专利名称：香蕉枯萎病菌4号小种的lamp检测引物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物病害的分子生物学检测领域，具体涉及ー种香蕉枯萎病菌4号小种的LAMP检测弓I物及其应用。
背景技术：
由尖铼孢菌古巴专化型oxysporum f. sp. cwか / ·se)引起的香蕉枯萎病是ー种毁灭性土传病害，也是我国进ロ检疫对象之一。1904年在美国夏威夷首次报道发现该病害，1910年在巴拿马因该病造成重大损失，目前该病害已广泛分布世界产香蕉国家。我国大陆于I960年在广西的西贡蕉上首先发现该病，不久国内各重要焦区都相继发生此病害，近年来在福建也发现香蕉枯萎病，并且有继续扩展蔓延的态势。其侵染来源主要是带菌的吸芽、病株残体及带菌土壌。该病菌可通过病株残体、耕作工具、带菌土壤以及病区灌溉水、雨水、虫等进行近距离传播蔓延，带病菌的吸芽、土壌及ニ级苗是远距离传播的方式。据报道香蕉枯萎病菌有4个生理小种，其中以I号小种和4号小种对生产造成严重危害。近年来，随着农产品贸易及海峡两岸农业交流的发展，从香蕉枯萎病疫区国家或地区引进农产品及种苗的种类和数量迅速増加，香蕉枯萎病菌也随着这些植物产品及植物在贸易中传入，并对我国农业发展和农产品贸易构成了严重的威胁。目前，防治香蕉枯萎病的方法主要是加强检测、检疫，严防带病种苗进入无疫区，推广种植无病组培苗，定期检查蕉园，发现零星病株应及时清除销毁，并撒施石灰或尿素处理土壌；种植抗病和耐病的香蕉品种；重病区则应轮作其它作物如水稻、花生、甘蔗等经济作物。该病害的检疫检测技术是以往研究中的薄弱环节，因此，国内外目前仍无十分有效的办法控制香蕉枯萎病扩散蔓延为害，同吋，无病种苗生产基地的建设对于无疫区农作物，尤其是果树等多年生作物香蕉枯萎病的防治至关重要，因此为了及时堵截国外病原菌的传入，防止香蕉枯萎病从疫区传入非疫区，建立一套稳定、可靠、简便、快速、灵敏的分子检测方法对香蕉苗及种植地区土壤进行检测和监测是十分必要的。传统的植物病原的检疫检测技术由于简便、易行，目前仍被采用，但由于灵敏度低和耗时长，已经不能满足新形势下植物病害诊断和病害控制工作的需要，迫切需要新型检测技术与之配套。近年来各国均致カ于分子生物学检测技术的研究，取得了很大的进展，其中以多聚酶链式反应(PCR)技术为基础的病原检测方法已经成功应用于多种植物病原的检测和鉴定。植物病原生物的PCR分子检测技术是当前该领域的发展方向，许多重要病原生物都已经建立了分子检测技术，越来越多的分子检测试剂盒已经或正在被研制。由于客观 原因，我国虽然在植物病原生物分子检测技术方面起步较晚，但目前也研制出了许多用于植物病原生物检测的技术，尤其是ー些拥有自主知识产权的检测方法，并将之投入到商业生产和应用中。目前已有ー些利用分子手段鉴定香蕉枯萎病菌，即尖铼孢菌古巴专化型(.Fusarium oxysporum f. sp. cwか / ·se)的方法，John A.等报道了香蕉枯萎病菌基于多重PCR的分子检测；廖林凤等报道了用随机扩增多态性DNA (RAPD)技术，从90个RATO随机引物中筛选出引物进行RAPD-PCR扩增，并设计特定引物作为香蕉枯萎病菌4号小种的特异性SCAR标记；刘景梅等用RAPD技术，从200条随机引物中筛选出8条引物可产生生理小种RAPD标记12个，根据这些特异片段序列分别设计相应的SCAR引物，通过对18个菌株的PCR扩增检验，有4个RAPD标记成功地转化为SCAR标记，其中Race I-SCAR标记I个、Race 4-SCAR标记2个、同时能鉴定出2个小种的SCAR标记I个；吕伟成等对香蕉枯萎病菌遗传多样性进行分析，构建了香蕉枯萎病菌生理小种ITS-SCAR双重PCR检测体系，该方法可以同时检测香蕉枯萎病菌I号和4号生理小种；叶建军等构建了以ITS测序与SCAR分子标记相结合的香蕉病原菌F0C4分子检测方法；王国芬、叶明珍、漆艳香、陈静华等根据ITS序列、16SrDNA序列、β-微管蛋白基因(β-tubulin)保守序列等设计特异引物检测香蕉枯萎病菌。