专利名称：一种防控香蕉枯萎病的甲基营养型芽孢杆菌菌株4-l-16及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种防治香蕉枯萎病的菌株及其应用，具体涉及一种防控香蕉枯萎病的甲基营养型芽孢杆菌菌株4-L-16及其应用。
背景技术：
香蕉枯萎病是由尖胞镰刀菌古巴 专化型(Fusarium oxysporium f. sp.CUbenSe，F0C)病原真菌引起的毁灭性土传病害，自1874年首次在澳大利亚发现以来，曾于1896年在巴拿马造成大面积危害，之后逐渐传至世界各地，是至今无法解决的世界科技难题。目前，在我国广东、海南、广西、云南和福建等香蕉主产区，香蕉枯萎病是由FOC的4号生理小种引起的，粉蕉枯萎病是由FOC的I号生理小种引起的，发病蕉园发病率一般在30-50%，重病区可达90%以上，导致香蕉减产、甚至绝收，是香蕉生产上的一个主要限制因子。迄今对该香蕉枯萎病尚无理想的抗病品种和化学药剂，因此，结合栽培措施，施用对该病具有拮抗效果的微生物菌株，从而抑制土壤香蕉枯萎病数量，改变土壤的微生物生态结构，促进香蕉生长，提高香蕉广谱抗病性，成为一种理想的生物防治措施。目前拮抗菌来源是通过土壤、植株本身微生物的分离与筛选得到，这种方法得到拮抗微生物通常存在定植能力弱、繁殖系数低、拮抗菌抗菌谱较窄等缺点。特别是土壤中分离得到的拮抗菌往往不能在植株体内大量定植，防控效果不显著。因此采用其他途径获得易于繁殖，抗菌范围广的拮抗菌尤为重要。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题在于提供一种防控香蕉枯萎病的甲基营养型芽孢杆菌菌株4-L-16，该菌株分离自有机质与红糖水的发酵液中，易于定植繁殖，抗菌范围广泛，对香蕉枯萎病I号、4号生理小种及其它香蕉常见病种如香蕉长形叶斑病菌、香蕉炭疽病菌、香蕉大灰斑病菌、芒果链格孢霉叶斑病菌、荔枝炭疽菌、芒果炭疽菌等多种病原菌均具有较强的拮抗作用。本发明所要解决的第二个技术问题在于提供上述防控香蕉枯萎病的甲基营养型芽孢杆菌菌株4-L-16在制备具有防控香蕉枯萎病作用的药物中的用途。本发明所要解决的第三个技术问题在于提供一种防控香蕉枯萎病的制剂，该制剂含有上述防控香蕉枯萎病的甲基营养型芽孢杆菌菌株4-L-16,该制剂对香蕉枯萎病I号、4号生理小种及其它香蕉常见病种如香蕉长形叶斑病菌、香蕉炭疽病菌、香蕉大灰斑病菌、芒果链格孢霉叶斑病菌、荔枝炭疽菌、芒果炭疽菌等多种病原菌具有更好的拮抗作用，同时还对植株生长具有促生作用。本发明最后要解决的技术问题是在于提供上述防控香蕉枯萎病制剂的制备方法。本发明的所要解决的第一个技术问题是通过如下技术方案来实现的一种防控香蕉枯萎病的甲基营养型芽孢杆菌菌株4-L-16，该菌株的保藏名称为甲基营养型芽孢杆菌4-L-16,分类命名为Bacillus methylotrophicus4-L_16,保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年6月26日，保藏号为CCTCC N0:M2012248。本发明中的防控香蕉枯萎病的甲基营养型芽孢杆菌菌株4-L-16是采用平板稀释涂布法分离自培养基质饼肥、红糖和水的混合发酵液，并经平板对峙培养法筛选获得，其中饼肥优选为花生饼、菜籽饼和豆饼中的一种或几种，具体分离筛选过程可以参阅下文具体实施例中的描述。本发明的第二个技术问题是通过如下技术方案来实现的上述防控香蕉枯萎病的甲基营养型芽孢杆菌菌株4-L-16在制备具有防控香蕉枯萎病作用的药物中的用途。该药物不仅对香蕉枯萎病菌I号、4号生理小种的平板拮抗作用；对香蕉长形叶斑病菌、香蕉炭疽病菌、香蕉大灰斑病菌、芒果链格孢霉叶斑病菌、荔枝炭疽菌、芒果炭疽菌等多种病原菌的也具有拮抗作用。 本发明的第三个技术问题是通过如下技术方案来实现的一种防控香蕉枯萎病的制剂，含有上述防控香蕉枯萎病的甲基营养型芽孢杆菌菌株4-L-16。