一种检测玉米细菌性枯萎病菌的双抗体夹心酶联免疫法
【专利摘要】一种检测玉米细菌性枯萎病菌的双抗体夹心酶联免疫法，属于免疫分析领域。本发明用玉米细菌性枯萎病菌NCPPB449（来自湖南省进出口检验检疫局）免疫BALB/c小鼠，经免疫、融合、筛选得5株玉米细菌性枯萎病菌单抗。5株抗体分别标记HRP并以该菌体进行两两配对。以11C2（单克隆细胞株H号）为包被抗体，10B1（单克隆细胞株I号）为酶标抗体，以NCPPB449菌体为标准品建立夹心ELISA法。LOD为1.5×104cfu/mL，线性范围4.57×105~1.11×108cfu/mL。本发明用理化性质高度均一、特异性好、可大量制备的单克隆抗体，建立的夹心法灵敏度高，成本低，与丁香假单胞杆菌斑点致病变种等无交叉反应，为玉米种子中玉米细菌性枯萎病菌的检测提供了快速高效的分析手段。
CGMCC No.9308
2014.05.28
CGMCC No.9309
2014.05.28
【专利说明】-种检测玉米细菌性枯萎病菌的双抗体夹心酶联免疫法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及了一种定量检测玉米种子中玉米细菌性枯萎病菌的双抗体夹也法，属 于免疫分析领域。
【背景技术】
[0002] 玉米细菌性枯萎病（沉6?3扣'5 ifecteriay 〇/仿/77)是玉米上的一种 毁灭性的病害，我国尚无该病害发生。其病原菌玉米细菌性枯萎病菌，学名： Stewartii Dye，劳名-.Pawpaw Stewaritii subsp. Stewartii。三巨文!乏绅5lift生本古^巧寿胃（/?占） 属于肠杆菌科多源菌属，是一种黄色、不运动、无内生抱子、革兰氏阴性兼性厌氧杆菌，可W 引起玉米细菌性枯萎病。1897年首次发现于美国纽约长岛，之后传播到世界其他地区。目 前已知发生地区有加拿大、墨西哥、己西、秘鲁、圭亚那、意大利、波兰、罗马尼亚、南斯拉夫、 泰国、越南、马来西亚等。玉米细菌性枯萎病菌可W通过带菌种子远距离传播(种传)，在病 区则W昆虫传播为主，如玉米跳甲等，玉米在生长的各个阶段均能被玉米细菌性枯萎病菌 进行侵染。在国际贸易中，带菌种子是该病远距离传播的主要因素，是传入无病区的主要侵 染源。我国目前尚未发现玉米细菌性枯萎病的发生，但传入风险很高，已经列为我国进境一 类检疫对象，只有证实未染菌的玉米产品才可W入境。在1992年农业部颁布的《中华人民 共和国进境植物检疫危险性病、虫、杂草名录》中，被列为一类危险性有害生物。
[0003] 对玉米细菌性枯萎病菌的检测诊断方法包括野外观察、生理生化鉴定、免疫学检 测和鉴定、W及PCR检测技术，环介导等温扩增（LAMP)技术和生物传感技术也被用来检测 玉米细菌性枯萎病菌。但生化检测技术耗时过长，且检测结果存在不可靠性。PCR检测技术 相比具有很好的灵敏性与准确性，但由于依赖于昂贵的仪器和专业的检测人员，不适用于 大量产品的快速检测。ELISA检测技术依赖于高度特异性与灵敏性的抗体，在检测灵敏度上 虽然不如PCR方法，但是由于检测快速、批量、便宜，因此十分适合于大批量样品的粗筛检 测。
[0004] 由于玉米细菌性枯萎病菌会对农业带来巨大威胁与损失，因此快速准确的检测方 法显得尤为重要。ELISA凭借其灵敏、快速、特异性好、易于推广的特点成为致病菌的常规检 测方法。抗体的亲和力、交叉反应、稳定性对于化ISA方法的灵敏度和特异性有着关键性的 决定作用。
[0005] 因此，本发明制备了高灵敏的玉米细菌性枯萎病菌的单克隆抗体并W此为基础建 立了双抗体夹也化ISA法，对玉米种子中玉米细菌性枯萎病菌进行了检测，为玉米细菌性 枯萎病菌的大批量、快速、准确的检测奠定基础。
【发明内容】
[0006] (一）要解决的技术问题 本发明的目的在于建立一种具有高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度、操作方法 简单的酶联免疫吸附检测方法，用于玉米种子中玉米细菌性枯萎病菌的大批量、快速、准确 检测。
[0007] (二）技术方案 为实现上述目的，本发明建立了一种基于单克隆抗体的检测玉米种子中玉米细菌性枯 萎病菌的双抗体夹也酶联免疫法，该方法包括对检测方法的优化。