目前PCR特异性检测技术仍然需要PCR仪、电泳和凝胶成像系统等昂贵的专业仪器和分子生物学试剂，且需要分子生物学专业实验人员操作，以上检测只能在实验室条件下才可以进行，限制了 PCR检测方法在生产中的推广应用。循环恒温扩增技术(loop-mediatedisothermal amplification,简称 LAMP)是2000年由日本荣研株式会社Notomi等人开发的ー种新型循环恒温核酸扩增技木。LAMP反应针对靶基因的6个位点设计出4条引物，利用ー种链式置换活性的DNA聚合酶(fci DNApolymerase),在恒温条件下(60 - 65°C )保温30 - 90分钟，即可完成扩增反应。由于LAMP反应的高效性和等温快速扩增的特点，在90分钟内可将扩增IO9 - 101°倍。LAMP扩增产物的检测一般采用荧光染料目测观察、琼脂糖凝胶电泳和浊度观察等方法。由于LAMP反应简単、快速、高效、经济等特征，因而具有极为广泛的应用前景。目前LAMP检测主要应用于人畜病原物、食品安全和环境卫生的检测，在植物病原菌检测中报道极少，香蕉枯萎病菌的检测国内外均未见报道。
发明内容
本发明提供了ー种香蕉枯萎病菌4号小种的LAMP检测引物。本发明还提供了ー种香蕉枯萎病菌4号小种的LAMP检测方法。本发明另外提供了ー种香蕉枯萎病菌4号小种的LAMP检测试剂盒。ー种香蕉枯萎病菌4号小种的LAMP检测引物如下
外侧引物 F3:5’ -AGGACCTCTTCGAATGGCA- 3’，
B3 :5’ -GACGCTGCAGCTATGACAA- 3’ ；
内侧引物 FIP :5’ -GGTGGCTCAATAGCCCAGTGAACCGATACCTGTGAAGTCGC- 3’，
BIP :5’ -CGACATCATCAGCATCTCCGCTAGCTTTGGCTCTTGTGACAG- 3’ ；
环引物 F-Ioop :5’ - GCCTAATTGAACATTCAGTATAAAC- 3，，
B-Loop :5’ - ACTCCAAGGAACTAGACGACG - 3’。ー种香蕉枯萎病菌4号小种的LAMP检测方法，包括引物设计、LAMP扩增和扩增结果观察，所述LAMP检测方法的反应体系包括引物混合液、反应混合液、I. OU Bst DNA聚合酶和25ng DNA模板，用灭菌双蒸水补足到25 uL ;所述引物混合液由权利要求I所述的外侧引物F3、B3，内侧引物FIP、BIP和环引物B-loop、F-loop组成，其中外侧引物F3和B3各5pmol,内侧引物FIP和BIP各40 pmol,环引物B-loop、F-Ioop各20 μ mo I ;所述反应混合、液配制如下40mM Tris-HCL, 20mM (NH4) 2S04, 20mM KCL, 16 mM MgSO4,0. 2% Triton X-100，I. 6M 甜菜碱和 2. 8 mM dNTPs。所述LAMP检测方法的反应条件为在60-65°C温育60 min, 80_85°C保温lOmin。所述反应条件优选为在63°C温育60 min,80°C保温lOmin。所述扩增结果观察为荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法；所述荧光染料目测观察法在LAMP反应的最终扩增产物中加入IuL显色剂，所述显色剂为SYBR green I，显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性；所述琼脂糖凝胶电泳法取2ULLAMP反应的最終扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现LAMP特征性的梯形带判断为阳性，没有出现扩增条带判断为阴性。ー种香蕉枯萎病菌4号小种特异性的检测试剂盒，包括
