专利名称:一种玉米细菌性枯萎病菌的免疫胶体金快速检测试纸条的制作方法
【专利摘要】本实用新型涉及一种玉米细菌性枯萎病菌的免疫胶体金快速检测试纸条，属于免疫检测【技术领域】。该试纸条由PVC底板、样品垫、涂覆金标标记抗玉米细菌性枯萎病菌抗体（12B4）的金标垫、在检测线包被有抗玉米细菌性枯萎病菌抗体（10B1）和在质控线包被有羊抗鼠IgG的硝酸纤维素膜、及吸水垫构成；依次按样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫粘附在PVC底板上。该试纸条操作简便、快速、准确，全过程只需5min，不受环境条件的干扰，特异性好，检测灵敏度高，最低检测限为1×105cfu/mL。本实用新型适用于海关、粮仓、企业、检验检疫单位等，可实现粮食或种子样本中玉米细菌性枯萎病菌的快速检测。
【专利说明】一种玉米细菌性枯萎病菌的免疫胶体金快速检测试纸条
【技术领域】
[0001]本实用新型涉及了一种玉米细菌性枯萎病菌的免疫胶体金快速检测试纸条，可以实现玉米细菌性枯萎病菌的快速检测，适用于大量样品的现场检测、进出口粮食的快速检测与应急处理，属于免疫检测【技术领域】。
【背景技术】
[0002]玉米细菌性枯萎病(7 5.Bacterial Wilt of Cbr/?)是玉米上的一种毁灭性的病害，我国尚无该病害发生。玉米细菌性枯萎病菌(/^s)属于肠杆菌科多源菌属，是一种黄色、不运动、无内生孢子、革兰氏阴性兼性厌氧杆菌，可以引起玉米细菌性枯萎病。1897年首次发现于美国纽约长岛，之后传播到世界其他地区。目前已知发生地区有加拿大、墨西哥、巴西、秘鲁、圭亚那、意大利、波兰、罗马尼亚、南斯拉夫、泰国、越南、马来西亚等。玉米细菌性枯萎病菌可以通过带菌种子远距离传播(种传)，在病区则以昆虫传播为主，如玉米跳甲等，玉米在生长的各个阶段均能被玉米细菌性枯萎病菌进行侵染。在国际贸易中，带菌种子是该病远距离传播的主要因素，是传入无病区的主要侵染源。我国目前尚未发现玉米细菌性枯萎病的发生，但传入风险很高，已经列为我国进境一类检疫对象，只有证实未染菌的玉米产品才可以入境。在1992年农业部颁布的《中华人民共和国进境植物检疫危险性病、虫、杂草名录》中，被列为一类危险性有害生物。
[0003]对玉米细菌性枯萎病菌的检测诊断方法包括野外观察、生理生化鉴定、免疫学检测和鉴定、以及PCR检测技术，环介导等温扩增(LAMP)技术和生物传感技术也被用来检测玉米细菌性枯萎病菌。但生化检测技术耗时过长，且检测结果存在不可靠性。PCR检测技术相比具有很好的灵敏性与准确性，但由于依赖于昂贵的仪器和专业的检测人员，不适用于大量产品的快速检测。ELISA检测技术在检测灵敏度上虽然不如PCR方法，但是具有检测快速、批量、便宜的优势。而胶体金试纸条具有操作简单、稳定性高、不需要借助专门仪器、适合现场快速检测的优点。
[0004]由于玉米细菌性枯萎病菌会对农业带来巨大威胁与损失，因此快速准确的检测方法显得尤为重要。
实用新型内容
[0005]本实用新型目的在于提供一种检测玉米细菌性枯萎病菌的免疫胶体金快速检测试纸条，操作简单，快速方便，灵敏度高，稳定性好，成本低廉。
[0006]本实用新型适用于海关、粮仓、企业、检验检疫单位等，可实现大量粮食或种子样本中玉米细菌性枯萎病菌的快速检测。
[0007]本实用新型的技术方案，一种玉米细菌性枯萎病菌的免疫胶体金快速检测试纸条，包括PVC底板，在PVC底板两端分别设有样品垫和吸水垫；
[0008]在PVC底板中部设置有硝酸纤维素膜检测层，在硝酸纤维素膜检测层与样品垫之间设置有金标垫；所述金标垫一端与样品垫相连接叠放，金标垫另一端叠放于硝酸纤维素膜检测层上；
[0009]所述硝酸纤维素膜检测层上依次设置有检测线和质控线。
[0010]所述金标垫上包被有金标标记抗玉米细菌性枯萎病菌抗体(12B4)；