[0008] ( 1)玉米细菌性枯萎病菌单克隆抗体的制备 单克隆抗体是采用玉米细菌性枯萎病菌（NCPPB 449,来自湖南省进出口检验检疫局） 菌体经过特定免疫程序免疫BALB/c小鼠，经杂交瘤技术融合、筛选得到的。玉米细菌性枯 萎病菌NCPPB 449菌体做为免疫原，免疫8周龄的BALB/c小鼠，免疫程序如下：第一周进 行首免，1 X IO8C化玉米细菌性枯萎病菌NCPPB 449菌体/只，弗氏完全佐剂乳化后皮下多 点注射；第四周进行二免，IX IO8C化玉米细菌性枯萎病菌NCPPB 449菌体/只，弗氏不完全 佐剂乳化后皮下多点注射；第六周进行H免，1 X IO7 C化玉米细菌性枯萎病菌NCPPB 449菌 体/只，弗氏不完全佐剂乳化后皮下多点注射；第走周尾部采血测效价，分别挑选对玉米细 菌性枯萎病菌NCPPB 449菌体效价最高的老鼠；第九周进行冲刺免疫，1 X IO7C化玉米细菌 性枯萎病菌NCPPB 449菌体/只，生理盐水溶解，腹腔注射；冲刺免疫3天后分别眼眶采血 后进行融合、筛选，共筛选到5个细胞株。
[0009] (2)单克隆抗体的配对筛选 将纯化后的5株单克隆抗体分别标记辣根过氧化物酶HRP，直接法鉴定标记成功后进 行夹也法配对；配对参数如下：包被抗体2 y g/mL ;包被液为0. 01M、pH9. 6的碳酸盐缓冲 液；标品浓度1 X IO8C化/mL ;标品稀释液0. 01M、抑7. 2的PBS ;酶标抗体稀释500倍使用； 在此条件下，实验成功得到了 5对P/N值巧的配对； 用于配对的抗体是通过优化参数下夹也法配对，并通过多次试验筛选确定的，具有稳 定性好、灵敏度高的特点。
[0010] (3)夹也法的建立 选择检测限稳定、灵敏的配对，即W单克隆细胞株H号（11C2)为包被抗体，单克隆细胞 株I号（IOBl)作为酶标抗体建立夹也法；具体参数如下： 包被抗体浓度；2 U g/mL 包被液；〇. 01M、pH 9. 6碳酸盐缓冲液 标品稀释液；〇. 01M、pH7. 2 PBS+0. 2%Tween 酶标抗体浓度；2. 5 y g/mL 反应时间：包被抗体：封闭37°C，2h ;标准品；37°C，lh ;酶标抗体；37°C，lh ;显色 IOmin ； 优化后玉米细菌性枯萎病菌夹也法的LOD ;1. 5 X IO4 C化/mL。
[0011] 建立的夹也法优化了包被抗体的浓度，包被液，封闭液，标准品稀释液，酶标抗体 稀释液，酶标抗体稀释浓度。LOD达到了 1.5 X 1〇4 C化/mL。
[0012] 本发明方法的检测分析原理是： 酶标板上包被了捕获抗体11C2,合适的浓度下可W最大限度捕获玉米细菌性枯萎病 菌；洗板3次，洗去未结合的抗体，加入封闭液220UL封闭板孔上多余结合位点；洗板3次， 加入样品和对照，37°C赔育Ih ;洗板3次，加入酶标抗体10B1-HRP，37°C赔育Ih ;洗板4次， 加入显色液显色12min。如果样品有足够的玉米细菌性枯萎病菌，那么玉米细菌性枯萎病 菌被捕获抗体11C2捕获并与酶标抗体lOBl-HRP结合，并催化底物在450nm产生吸收值（P/ N > 2. 1)，并被判定为阳性；如果样品中玉米细菌性枯萎病菌浓度太低（P/N《2. 1)那么样 品不被捕获或者捕获数量太小不足W引起足够的信号，被判定为阴性。
[001引（S)有益效果 本发明提供的玉米细菌性枯萎病菌双抗体夹也检测方法采用了理化性质高度均一、特 异性好、可W大量制备的玉米细菌性枯萎病菌单克隆抗体，建立的夹也法灵敏度高，稳定性 好、成本低，样品的前处理过程简单，能同时检测大量样品，适合食品行业大规模、高通量、 快速、灵敏的检测要求，具有推广和应用价值。
[0014] 生物材料样品保藏；一株单克隆细胞株H号（又称11C2)，已保藏于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中也，简称CGMCC，地址；北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 中国科学院微生物研究所，保臧日期2014年5月28日，保臧编号为CGMCC No. 9308。