1)引物混合液外侧引物F3和B3各5pmol,内侧引物FIP和BIP各40pmol，环引物 B-Ioop 和 F-Ioop 各 20 μ mo I ；
2)反应混合液40mMTris-HCL, 20mM (NH4) 2S04, 20mM KCL, 16 mM MgSO4,0. 2% TritonX-100,1. 6M Betaine,2. 8 mM dNTPs ；
3)I. OU Bst DNA 聚合酶。所述LAMP检测试剂盒还包括显色剂，所述的显色剂为SYBR green I。所述LAMP检测试剂盒还包括从罹病香蕉枯萎病植物组织或土壤中提取DNA的提取试剂，由2% CTAB ,10% SDS、体积比为25:24:1的酚/氯仿/异戊醇混合液、氯仿、3M NaAC,
O.4%脱脂奶粉溶液、7. 5 M NH4ACU0mg/ml蛋白酶K、无水こ醇、70%こ醇、IXTE组成。所述DNA模板为从罹病香蕉枯萎病的植物组织或土壤中提取。当在用于植株组织中存在香蕉枯萎病菌时，所述的提取方法为CTAB法提取植物组织中香蕉枯萎病菌DNA (具体步骤见实施例2)。当在土壤样品中存在香蕉枯萎病菌条件下，采用土壤DNA提取法提取土壤中香蕉枯萎病菌的DNA (具体步骤见实施例3)。上述香蕉枯萎病菌4号小种LAMP分子检测方法或试剂盒在诊断植物组织、土壌的香蕉枯萎病菌感染情况或鉴别香蕉枯萎病菌中的应用。本发明解决上述技术问题主要采取的技术方案包括以下三个部份1、提供了 4条用于检测香蕉枯萎病菌的LAMP引物序列，分别命名为F3、B3、FIP、BIP ;配制并优化了 LAMP反应体系和反应条件，有利于LAMP以最高效率对样品进行扩增；2、提供了多种LAMP结果检测方法，主要有荧光染料目测观察、琼脂糖凝胶电泳。具体包括以下步聚
I、罹病植物组织或土壤中香蕉枯萎病菌DNA提取
采用CTAB法提取植物组织中香蕉枯萎病菌DNA ;采用土壌DNA提取法提取土壌中香蕉枯萎病菌的DNA。2、LAMP 引物设计
I)采用CTAB法提取供试香蕉枯萎病菌株基因组DNA ;2)应用随机引物进行RAPD分析筛选，筛选得到一条RAPD随机引物，序列为5’-TGCCGAGCTG-3’，使用筛选出的随机引物再次对供试菌株基因组DNA进行RAPD分析，得到I条香蕉枯萎病菌特异的RAPD片段；3)使用切胶回收试剂盒从琼脂糖凝胶中回收香蕉枯萎病菌特异的RAPD片段，连接到载体上，通过适宜温度热击后，转化到感受态细胞中，待细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因后，在加有含有氨节青霉素Amp、异丙基硫代-β -D-半乳糖苷和5-溴-4-氯-3-Π引哚-D-半乳糖苷的LB平板上筛选阳性白斑；4)挑取转化子白斑的阳性克隆，采用质粒抽提试剂盒提取质粒DNA，用内切酶及^ I和双酶切检测证实所克隆片段确实为香蕉枯萎病菌特异性的DNA片段；5)迸行DNA的测序，得到香蕉枯萎病菌特异基因序列；6)从这ー特异基因序列中设计6条LAMP引物；
F3 :5’ -AGGACCTCTTCGAATGGCA- 3’，
B3 :5’ -GACGCTGCAGCTATGACAA- 3’，