[0011]所述检测线上包被有抗玉米细菌性枯萎病菌抗体(10B1)；
[0012]所述质控线上包被有羊抗鼠IgG。
[0013]所述玉米细菌性枯萎病菌的免疫胶体金快速检测试纸条的制备方法，步骤如下:
[0014](I)玉米细菌性枯萎病菌单克隆抗体的制备
[0015]单克隆抗体是采用玉米细菌性枯萎病菌(NCPPB 449，来自湖南省进出口检验检疫局)菌体经过特定免疫程序免疫BALB/c小鼠，经杂交瘤技术融合、筛选得到的。玉米细菌性枯萎病菌NCPPB 449菌体做为免疫原，免疫8周龄的BALB/c小鼠，免疫程序如下:第一周进行首免，I X 18Cfu玉米细菌性枯萎病菌NCPPB 449菌体/只，弗氏完全佐剂乳化后皮下多点注射；第四周进行二免，IX 18Cfu玉米细菌性枯萎病菌NCPPB 449菌体/只，弗氏不完全佐剂乳化后皮下多点注射；第六周进行三免，I X 17 cfu玉米细菌性枯萎病菌NCPPB 449菌体/只，弗氏不完全佐剂乳化后皮下多点注射；第七周尾部采血测效价，分别挑选对玉米细菌性枯萎病菌NCPPB 449菌体效价最高的老鼠；第九周进行冲刺免疫，I X 17Cfu玉米细菌性枯萎病菌NCPPB 449菌体/只，生理盐水溶解，腹腔注射；冲刺免疫3天后分别眼眶采血后进行融合、筛选，共筛选到5个细胞株；
[0016](2)单克隆抗体的配对筛选
[0017]将步骤(I)中纯化后的5株单克隆抗体分别标记辣根过氧化物酶HRP，直接法鉴定标记成功后进行夹心法配对，确定特异性免疫胶体金快速检测试纸条所需要的抗玉米细菌性枯萎病菌抗体；其中12B4为金标抗体，1Bl为包被抗体；
[0018](3)玉米细菌性枯萎病菌的免疫胶体金快速检测试纸条的制备:
[0019]a、空白胶体金的制备:
[0020]采用柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒，在锥形瓶中加入200mL去离子水和2mL 1%氯金酸，搅拌加热至沸腾，快速加入4mL 1%朽1檬酸钠,继续加热15~20min,至呈亮红色,然后室温中冷却，4 C冷减保存；
[0021]b、胶体金标记抗体的制备:
[0022]空白胶体金溶液用0.1M K2CO3调节pH值至7.4，搅拌中滴加适量浓度步骤(2)制备的抗体，每mL胶体金加入30 μ g抗体12B4,继续搅拌30 min,离心,吸取上清,用金标抗体保存液(0.02mol/L磷酸盐缓冲溶液)重旋；
[0023]C、金标垫的制备:
[0024]调试三维平面点膜喷金仪仪器(HM3055)，将lmg/mL标记好胶体金的抗玉米细菌性枯萎病菌抗体(12B4)均匀的喷在玻璃纤维膜上，喷液量0.6μ L/cm，37°C烘干过夜，封袋备用;
[0025]d、包被膜的制备:
[0026]调试三维平面点膜喷金仪仪器(HM3055)，将lmg/mL抗玉米细菌性枯萎病菌抗体(10B1)均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到检测线；将羊抗鼠IgG抗体均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到质控线，喷液量均为0.6μ L /cm，37°C烘干过夜，封袋备用。
[0027]将PVC底板、样品垫、金标垫、涂有检测线与质控线的硝酸纤维素膜检测层、和吸水垫组合，即得产品玉米细菌性枯萎病菌的免疫胶体金快速检测试纸条。
[0028]其适用于海关、粮仓、企业、检验检疫单位等，可实现粮食或种子样本中玉米细菌性枯萎病菌的快速检测，最低检测限为IX15 cfu/mL。