[0015] 一株单克隆细胞株I号(又称IOBl)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中也，简称CGMCC，地址；北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研 究所，保藏日期2014年5月28日，保藏编号为CGMCC No. 9309。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1玉米细菌性枯萎病菌双抗体夹也法的标准曲线。
[0017] 图2.玉米细菌性枯萎病菌双抗体夹也化ISA特异性 1、下香假单胞杆菌斑点致病变种；2、水稻白叶枯病菌；3、水稻细菌性谷枯病菌；4、水 稻细菌性条斑病菌；5、玉米细菌性枯萎病菌；6、下香假单胞菌下香致病变种。 具体实施方案
[0018] W下通过实施例进一步说明本发明。
[001引一、仪器： TCL - 40B台式低速离也机，上海安亭科学仪器厂 KFLOW纯水机，凯佛隆公司 ZD - 9556水平摇床，太仓科教器材厂 96孔8X 12可拆酶标板，厦口怡佳美实验器材有限公司 MuLtiska Mks 酶标仪，Thermo L油systems 公司 可调试移液器，Thermo L油systems公司 润旋混合器，上海沪西仪器分析厂 二、试剂： 四甲基联苯胺（TMB)，上海晶纯实业有限公司 其他试剂均为分析纯试剂 H、 步骤 (一）单抗制备 I、 抗原配置：将免疫原(玉米细菌性枯萎病菌NCPPB 449)用生理盐水稀释，配成IX 109 CFU/mL的溶液； 2、乳化；将上述溶液与等量完全或不完全福氏佐剂用混合揽拌法将其乳化，乳化完全 后皮下多点注射小鼠； 3、 免疫；按照特定免疫流程免疫小鼠，3免后用间接竞争法测定效价，效价达到要求 后，进行冲刺免疫；冲免3天后眼眶采血后进行融合； 4、 采血；第H次免疫后1周进行断尾采血，采用间接非竞争酶联免疫法测定抗血清效 价； 5、 融合、筛选：采用杂交瘤技术进行融合，采用间接Elisa筛选阳性细胞孔，采用有限 稀释法对阳性孔进行亚克隆； 6、 抗体的纯化和保存；采用辛酸-饱和硫酸馈法纯化腹水，透析后得到单克隆抗体，采 用微量紫外方法测定其浓度后分装后放入-2(TC保存。
[0020] (二）ELISA 反应过程： 抗体效价测定步骤： 1、 将包被原用包被缓冲液作系列稀释包被96孔酶标板，100 UL/孔，于4 C冰箱过 夜；次日取出酶标板回至室温，每孔注入200 Ul PBST溶液，摇床上振荡3 min,用力甩掉 洗涂液，在吸水纸上拍干，继续洗涂2次。W下洗涂方法相同； 2、 充分洗涂后，用封闭缓冲液封闭酶标板，220 y L/孔，于37C温育箱内温育2 h后取 出烘干待用； 3、 将阳性血清系列稀释对应加入到酶标板的前7行列，第8行加入阴性血清，100 y L/ 孔，37C赔育1 h后洗涂、拍干； 4、 每孔加入100 U L 1:3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，37°C赔育1 h后洗涂、拍 干； 5、 每孔加入100 U L显色液（TMB与底物液比例为1:5)，暗处37C反应15 min,取出后 每孔加入50 y L终止液（2 mol/L的硫酸)，用酶标仪测定吸光值A4W。
[0021] 玉米细菌性枯萎病菌双抗体夹也法测定步骤： a、 包被；用2 y g/血的11C2包被酶标板，100 y L /孔，4°C过夜； b、 洗涂；用PBST洗涂反应板H次，每次3min，200 y L /孔，然后甩干反应板； C、封闭；含0. 2%明胶的CBS, 220 y L /孔.37°C封闭化； d、 洗涂；同b ; e、 样品；用PBST将玉米细菌性枯萎病菌稀释成1.0Xl〇9、3. 33X 108、1. llXl〇8、 3. 70X107、1.23X107、4. llXl〇6、1.37X 106、4. 57X 105、1.52X 105 cfu/mL 系列浓 度，另设一个PBST空白对照。每孔加入100 y L样品，于37°C温育Ih ; f、 洗涂；同b ; g、 加酶标抗体（10B1-HRP，2. 5yg/mL)，100yL / 孔，37°C反应比； K洗涂；同b ; i、 显色：加底物TMBlOOy L /孔，显色IOmin ; j、 终止；加终止液50y L /孔； k、 测定；用酶标仪检测0〇4加111。
