赋予植物抗病性的组合物和系统及其使用方法
【专利说明】赋予植物抗病性的组合物和系统及其使用方法
[0001] 对相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年9月13日提交的美国临时专利申请序列号No. 61/700,500的 优先权，据此其通过提述完整并入。
[0003] 有关联邦政府资助研宄和发展的声明
[0004] 本发明在美国国立卫生研宄院授予的GM046451的国家支持下完成，美国政府对 本发明享有一定的权力。
[0005] 序列表的并入
[0006] 本申请还提供包含文件名为"31377-21_IURTC13057_ST25. txt"（大小为17, 844 字节（由Microsoft WINDOWS? Explorer)测定）的纸件和计算机可读形式的序列表， 其并入本申请作为参考。该序列表由SEQ ID NOs:1-28组成。
[0007] 发明背景
[0008] 总体而言，本申请涉及植物遗传学和植物分子生物学，更具体而言，涉及在植物细 胞中基于对病原体-特异性的蛋白酶的识别，赋予对表达病原体-特异性的蛋白酶的植物 病原体的抗性的组合物、系统和方法。
[0009] 植物病是对农业生产率的严重限制，并且影响农业耕作的发展和历史。植物病害 由多种植物病原体造成，包括细菌、真菌、昆虫、线虫和病毒。
[0010] 可以通过农业措施控制植物病害的发生率，包括常规育种技术、轮作以及使用合 成的农药。然而，常规育种技术耗时且由于植物病原体逐渐演变，为了保持抗病性需要持续 的努力。参见Grover&Gowthaman(2003)Curr. Sci. 84:330-340。类似地，农药增加农民的生 产成本，还对生态环境造成有害的影响。有鉴于此，管理者禁止或限制使用一些危害性最大 的农药。
[0011] 现在，农业科学家能将植物遗传工程化，使其表达抗-病原体多肽，由此增强对植 物病原体的抗性。例如，已经培育出对基于叶片和土壤传播的真菌病原体具有增强抗性 的马铃薯和烟草植物。参见 Lorito 等（1998)Proc. Natl. Acad ScL USA 95:7860-7865。 此外，还培养出了对真菌病原体具有增强的抗性的转基因大麦。参见Horvath等（2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:364-369。而且，也培育出了产生Cry内毒素的转基因玉米 和棉花。参见例如 Aronson(2002)Cell Mol. Life Sci. 59:417-425;和 Schn印f 等（1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:775-806。包括马铃薯在内的其他作物也经过遗传工程化包 含类似的内毒素。参见 Hussein 等（2006) J. Chem. Ecol. 32:1-8 ;Kalushkov&Nedved (2005) J. Appl. Entomol. 129:401-406 和 Dangl 等（2013)Science 341:746-751。
[0012] 鉴于植物病原体对植物产量和品质的显著影响，还存在对保护植物不受植物病原 体侵害的其他组合物、系统和方法的需求。
[0013] 发明概述
[0014] 本申请提供组合物、系统和方法，其通过修饰植物中用来检测病原体-特异性蛋 白酶的蛋白质对（protein pairs)中至少一个成员，赋予对表达病原体-特异性的蛋白酶 的植物病原体的抗病性。这些蛋白质对能使植物激活应答病原体-特异性蛋白酶的内源防 御系统。简言之，所述的组合物、系统和方法基于蛋白质对，所述蛋白质对中的至少一个成 员是核苷酸结合-富含亮氨酸重复（NB-LRR)抗病性蛋白质，蛋白质对中的其他成员是与其 天然/相应NB-LRR蛋白质物理上相关联的、病原体-特异性蛋白酶的底物蛋白质，当所述 底物蛋白质被病原体-特异性蛋白酶切割时激活上述的NB-LRR蛋白质。用针对所关注的 病原体-特异性蛋白酶的识别序列（即，异源蛋白酶识别序列）替换底物蛋白质中的内源 蛋白酶识别序列，可将此种蛋白质对对给定的病原体-特异性蛋白酶的特异性工程化。