作为本发明的一种改进本发明所述的防控香蕉枯萎病的制剂，还含有培养基质饼肥、红糖和水，其中饼肥和红糖的总重量与水的总重量比为1:4，培养基质的C/N比为15 25 :1。所述的饼肥优选自花生饼、豆饼和菜籽饼中的一种或几种。本发明的最后一个技术问题是通过如下技术方案来实现的上述防控香蕉枯萎病制剂的制备方法，含以下步骤(I)将红糖溶于水中得红糖水，将饼肥置于可透气性包装体内并将置于可透气性包装体内的饼肥置于红糖水中或直接将饼肥溶于红糖水中，调节PH值为6 8，置于阴凉通风处，密封保存，得含饼肥的红糖水溶液；(2)将含饼肥的红糖水溶液和权利要求I中所述的防控香蕉枯萎病的甲基营养型芽孢杆菌菌株4-L-16在25 3(TC条件下发酵7 15天，并不时搅拌保持通气至完成发酵过程，得红褐色溶液，过滤即得含多种微生物的抗香蕉枯萎病发酵液。本发明步骤(2)中所述的含饼肥的红糖水溶液和防控香蕉枯萎病的甲基营养型芽孢杆菌菌株4-L-16的体积比优选为8 12: I。与现有技术相比，本发明具有如下优点(I)本发明首次利用培养基质饼肥、红糖和水等原料按照优化配方直接液体发酵，通过对发酵液中产生的微生物进行分离，筛选得到一株对香蕉枯萎病I号、4号生理小种及其他多种病原菌均具有较好拮抗效果的甲基营养型芽孢杆菌4-L-16 ；(2)由于菌株来源于生物发酵产生，易于定植繁殖，能够有效抑制香蕉枯萎病菌I号、4号生理小种及其它香蕉常见病种的生长，环境安全性好，对香蕉枯萎病防控具有重要意义；(3)将本发明中的甲基营养型芽孢杆菌4-L-16与其它有机质一起制成微生物制齐U，对香蕉枯萎病I号、4号生理小种及其他多种病原菌具有更好的拮抗效果，同时还对植株生长具有促生作用；(4)同时本发明中的防控香蕉枯萎病的菌株4-L-16菌株培养条件简单，繁殖速度快，易于保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。
图I是实施例2中4-L-16菌株对尖孢镰刀菌I号生理小种的拮抗效果；图2是实施例2中4-L-16菌株对尖孢镰刀菌4号生理小种的拮抗效果；图3是实施例2中4-L-16菌株对香蕉长形叶斑病菌、芒果链格孢霉叶斑病菌、香蕉大灰叶斑病菌、荔枝炭疽菌、芒果炭疽菌和香蕉 炭疽菌的抑菌效果图，其中A代表香蕉长形叶斑病菌；B代表芒果链格孢霉叶斑病菌；C代表香蕉大灰叶斑病菌；D代表荔枝炭疽菌；E代表芒果炭疽菌；F代表香蕉炭疽菌；图4是实施例3中含甲基营养型芽孢杆菌4-L-16微生物菌剂对粉蕉苗期枯萎病的防控效果图；图5是实施例4中含甲基营养型芽孢杆菌4-L-16微生物菌剂对巴西蕉苗期枯萎病的防控效果图。
具体实施例方式实施例I菌株的来源、分离和鉴定该菌株由菜籽饼、红糖和水发酵液中分离得到，具体发酵液的制备方法如下将红糖155g溶于IOOOmL水中，将菜籽饼95g溶于红糖水中，调节红糖水的pH值为7.0，置于阴凉透风处，密封保存，得含饼肥的红糖水溶液；将含饼肥的红糖水溶液置于5L容量瓶中，在180rpm，3(TC条件下，震荡培养7天，过滤得红褐色溶液剂为发酵完成的发酵液。I.发酵液中拮抗菌的分离、初筛采用平板稀释涂布法，稀释度(10—1 10_3)，采用PDA培养基对真菌的进行分离；LB培养基对细菌的进行分离；高氏一号培养基对放线菌的进行分离，分离前加入质量百分含量为3%重铬酸钾抑制细菌、真菌的生长。用移液枪分别吸取上述不同稀释度的溶液100 μ L，滴加于培养基平板上，用L型玻棒涂布均匀，稍晾干，倒置培养皿，于25 28°C温箱中培养3天，根据平板上长出的菌落的颜色、形态、大小等，将不同的真菌、细菌和放线菌的单菌落挑出到新的培养基上纯化培养，细菌、放线菌用LB培养基培养、真菌用PDA培养基培养。采用平板对峙培养法初筛拮抗菌株，初筛共获得28株拮抗菌，将菌种冻干_20°C保存，用于进一步筛选。2.发酵液中拮抗菌的复筛采用平板对峙培养法，分别检测初筛后的拮抗菌对尖孢镰刀菌I号生理小种和4号生理小种的抑菌活性，以拮抗菌株与病原菌之间的抑菌带宽度(cm)作为拮抗作用强弱的指标。将待测拮抗菌株在28°C培养箱中培养72小时后，在马铃薯葡萄糖培养基平板中央接入5mm的F0C1/F0C4菌丝块，在距离F0C1/F0C4菌丝块四周2. 5cm处，接种待测拮抗菌5 μ L，置于28°C培养箱培养，以只接种病原菌为对照，待对照刚长满培养皿时。测量拮抗菌株与病原菌之间的抑菌带宽度(cm)作为拮抗作用强弱的指标。最终筛选得到对FOCl和F0C4病原菌均有较好拮抗效果的菌株4_L_16。