[002引交叉率的测定 将下香假单胞杆菌斑点致病变种，水稻白叶枯病菌，水稻细菌性谷枯病菌，水稻细菌性 条斑病菌，下香假单胞菌下香致病变种精确稀释成IX 108 C化/111以在建立的玉米细菌性枯 萎病菌双抗体夹也法体系中检测吸光值，并设空白孔和玉米细菌性枯萎病菌阳性对照，每 个浓度做6次测定平均值，做3次重复实验。
[0023] 玉米种子实际样品的检测 取500g超市购买的玉米种子，使用0. 5%的化OCl溶液浸泡5?15min进行表面消毒， 然后使用无菌生理盐水冲洗3次，无菌条件下瞭干。表面消毒后的检验样品粉碎，适量无 菌生理盐水室温4C条件浸泡过夜。浸泡液转移至离也管中4000 rpm/min条件下离也10 分钟，弃去沉淀，上清液转入另外离也管10, 000 rpm/mim条件下离也15 min,弃去上清液， 加2血生理盐水使之息浮，得到息液。使用国标免疫分离方法验证息液为阴性样品，即取 用的玉米种子未被玉米细菌性枯萎病菌感染。在息液中添加不同浓度玉米细菌性枯萎病菌 IXlO 6，5X IO6 ,IXlO7 C化/血）作为阳性质控，使用息液作为阴性质控，每个浓度做3个 重复。
[0024] 试验结果如下： 1、标准曲线；本发明所获得的抗原检测的检测范围为4.57X 105^1. llXl〇8c化/111以具 体请见说明书附图1。
[0025] 2、LOD =LOD是空白的平均吸收值加3倍的空白吸收值的标准偏差对应的抗原浓 度，玉米细菌性枯萎病菌双抗体夹也法LOD为1. 5 X IO4C化/血。
[002引 3、交叉反应率（CRo/o) 结果；玉米细菌性枯萎病菌正常显色，而IX 108 C化/mL浓度下的其它测试菌株均为阴 性（P/N<2. 1)。说明建立的玉米细菌性枯萎病菌夹也法与下香假单胞杆菌斑点致病变种，水 稻白叶枯病菌，水稻细菌性谷枯病菌，水稻细菌性条斑病菌，下香假单胞菌下香致病变种无 交叉反应，具体请见说明书附图2。
[0027] 4、玉米种子实际样品的检测 结果；在玉米种子样品的检测中，对玉米细菌性枯萎病菌的回收率为85. 6%、0. 2%，相 对标准偏差低于5. 0%。显示出所建立的双抗体夹也化ISA方法在实际样品检测中具有较好 的准确性与稳定性，具体请见附表1。
[0028] 表1.双抗体夹也化ISA对玉米种子中玉米细菌性枯萎病菌的检测结果（n=3)
【权利要求】
1. 一种基于单克隆抗体的检测玉米种子中玉米细菌性枯萎病菌的双抗体夹心酶联免 疫法，其特征在于 (1) 玉米细菌性枯萎病菌单克隆抗体的制备 单克隆抗体是采用玉米细菌性枯萎病菌NCPPB 449菌体经过特定免疫程序免疫BALB/ c小鼠，经杂交瘤技术融合、筛选得到的； (2) 单克隆抗体的配对筛选 将纯化后的5株单克隆抗体分别标记辣根过氧化物酶HRP，直接法鉴定标记成功后进 行夹心法配对；配对参数如下：包被抗体2 μ g/mL ;包被液为0. 01M、pH9. 6的碳酸盐缓冲 液；标品浓度1 X 108cfu/mL ;标品稀释液0. 01M、pH7. 2的PBS ;酶标抗体稀释500倍使用； 在此条件下，实验成功得到了 5对P/N值>5的配对； (3) 夹心法的建立 选择检测限稳定、灵敏的配对，即以单克隆细胞株Η号为包被抗体，单克隆细胞株I号 作为酶标抗体建立夹心法；具体参数如下： 包被抗体浓度：2 μ g/mL 包被液：〇. 01M、pH 9. 6碳酸盐缓冲液 标品稀释液：〇· 〇1Μ、ρΗ7· 2 PBS+0. 2%Tween 酶标抗体浓度：2. 5 μ g/mL 反应时间：包被抗体：封闭37°C，2h ;标准品：37°C，lh ;酶标抗体：37°C，lh ;显色 lOmin ； 优化后玉米细菌性枯萎病菌夹心法的LOD :1. 5Χ 104 cfu/mL。
【文档编号】G01N33/577GK104237519SQ201410510809
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月29日 优先权日:2014年9月29日
【发明者】匡华, 孔德昭, 胥传来, 徐丽广, 马伟, 刘丽强, 宋珊珊, 吴晓玲 申请人:江南大学