[0029]本实用新型试纸条的工作原理:采用胶体金免疫层析技术，选用玉米细菌性枯萎病菌特异性抗体作为固相物，利用双抗体夹心法原理检测样品中是否含有玉米细菌性枯萎病菌。当待检样品中含有玉米细菌性枯萎病菌时，抗原先和胶体金标记的抗玉米细菌性枯萎病菌抗体(12B4)结合，由于层析作用复合物沿包被膜向前移动，当遇到检测线上的抗玉米细菌性枯萎病菌抗体(1Bl)时，形成抗体-抗原-金标抗体复合物，在检测线上富集，形成红色沉淀线。
[0030]与其他检测方法相比，免疫胶体金检测技术具有以下优点:1、迅速；2、灵敏度高；3、成本低廉；4、安全简便。
[0031]本实用新型与现有技术相比具有以下优点:
[0032]1.检测速度快，全过程只需要5 min即可，可以试验大批量样品的快速检测；
[0033]2.灵敏度高，最低检测限为IXlO5 cfu/mL ；
[0034]3.操作简便，无需经过专业培训，易于推广；
[0035]4.不需要仪器，适合现场检测；
[0036]5.过程简单,直接上样检测,样本量少。
【附图说明】
[0037]图1本实用新型玉米细菌性枯萎病菌的免疫胶体金快速检测试纸条结构示意图；
[0038]附图标记说明:1、PVC底板；2、硝酸纤维膜检测层；3、样品垫；4、金标垫；5、检测线(T线)；6、质控线(C线)；7、吸水垫。
[0039]图2本实用新型玉米细菌性枯萎病菌的免疫胶体金快速检测试纸条实物检测示意图；
[0040]附图标记说明:a、2X107cfu/mL NCPPB 449 菌体浓度；b、3.3X 106cfu/mL NCPPB449 菌体浓度；c、lX106cfu/mL NCPPB 449 菌体浓度；d、3.3 X 105cfu/mL NCPPB 449 菌体浓度；e、lX105cfu/mL NCPPB 449菌体浓度；f、空白样。
【具体实施方式】
[0041]实施例1
[0042]如图1所示，一种玉米细菌性枯萎病菌的免疫胶体金快速检测试纸条，包括PVC底板1，在PVC底板I两端分别设有样品垫3和吸水垫7 ；
[0043]在PVC底板I中部设有硝酸纤维素膜检测层2，在硝酸纤维素膜检测层2与样品垫3之间设有金标垫4 ;在金标垫4 一端与样品垫3相叠加,金标垫4另一端叠加在硝酸纤维素膜检测层2上；
[0044]在硝酸纤维素膜检测层2上按先后顺序设有检测线T线5和质控线C线6。
[0045]所述金标垫4上包被有金标标记抗玉米细菌性枯萎病菌抗体12B4 ;所述检测线T线5上包被有抗玉米细菌性枯萎病菌抗体1Bl ;所述质控线6上包被有羊抗鼠IgG。
[0046]实施例2
[0047]所述玉米细菌性枯萎病菌的免疫胶体金快速检测试纸条的制备方法，其步骤是:
[0048]( I)玉米细菌性枯萎病菌单克隆抗体的制备
[0049]采用玉米细菌性枯萎病菌(NCPPB 449，来自湖南省进出口检验检疫局)菌体经过特定免疫程序免疫BALB/c小鼠，免疫程序如下:第一周进行首免，I X 18Cfu玉米细菌性枯萎病菌NCPPB 449菌体/只，弗氏完全佐剂乳化后皮下多点注射；第四周进行二免，I X 18Cfu玉米细菌性枯萎病菌NCPPB 449菌体/只，弗氏不完全佐剂乳化后皮下多点注射；第六周进行三免，I X 17 cfu玉米细菌性枯萎病菌NCPPB 449菌体/只，弗氏不完全佐剂乳化后皮下多点注射；第七周尾部采血测效价，分别挑选对玉米细菌性枯萎病菌NCPPB449菌体效价最高的老鼠；第九周进行冲刺免疫，I X 17Cfu玉米细菌性枯萎病菌NCPPB449菌体/只，生理盐水溶解，腹腔注射；冲刺免疫3天后分别眼眶采血后进行融合、筛选，共筛选到5个细胞株。
[0050](2)特异性单克隆抗体的配对筛选
[0051]将纯化后的5株单克隆抗体分别标记辣根过氧化物酶HRP，直接法鉴定标记成功后进行夹心法配对，确定特异性免疫胶体金快速检测试纸条所需要的抗玉米细菌性枯萎病菌抗体；其中12B4为金标抗体，1Bl为包被抗体；
[0052](3)玉米细菌性枯萎病菌的免疫胶体金快速检测试纸条的制备:
[0053]a.空白胶体金的制备:
