专利名称：抗植物枯萎病和黄萎病的GbRPS1基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种从构建的海岛棉cDNA库中分离的能够抗棉花枯萎病菌和黄萎病菌的广谱抗病蛋白。
背景技术：
在自然环境中存在着众多的植物病原微生物，它们引起的疾病若发生爆发会导致农作物产量的大幅减少，甚至绝收。因此提高植物抗病能力，以保证农作物的产量是作物遗传改良的重要方向。在长期的进化过程中，植物逐渐形成了一系列复杂有效的保护机制(1)植物的细胞壁是植物有效防止病原物入侵的有效屏障；( 当病原菌通过植物细胞壁后，植物通过与病原物激发子相互识别产生病原菌相关抗性反应。在病原菌相关抗性反应过程中，植物受体激酶与激发子的识别诱导质膜蛋白的磷酸化与去磷酸化，这种磷酸化的信号向细胞内传递引起一系列抗性相关基因的表达变化，导致植物产生抗性反应。这种抗性水平经过一段时间后逐渐扩展到整株植物，最终形成对病原微生物侵染的广谱抗性。广谱抗性基因能够有效激发植物防御反应，提高植物的防御反应速度，增强植物的抗性水平。利用植物广谱抗性特点开发的广谱抗病策略具有诱发植物自身抗性、可行性强、无种属专一性、作用持久等特点，广谱抗病策略是开展植物转基因育种抗病重要方向。棉花在整个生长过程中主要受到枯萎病、黄萎病2种病害的危害。我国科学家曾将几丁质酶、过氧化物酶等基因转化到棉花的感病品种中，对提高棉花的耐枯萎病和黄萎病性能力有一定作用，但是上述基因对于枯萎病和黄萎病均无显著抗性。因此，迫切需要开发新的广谱抗性基因。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够提高植物对枯萎病和黄萎病抗性的广谱抗病基因以及蛋白。在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的(ibRPSl蛋白质多肽，它包含具有SEQ ID NO :2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。较佳地，该多肽选自下组(a)具有SEQ ID NO 2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO 2氨基酸序列经过一个或多个(较佳地1-20个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗枯黄萎病功能的(^bRPSl蛋白质活性的由(a)衍生的多肽。在本发明的第二方面，提供编码分离的这些多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组(a)编码上述(ibRPSl蛋白质多肽的多核苷酸；和(b) 与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO :2或3所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种(a)具有SEQ ID NO 1中 202-2916位的序列；(b)具有SEQ ID NO :1中1-3120位的序列。在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转
3导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。在本发明的第四方面，提供了一种改变植物抗枯黄萎病抗性的方法，它包括步骤(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有(ibRPSl的DNA编码序列，所述的(ibRPSl选自下组(a)具有SEQ ID NO 2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO :2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗枯黄萎病抗性的由(a)衍生的多肽；(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使(ARPS1基因编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；(3)选择出转入(ibRPSl基因的DNA编码序列的植物细胞或组织或器官；(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。(5)将步骤中的植物进行枯黄萎病的抗性鉴定，植株具有高抗水平。本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。本发明人经过广泛而深入的研究，首次采用分子克隆方法从构建的海岛棉cDNA 库中分离获得了新的(^bRPSl基因，并且通过实验证实了它具有高抗枯黄萎病抗性，并且转入植物后可导致植物对枯黄萎病抗性的提高。在此基础上完成了本发明。在本发明中，术语“(ibRPSl蛋白质”、“(ibRPSl多肽”或“广谱抗性蛋白”可互换使用，都指具有抗枯黄萎病蛋白(^bRPSl氨基酸序列(SEQ ID NO 2)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的GbRPSl蛋白质。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。如本文所用，“分离的(ibRPSl蛋白或多肽”是指(ibRPSl多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化GbRPSl蛋白质。本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主， 本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。本发明还包括(ibRPSl蛋白质的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、 “衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然(^bRPSl蛋白质相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽， 或(iii)成熟多肽与另一个化合物融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此
4多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列)。根据本文所述，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。在本发明中，术语“(ibRPSl多肽”指具有抗枯黄萎病菌活性的SEQ ID NO. 2序列的多肽。该术语还包括具有与(^bRPSl蛋白质相同功能的、SEQ ID NO. 2序列的变异形式。 这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20 个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在 C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括 GbRPSl蛋白的活性片段和活性衍生物。该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨程度条件下能与(^bRPSlDNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗 GbRPSl多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含(ARPS1多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了 (AB(ibRPSll多肽的可溶性片段。通常，该片段具有(^bRPSl多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约 100个连续氨基酸。发明还提供(ibRPSl蛋白质或多肽的类似物。这些类似物与天然(ibRPSl多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。 这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到。在本发明中，“(ibRPSl蛋白质保守性变异多肽”指与SEQ ID NO 2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。表 1
最初的残基代表性的取代优选的取代Ala(A)Val ；Leu ；IleValArg(R)Lys ；Gln ；AsnLysAsn(N)Gln ；His ；Lys ；ArgGlnAsp(D)GluGluCys(C)SerSerGln(Q)AsnAsnGlu(E)AspAsp
权利要求
1.一种分离的(^bRPSl蛋白质多肽，选自具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多肽，或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.权利要求1所述的多肽，所述保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物是 SEQ ID NO :2序列被一个或多个氨基酸残基取代、缺失或添加而形成的，且具有提高对植物枯萎病和黄萎病抗性的多肽。
3.权利要求1或2所述的多肽在提高植物对枯萎病和黄萎病抗性方面的功能与应用。
4.一种分离的多核苷酸，包含(a)编码权利要求1或2所述多肽的多核苷酸；或(b)与(a)互补的多核苷酸。
5.权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，其序列选自(a)具有SEQID NO :1中202-2916位的序列；或(b)具有SEQ ID NO :1 中 1-3120 的序列。
6.权利要求4或5所述的多核苷酸在植物对枯萎病菌和黄萎病抗性方面的功能与应用。
7.一种载体，其特征在于含有权利要求4或5所述的多核苷酸。
8.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于含有权利要求7所述的载体。
9.权利要求1或2所述多肽的制备方法，包含(a)在适合表达的条件下，培养权利要求8所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有(ARPS1蛋白质活性的多肽。
10.一种植物对枯萎病菌和黄萎病抗性的方法，包括(a)提供携带权利要求7所述的表达载体的农杆菌；(b)将植物细胞或组织或器官与步骤(a)中的农杆菌接触，从而使所携带的表达载体中的DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；(c)选择出转入有(ibRPSl蛋白质的DNA编码序列的植物细胞或组织或器官；(d)将步骤(c)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。
全文摘要
本发明提供了一种能够提高植物对枯萎病和黄萎病的抗性的GbRPS1基因及其编码的GbRPS1蛋白质多肽，以及经重组技术产生这种GbRPS1蛋白质的方法。本发明还公开了GbRPS1基因分别在抗植物枯萎病菌和抗黄萎病菌的广谱抗病方面的功能与应用。
文档编号C12N1/15GK102321162SQ201110299818
公开日2012年1月18日 申请日期2011年10月8日 优先权日2011年10月8日
发明者左开井, 王劲, 陈继军, 黄逸群 申请人:左开井, 王劲