FIP :5， -GGTGGCTCAATAGCCCAGTGAACCGATACCTGTGAAGTCGC- 3'
BIP :5’ -CGACATCATCAGCATCTCCGCTAGCTTTGGCTCTTGTGACAG- 3’
F-Ioop :5’ - GCCTAATTGAACATTCAGTATAAAC- 3’
B-Loop :5’ - ACTCCAAGGAACTAGACGACG - 3，
3、LAMP反应体系的配制。4、LAMP 反应扩增条件在 60_65°C温育 60 min, 80_85°C保温 IOmin 灭活ガDNA聚合酶。5、LAMP结果检测结果可以采用以下ニ种方法检测①将上述反应完的体系中加入IuL的显色剂，轻晃混匀，即可观察，显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性。②取2uL扩增产物在2%琼脂糖凝胶电泳中电泳检测，如果出现LAMP特征性的梯形带判断为阳性，没有出现扩增条带判断为阴性。本发明所提供的香蕉枯萎病菌4号小种LAMP快速检测技术具有其它检测方法所无法比拟的优点
1、结果可靠本发明所设计出的ー种LAMP特异性检测引物，仅针对香蕉枯萎病菌生理4号小种进行检测，已经对源于中国发生香蕉枯萎病的福建、海南、广东等地的香蕉枯萎病菌和带香蕉枯萎病菌的土样、植物组织进行了测试验证，因此结果可靠性具有充分的保 证；
2、特异性强所采用的引物是针对香蕉枯萎病菌特异RAH)基因序列中6个不同区域设计出4条特异性引物，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故特异性闻。3、灵敏度高:对香蕉枯萎病菌的检测灵敏度在DNA水平上可达到10fg，比常规PCR检测高100倍以上。4、快速高效核酸扩增在I. 5h内即可完成，比常规PCR要节省2 - 3h，且产物可以扩增至Ij IO9 - 101°倍。5、操作简单LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，只需ー个水浴锅即可，不需要复杂的仪器设备和昂贵的分子试剂，结果肉眼直接可见。
图I为本发明所要检测的香蕉枯萎病菌4号小种LAMP特异性检测图；其中A为扩增后电泳检测結果；B为染料检测結果；图中M为DL 2000 DNA ladder marker，I泳道为阴性对照，2泳道为尖孢铼刀菌古巴专化型(Race4)，3泳道为尖孢铼刀菌古巴专化型(Racel)，4泳道为尖孢铼刀菌棉花专化型，5泳道为尖孢铼刀菌黄瓜专化型，6泳道为尖孢铼刀菌番茄专化型，7泳道为尖孢铼刀菌西瓜专化型，8泳道为尖孢铼刀菌番薯专化型，9泳道为尖孢铼刀菌西瓜专化型，10泳道为拟轮生铼刀菌，11泳道为茄腐铼刀菌，12泳道为拟轮生铼刀菌，13泳道为木贼铼刀菌，14泳道为禾谷铼刀菌，15泳道为斐济球腔菌，16泳道为芭蕉球腔菌，17泳道为芭蕉炭疽菌，18泳道为蚕豆叶壳ニ胞菌，19泳道为立枯丝核菌，20泳道为致病疫霉菌。图2为本发明香蕉枯萎病菌4号小种LAMP灵敏性检测 图中M 为 DL 2000 DNA ladder marker, I 泳道为 100 ng，2 泳道为 10 ng，3 泳道为 Ing，4泳道为100 pg，5泳道为10 pg，6泳道为I pg，7泳道为100 fg，8泳道为10 fg，9泳道为I fg，10泳道为O. I fg。图3为本发明香蕉发病组织和带菌土壌LAMP检测结果图；
图中泳道I、2、3为发病的香蕉组织，泳道6为发病土壌，泳道4、5、7为健康香蕉组织，泳道8为阴性对照，9泳道为阳性对照，M为DL 2000 DNA ladder marker。
具体实施例方式实施例I
以下结合附图实施例对本发明进行进一歩描述。香蕉枯萎病菌4号小种LAMP特异检测引物
