编码棒状细菌(coryneform bacterium)LysE蛋白突变体或其同源蛋白的DNA，其特征在于所述突变体或其同源蛋白当被导入甲醇同化细菌时，能够赋予该细菌对L-赖氨酸类似物产生抗生的能力。
2.如权利要求1的DNA，其中所述突变体是一种选自下述的蛋白A)一种具有SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白质，其中至少第56位的甘氨酸残基被其它氨基酸残基取代，或B)一种具有SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白质，其中至少第56位的甘氨酸残基被其它氨基酸残基取代，并且除第56位氨基酸残基以外有一个或者几个氨基酸残基被取代、缺失、插入或者添加，而且当所述突变体被导入甲醇同化细菌时，能够赋予该细菌对L-赖氨酸类似物产生抗性的能力。
3.如权利要求2的DNA，其中所述的DNA选自A)一种具有SEQ ID NO1核苷酸序列的DNA，其中有一个突变导致所编码蛋白质中至少第56位甘氨酸残基被其它氨基酸取代；B)一种在严格条件下能与SEQ ID NO1核苷酸序列杂交的DNA，或者由所述核苷酸序列制备的探针，当所述DNA或者探针被导入甲醇同化细菌时，由它们编码的蛋白质能够赋予该细菌对L-赖氨酸类似物产生抗性的能力。
4.如权利要求2的DNA，其中所述的其它氨基酸残基是丝氨酸残基。
5.如权利要求1的DNA，其中所述的L-赖氨酸类似物是S-(2-氨乙基)半胱氨酸。
6.如权利要求1的DNA，其中所述的甲醇同化细菌是属于嗜甲基菌属或者甲基小杆菌属的细菌。
7.一种属于嗜甲基菌属或者甲基小杆菌属的细菌，该细菌中导入了可表达形式的权利要求1的DNA，该细菌能够生产L-赖氨酸或者L-精氨酸。
8.一种生产L-赖氨酸或者L-精氨酸的方法，包括如下步骤A)在培养基中培养权利要求7的细菌，在培养物中生产并积累L-赖氨酸或者L-精氨酸，和B)从培养物中收集L-赖氨酸或者L-精氨酸。
9.如权利要求8的一种生产L-赖氨酸或者L-精氨酸的方法，其中培养基含有甲醇作为主要碳源。
全文摘要
一种编码来源于棒状细菌lysE蛋白突变体或者相关同源蛋白的DNA，其中所述突变体当被导入一种甲醇同化细菌时能够赋予对L－赖氨酸类似物的抗性。该编码LysE蛋白的突变体或者相关同源蛋白的DNA，当其被导入甲醇同化细菌时能够提高甲醇同化细菌中L－赖氨酸或者L－精氨酸的产率。
文档编号C12N15/31GK1618970SQ20031012045
公开日2005年5月25日 申请日期2003年11月20日 优先权日2002年11月20日
发明者郡司义哉, 安枝寿 申请人:味之素株式会社