专利名称：电泳选择林木植物抗病细胞系的制作方法
技术领域：
本发明属林木遗传育种领域林木遗传育种按传统方法主要是进行杂交和选择，这是一种系统工程，要耗费大量的人力、物力、财力和时间。林木抗病育种也主要在林地间进行选择抗病单株，由于林地间选择常受年份、气候、病发率、症状、亲本的变异性、交叉感染等各种复杂因素的影响，选育抗病品系也是十分困难的。油茶是中国亚热带地区主要的木本油料树种，炭疽病是危害油茶的主要病害，一般年份病害减产20～30％，严重病发年份往往造成油茶林木大面积毁灭，以往虽然在林地间选择了不少抗病单株并扩繁成抗病品系，由于抗病性状不稳定，实际在生产中保存下来的很少。
本发明在林木植物抗病生理生化机制研究的基础上，利用细胞培养技术操作在时间和空间上的优势，电泳选择抗病单细胞，建立抗病单细胞克隆，进一步分化再生抗病植株，为林木抗病育种提供了快速有效地新技术方法。
本发明是利用细胞电泳技术选择抗病细胞系，许多木本植物是自花不育、异花受粉的，从林地间采取幼嫩组织作外植体进行组织培养，由愈伤组织制备的悬浮细胞培养物其中有各种基因细胞，选择几率是较高的，能够选择出抗病表型细胞。
本发明利用寄主悬浮培养细胞的病原菌毒素模拟寄主与病原菌的相互作用，在其相互作用下，抗病表型细胞均表现为pH改变酸性pH，pH缓冲能力显著增强，碱滴度增高，而感病型细胞pH基本无改变，既有差别就可以进行分离和选择出抗病型细胞系。
本发明目的是选择林木抗病细胞系，建立抗病单细胞克隆，再进一步分化再生抗病植株。本发明主要包括四部分内容。1、分离纯化病原菌，进行病原菌纯培养，诱导产生病原菌毒素，将病原菌毒素进行分离和纯化，贮存备用。2、林地间采集寄主幼嫩组织作外植体进行组织培养，诱导分化愈伤组织，由愈伤组织制备悬浮细胞，建立单细胞培养系统。3、将病原菌毒素加入寄主单细胞培养系统，诱发寄主细胞抗病表型，抗病型细胞pH由中碱性pH转变为酸性pH。4、在电泳池进行细胞电泳，分离和选择具有酸性pH的抗病表型细胞。酸性pH抗病表型细胞携带的电荷多，在电泳池中迁移速率大，快速泳向阴极。感病型细胞为中碱性pH，携带的电荷少，在电泳池中迁移速率小。根据迁移速率把抗病表型细胞分离选择出来，放入新鲜培养基中，经稀释脱去病原菌毒素后，再进行单细胞培养，建立抗病单细胞克隆。
实例1油茶炭疽病菌Collefortrichum camelliae Massee单孢子系分离自油茶林病株上的病枝梭状疱，分离出的C.camelliae在10％(w/v)油茶籽煎煮液培养基上培养3周后收集分生孢子，然后把孢子悬液(6×105个/ml)接种在改良的Czapek-Dox培养液(NaNO30.3％、K2HPO40.1％、KCl 0.05％、MgSO4.7H2O0.05％、FeSO4.7H2O 0.01％、蔗糖2％、pH6.5)中，24～28℃振荡(90次/分钟)培养14天，离心或过滤收集培养滤液于4℃冰箱中。取500ml培养滤液加入1000ml-15℃冰冻丙酮，4000rpm离心15分钟，弃去沉淀，上清液继续加入1500ml冰冻丙酮，4000rpm离心15分钟，收集沉淀，丙酮洗涤2～3次。将沉淀溶于少量水中使浓度相当于10mg/ml葡萄糖，上强碱性阴离子交换树脂(强碱201)柱(28×2.4cm)，洗脱液经PEG10000吸水浓缩，调整浓度相当于10mg/ml葡萄糖，再上强酸性阳离子交换树脂(强酸732)柱，蒸馏水洗脱，洗脱液浓缩至相当于1mg/ml葡萄糖，上预先以50mM NaCl平衡过的Sephadex G-50柱(55×2cm)，50mM NaCl洗脱，分部收集，合并Molish反应阳性部分，PEGl0000吸收浓缩至小体积，透析脱盐，60℃空气干燥，即得纯化的C.camelliae毒素备用。实例2林地间采集油茶新发的嫩枝，去掉叶片，嫩枝截成1～1.5cm切段，经消毒灭菌后接种在MS培养基上，MS含2.4-D2mg/L、NAA 1mg/L、肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L、Vit.B10.5ml/L、Vit.B60.5ml/L、甘氨酸2ml/L、蔗糖30000mg/L，pH调到6.5，25℃中培养，2周后切段两端形成愈伤组织，4周后转移到新鲜MS培养基上继续生长。