F3 :5’ -AGGACCTCTTCGAATGGCA- 3’，
B3 :5’ -GACGCTGCAGCTATGACAA- 3’，
FIP :5， -GGTGGCTCAATAGCCCAGTGAACCGATACCTGTGAAGTCGC- 3'
BIP :5’ -CGACATCATCAGCATCTCCGCTAGCTTTGGCTCTTGTGACAG- 3’。香蕉枯萎病菌4号小种特异性LAMP检测试剂盒，包括
O引物混合液外侧引物F3和B3各5pmol,内侧引物FIP和BIP各40 pmol ；
2)反应混合液40mMTris-HCL, 20mM (NH4) 2S04, 20mM KCL, 16 mM MgSO4,0. 2% TritonX-100,1. 6M Betaine,2. 8 mM dNTPs ；
3)I. OU Bst DNA 聚合酶。试剂盒还包括显色剂,所述的显色剂为SYBR green I。试剂盒还包括从罹病香蕉枯萎病植物组织或土壤中DNA提取试剂，由2% CTAB,10% SDS、酚/氯仿/异戊醇(体积比为25:24:1)、氯仿、3M NaAC,O. 4%脱脂奶粉溶液、7. 5 MNH4AC、10mg/ml蛋白酶K、无水こ醇、70%こ醇、I XTE组成。LAMP反应体系包括弓I物混合液、反应混合液、I. OU Bst DNA聚合酶和25ng DNA模板，用灭菌双蒸水补足到25 uL，所述引物混合液为外侧引物F3和B3各5pmol，内侧引物FIP 和 BIP 各 40 pmol ;所述的反应混合液为 40mM Tris-HCL, 20mM (NH4)2SO4, 20mM KCL, 16mM MgSO4,0. 2% Triton X-100,1. 6M Betaine,2. 8 mM dNTPs。所述的LAMP反应条件为在63°C温育60 min, 82°C保温lOmin。所述的显色剂为SYBR green I。检测的特异性在LAMP反应的最終扩增产物中加入IuL显色剂，除了以来自我国枯萎病发生地海南、广东和福建等省份的香蕉枯萎病菌株为模板的结果中可观察到强烈的绿色突光外，以oxysporum的非古巴专化型、其它铼刀菌/^sari spp及其它的真菌和细菌等菌株为模板的结果中则没有观察到，仍为橙色。取上述反应液2uL在2%琼脂糖凝胶电泳，以香蕉枯萎病菌株为模板的结果均出现LAMP特征性的梯形带，而以其它的真菌和细菌菌株为模板的结果没有发现有扩增产物(表1，图I)。检测的灵敏性用不同浓度的香蕉枯萎病菌DNA进行灵敏性检测，以IOfg的纯DNA为模板仍可观察到绿色荧光，琼脂糖凝胶电泳结果也出现LAMP特征性的梯形帯，说明LAMP最低的检测率在DNA水平上可达到IOfg (图2)。表I验证引物对香蕉枯萎病菌特异性所用菌株、寄主、来源及LAMP检测结果
权利要求
1.ー种香蕉枯萎病菌4号小种的LAMP检测引物，其特征在于所述引物如下外侧引物 F3:5’ -AGGACCTCTTCGAATGGCA- 3’，B3 :5’ -GACGCTGCAGCTATGACAA- 3’ ；内侧引物 FIP :5’ -GGTGGCTCAATAGCCCAGTGAACCGATACCTGTGAAGTCGC- 3’，BIP :5’ -CGACATCATCAGCATCTCCGCTAGCTTTGGCTCTTGTGACAG- 3’ ；环引物 F-Ioop :5’ - GCCTAATTGAACATTCAGTATAAAC- 3，，B-Loop :5’ - ACTCCAAGGAACTAGACGACG - 3’。