3.拮抗菌的鉴定甲基营养型芽孢杆菌4-L-16的主要生物学特性为该菌为革兰氏阳性菌，培养条件为LB培养基，37 °C，pH7. O。检测16sRNA序列，并将序列在线提交到GENBANK上进行 BLAST 比对，发现其于 Bacillus amyIoliquefaciens subsp. Plantarum 和 Bacillusmethylotrophicus两种菌的相似度菌达到99. 859 再经生理生化鉴定最终确定,该菌为Bacillus methylotrophicus,其 16sRNA 序列可以参阅序列表 SEQ ID NO :1 所不。表I菌株4-L-16表型及生理生化特性-酶活、碳源同化
权利要求
1.一种防控香蕉枯萎病的甲基营养型芽孢杆菌菌株4-L-16，其特征是该菌株的保藏名称为甲基营养型芽抱杆菌4-L-16,分类命名为Bacillus methylotrophicus4-L-16,保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年6月26日，保藏号为CCTCCN0:M2012248。
2.权利要求I所述的防控香蕉枯萎病的甲基营养型芽孢杆菌菌株4-L-16在制备具有防控香蕉枯萎病作用的药物中的用途。
3.—种防控香蕉枯萎病的制剂，其特征是含有权利要求I中所述的防控香蕉枯萎病的甲基营养型芽孢杆菌菌株4-L-16。
4.根据权利要求3所述的防控香蕉枯萎病的制剂，其特征是还含有培养基质饼肥、红糖和水，其中饼肥和红糖的总重量与水的总重量比为1:4，培养基质的C/N比为15 25 :1。
5.根据权利要求4所述的防控香蕉枯萎病的制剂，其特征是所述的饼肥为菜籽饼、花生饼和豆饼中ー种或几种。
6.权利要求4或5所述的防控香蕉枯萎病的制剂的制备方法，其特征是含以下步骤 (1)将红糖溶于水中得红糖水，将饼肥置于可透气性包装体内并将置于可透气性包装体内的饼肥置于红糖水中或直接将饼肥溶于红糖水中，调节PH值为6 8，置于阴凉通风处，密封保存，得含饼肥的红糖水溶液； (2)将含饼肥的红糖水溶液和防控香蕉枯萎病的甲基营养型芽孢杆菌菌株4-L-16在25 30°C条件下发酵7 15天，并不时搅拌保持通气至完成发酵过程，得红褐色溶液，过滤即得含多种微生物的抗香蕉枯萎病发酵液。
7.根据权利要求6所述的防控香蕉枯萎病的制剂的制备方法，其特征是步骤(2)中所述含饼肥的红糖水溶液与防控香蕉枯萎病的甲基营养型芽孢杆菌菌株4-L-16的体积比为8 12:1。
全文摘要
本发明公开了一种防控香蕉枯萎病的甲基营养型芽孢杆菌菌株4-L-16，该菌株的保藏名称为甲基营养型芽孢杆菌4-L-16，分类命名为Bacillus methylotrophicus4-L-16，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年6月26日，保藏号为CCTCC NO:M2012248。该菌株对香蕉枯萎病1号、4号生理小种及其它香蕉常见病种均具有较强的拮抗作用。还公开了该菌株在制备具有防控香蕉枯萎病作用的药物中的用途以及含该菌株的微生物制剂，该微生物制剂不仅对多种香蕉病原菌具有更好的拮抗作用，还对植株生长具有促进作用。
文档编号A01P3/00GK102787084SQ20121024723
公开日2012年11月21日 申请日期2012年7月17日 优先权日2012年7月17日
发明者井涛, 刘小玉, 周登博, 张锡炎, 甘东泉, 谭昕, 赵炎坤, 高祝芬, 黄霄 申请人:中国热带农业科学院热带生物技术研究所