取旺盛生长的愈伤组织团块放入悬浮细胞制备液中。该制备液由MS培养液和果胶酶1％组成，pH调至4.5，并经过超滤灭菌。制备液在35℃保温2～4小时，并不停振荡，然后经200目尼龙布过滤，滤液经5000rpm离心，分离沉淀单细胞，并用无菌MS培养液洗涤2～3次，然后重新悬浮于MS培养液中，显微镜检查单细胞率在95％以上。实例3制作细胞电泳装置，玻璃电泳槽100×10×10mm银电极插入盐桥导管中，左端装上阳极，右端装上阴极，连接直流稳压电源固定在显微镜载物台上。电泳槽中装约10ml MS培养液，另外加蔗糖使浓度为0.3～0.5M，防止细胞沉降槽底，使细胞接近质壁分离状态。
将实例2中制备的悬浮细胞制备液细胞数调整到106～108个/ml，加入实例1制备的C.camelliae病原菌毒素，使其浓度为10～100μg/ml，用染色法显微镜检测细胞对毒素发生反应的时间进程和最低浓度范围。在毒素浓度40～250μg/ml范围内施加毒素14～16小时后约有2～6‰的细胞pH改变为酸性，在毒素浓度400～650μg/ml范围内施加毒素4～6小时后即有12～20％的细胞死亡。悬浮细胞制备液中加入适量病源菌毒素，并进行了一段反应时间后，离心沉降，用毛细管移入电泳池阳极近处，进行电泳分离电泳电压110～660V约50～60分钟后显微镜视野中有细胞出现，再继续电泳20～40分钟收集早先泳向阴极的细胞，选择出抗病细胞系。分离选择抗病细胞系的全部操作都是无菌状态下进行的。实例4将电泳选择出来的细胞系按通常的平板法、悬浮法或看护法进行单细胞培养，培养基为含有2.4-D 1mg/L、NAA 0.5mg/L、BA 0.5g/mL、清蛋白1％的MS培养基，尽可能增加细胞密度，25℃弱光下保温培养，48小时后可启动分裂增殖，继续培养建立单细胞克隆。实例5将油茶炭疽病菌毒素加入实例4培养基中，使浓度为100μg/ml，48小时后用染色法检查，细胞pH转变为酸性pH(5.2～5.6)，测定β-糖苷酶和苯丙氨酸解氨酶活性，这两种酶的活性分别提高了4～6倍和3～5倍，显示了抗病的生化特征。
本发明用电泳技术分离选择林木抗病表型细胞，建立抗病单细胞克隆，再进一步分化再生抗病植株，这就克服了传统的抗病育种方法所遇到的种种困难，在短时间内可获得抗病新品系，大大节省了时间、人力、物力和财力。
权利要求
1.林木植物抗病育种新方法，分离选择抗病细胞系，建立抗病单细胞克隆，诱导再生抗病植株，其特征在于(1)不是以病原菌毒素作为选择压力，而是利用病原菌毒素刺激诱导细胞抗病表型，分离和选择具抗病表型的细胞；(2)病原菌毒素刺激诱导的抗病细胞表型是细胞pH改变为酸性pH范围；(3)电泳法分离选择抗病表型细胞，酸性pH的抗病表型细胞携带电荷多迁移速率大，率先泳向阴极而与非抗病表型细胞分离开，而选择出抗病表型细胞；(4)选择出的抗病表型细胞经微型细胞培养术建立抗病单细胞克隆。
2.根据权利要求1所述的方法其特征在于所说的林木病害包括真菌病、细菌病和病毒等产生毒素的病害。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所说的林木细胞抗病表型为细胞pH改变为酸性pH或碱性pH。
4.根据权利求1所述的方法，其特征在于能够用电泳技术分离和选择抗病表型细胞的林木抗病育种方法。
全文摘要
本发明属林木植物抗病育种新技术。本发明提供一种分离和选择林木抗病细胞的新方法，它不是以病原菌毒素作为选择压力，选择耐受毒素的存活细胞。本发明提供的林木植物抗病育种新方法包括:1.分离和培养林木病原菌，制备病原菌毒素。2.由林木植物愈伤组织制备悬浮单细胞系统中加入低浓度病原菌毒素，诱导抗病细胞表型，抗病型细胞在毒素作用下改变为酸性pH。4.进行电泳分离和选择酸性pH细胞，酸性pH细胞携带电荷多，迁移速率大，率先泳向阴极。5.对入选细胞系进行单细胞培养，建立抗病单细胞克隆。
文档编号G01N27/26GK1420168SQ0114057
公开日2003年5月28日 申请日期2001年11月19日 优先权日2001年11月19日
发明者王敬文 申请人:中国林业科学研究院亚热带林业研究所