[0054]采用柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒，在锥形瓶中加入200mL去离子水和2mL 1%氯金酸，搅拌加热至沸腾，快速加入4mL 1%朽1檬酸钠,继续加热15~20min,至呈亮红色,然后室温中冷却，4 C冷减保存；
[0055]b.胶体金标记抗体的制备:
[0056]空白胶体金溶液用0.1M K2CO3调节pH值至7.4，搅拌中滴加适量浓度步骤(2)制备的抗体，每mL胶体金加入30 μ g抗体(12Β4),继续搅拌30 min,离心，吸取上清,用金标抗体保存液(0.02mol/L磷酸盐缓冲溶液)重旋；
[0057]c.金标垫的制备:
[0058]调试三维平面点膜喷金仪仪器(HM3055)，将lmg/mL标记好胶体金的抗玉米细菌性枯萎病菌抗体(12B4)均匀的喷在玻璃纤维膜上，喷液量0.6μ L/cm，37°C烘干过夜，封袋备用;
[0059]d.包被膜的制备:
[0060]调试三维平面点膜喷金仪仪器(HM3055)，将lmg/mL抗玉米细菌性枯萎病菌抗体(10B1)均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到检测线；将羊抗鼠IgG抗体均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到质控线，喷液量均为0.6μ L /cm，37°C烘干过夜，封袋备用。
[0061]将PVC底板、样品垫、金标垫、涂有检测线与质控线硝的酸纤维素膜检测层、和吸水垫组合，即得产品玉米细菌性枯萎病菌的免疫胶体金快速检测试纸条。
[0062]本实用新型试纸条的工作原理:采用胶体金免疫层析技术，选用玉米细菌性枯萎病菌特异性抗体作为固相物，利用双抗体夹心法原理检测样品中是否含有玉米细菌性枯萎病菌。当待检样品中含有玉米细菌性枯萎病菌时，抗原先和胶体金标记的抗玉米细菌性枯萎病菌抗体(12B4)结合，由于层析作用复合物沿包被膜向前移动，当遇到检测线上的抗玉米细菌性枯萎病菌抗体(1Bl)时，形成抗体-抗原-金标抗体复合物，在检测线上富集，形成红色沉淀线。
[0063]检测时按如下步骤处理检测样品:取500g种子，使用0.5%的NaOCl浸泡5~15min进行表面消毒，然后使用无菌生理盐水冲洗3次，无菌条件下晾干。表面消毒后的检验样品粉碎，适量无菌生理盐水室温4°C条件浸泡过夜。浸泡液转移至离心管中4000 r/min条件下离心10 min，弃去沉淀，上清液转入另外离心管10，000 r/min条件下离心15 min,弃去上清液，加2 mL生理盐水使之悬浮，得到悬液。对悬液进行检测。
[0064]检测时如样品为阴性，则试纸条只有质控线C线显色(图2中6号)；如果样品为阳性，玉米细菌性枯萎病菌浓度大于I X 105cfu/mL,则试纸条质控线C线,检测线T线均显色。如果试纸条C线不显色，则说明试纸条质量出现问题。
【权利要求】
1.一种玉米细菌性枯萎病菌的免疫胶体金快速检测试纸条，其特征在于:在PVC底板(I)两端分别设有样品垫(3 )和吸水垫(7 ); 在PVC底板(I)中部设有包含检测线(5)和质控线(6)的硝酸纤维素膜检测层(2)，在硝酸纤维膜检测层(2)上依次设有包被有抗玉米细菌性枯萎病菌抗体1Bl的检测线(5)和包被有羊抗鼠IgG的质控线(6);在硝酸纤维素膜检测层(2)与样品垫(3)之间设有标记抗玉米细菌性枯萎病菌抗体12B4的金标垫(4);在金标垫(4) 一端与样品垫(3)相叠加，金标垫(4)另一端叠放在硝酸纤维素膜检测层(2)上。
【文档编号】G01N33-577GK204287193SQ201420664819
【发明者】匡华, 孔德昭, 胥传来, 徐丽广, 马伟, 刘丽强, 宋珊珊, 吴晓玲 [申请人]江南大学