2.ー种香蕉枯萎病菌4号小种的LAMP检测方法，包括引物设计、LAMP扩增和扩增结果观察，其特征在于所述LAMP检测方法的反应体系包括引物混合液、反应混合液、I. OUBst DNA聚合酶和25ng DNA模板，用灭菌双蒸水补足到25 uL ;所述引物混合液由权利要求I所述的外侧引物F3、B3，内侧引物FIP、BIP和环引物B-Ioop、F-Ioop组成，其中外侧引物F3 和 B3 各 5pmol,内侧引物 FIP 和 BIP 各 40 pmol,环引物 B-loop、F-Ioop 各 20 μ mo I ;所述反应混合液配制如下40mM Tris-HCL, 20mM (NH4)2SO4, 20mM KCL, 16 mM MgSO4,0. 2% TritonX-100,1. 6M 甜菜碱和 2. 8 mM dNTPs。
3.根据权利要求2所述的香蕉枯萎病菌4号小种的LAMP检测方法，其特征在于所述LAMP检测方法的反应条件为在60-65°C温育60 min，80_85°C保温lOmin。
4.根据权利要求2所述的香蕉枯萎病菌4号小种的LAMP检测方法，其特征在于所述扩增结果观察为荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法；所述荧光染料目测观察法在LAMP反应的最终扩增产物中加入IuL显色剂，所述显色剂为SYBR green I，显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性；所述琼脂糖凝胶电泳法取2ULLAMP反应的最終扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现LAMP特征性的梯形带判断为阳性，没有出现扩增条带判断为阴性。
5.ー种香蕉枯萎病菌4号小种特异性的检测试剂盒，其特征在于所述LAMP检测试剂盒包括 1)引物混合液外侧引物F3和B3各5pmoI，内侧引物FIP和BIP各40pmoI，环引物B-Ioop 和 F-Ioop 各 20 μ mo I ；2)反应混合液40mMTris-HCL, 20mM (NH4) 2S04, 20mM KCL, 16 mM MgSO4,0. 2% TritonX-100,1. 6M Betaine,2. 8 mM dNTPs ；3)I. OU Bst DNA 聚合酶。
6.根据权利要求5所述的香蕉枯萎病菌4号小种的LAMP检测试剂盒，其特征在于所述LAMP检测试剂盒还包括显色剂，所述的显色剂为SYBR green I。
7.根据权利要求5所述的香蕉枯萎病菌4号小种的LAMP检测试剂盒，其特征在于所述LAMP检测试剂盒还包括从罹病香蕉枯萎病植物组织或土壤中提取DNA的提取试剂，由2%CTAB,10% SDS、体积比为25:24:1的酚/氯仿/异戊醇混合液、氯仿、3M NaAC,O. 4%脱脂奶粉溶液、7. 5 M NH4AC、10mg/ml蛋白酶K、无水こ醇、70%こ醇、IXTE组成。
全文摘要
本发明属生物技术领域。具体涉及一种香蕉枯萎病菌4号小种的LAMP检测引物及其应用。其反应体系中香蕉枯萎病菌4号小种的LAMP检测引物为F3、B3、FIP、BIP，F-loop，B-Loop通过对罹病植物组织中香蕉枯萎病菌DNA提取，LAMP等温扩增检测，从而快速和特异性检测香蕉枯萎病菌。本发明的检测方法结果可靠、特异性强、灵敏度高、快速高效、操作简便，在香蕉枯萎病菌现场快速检测和香蕉枯萎病的早期诊断方面具有很高的应用价值。
文档编号C12Q1/68GK102690887SQ20121019613
公开日2012年9月26日 申请日期2012年6月14日 优先权日2012年6月14日
发明者兰成忠, 李本金, 翁启勇, 陈庆河 申请人:福建省农业科学院植物保护研究所