[0015] 所述的组合物包含重组核酸分子，所述重组核酸分子具有编码病原体-特异性 蛋白酶的经修饰底物蛋白质的核苷酸序列，其中所述经修饰的底物蛋白质具有异源蛋白 酶识别序列。所述异源蛋白酶识别序列可以在，例如所述经修饰的底物蛋白质的暴露环 (exposed loop)中。任选地，所述重组核酸分子可以具有编码NB-LRR蛋白质的核苷酸序 列，由此该核酸分子编码所述的蛋白质对。例如，在一个具体实施方案中，具有编码NB-LRR 蛋白质的核苷酸序列的重组核酸分子与具有编码病原体-特异性蛋白酶的经修饰底物蛋 白质的核苷酸序列的重组核酸分子共转化，由此经修饰的底物蛋白质和NB-LRR蛋白质共 表达。NB-LRR蛋白质可与病原体-特异性的蛋白酶的经修饰底物蛋白质相关联并被其激 活。
[0016] 所述组合物还可以包括本申请描述的、经分离的病原体-特异性蛋白酶的经修饰 底物蛋白质，及其活性片段和变体。
[0017] 所述组合物还包括核酸构建体，其具有与在植物细胞、植物部分或植物中驱动表 达的启动子可操作连接的、编码本申请描述的病原体-特异性蛋白酶的经修饰底物蛋白质 的核苷酸序列，如表达盒和载体。此种核酸构建体可用于向天然表达相应NB-LRR蛋白质的 植物细胞、植物部分或植物提供经修饰的底物蛋白质。所述经修饰的底物蛋白质可与所述 NB-LRR蛋白质相关联并将其激活。
[0018] 任选地，所述构建体，包括表达盒和载体，可包括与在植物细胞、植物部分或植物 中驱动表达的启动子可操作连接的、编码NB-LRR蛋白质的核苷酸序列。具有编码本申请 描述的病原体-特异性蛋白酶的经修饰底物蛋白质的核苷酸序列的核酸构建体，和具有编 码NB-LRR蛋白质的核苷酸序列的核酸构建体可在植物细胞、植物部分或植物中共表达。 NB-LRR蛋白质可与病原体-特异性的蛋白酶的经修饰底物蛋白质相关联并被其激活。此种 核酸构建体可用于向不天然表达所述蛋白质对两种成员的植物细胞、植物部分或植物提供 所述的蛋白质对。
[0019] 所述组合物还包括经转化的植物细胞、植物部分和植物，其具有与在植物细胞、植 物部分或植物中驱动表达的启动子可操作连接的、编码本申请描述的至少一种病原体-特 异性蛋白酶的经修饰底物蛋白质的核苷酸序列。任选地，所述植物细胞、植物部分和植物 经转化以包括与在植物细胞、植物部分或植物中驱动表达的启动子可操作连接的、编码 NB-LRR蛋白质的核苷酸序列。NB-LRR蛋白质可与病原体-特异性的蛋白酶的经修饰底物 蛋白质相关联并被其激活。
[0020] 所述的系统包括核酸构建体，所述核酸构建体具有在植物细胞、植物部分或植物 中驱动表达的、与编码本申请描述的病原体-特异性蛋白酶的经修饰底物蛋白质的核苷酸 序列可操作连接的第一启动子的核苷酸序列，和在植物细胞、植物部分或植物中驱动表达 的、与编码NB-LRR蛋白质的核苷酸序列可操作连接的第二启动子的核苷酸序列。NB-LRR 蛋白质可与病原体-特异性的蛋白酶的经修饰底物蛋白质相关联并被其激活。此种系统可 用于向不天然表达所述蛋白质对两种成员的植物细胞、植物部分或植物提供所述的蛋白质 对。
[0021] 所述系统还包括具有在植物细胞、植物部分或植物中驱动表达的、与编码本申请 描述的病原体-特异性蛋白酶的经修饰底物蛋白质的核苷酸序列可操作连接的启动子的 核苷酸序列的第一核酸构建体，和具有在植物细胞、植物部分或植物中驱动表达的、与编码 NB-LRR蛋白质的核苷酸序列可操作连接的启动子的核苷酸序列的第二核酸构建体。所述系 统还可包括另外的核酸构建体，其中每一构建体具有编码不同的（distinct)经修饰的底 物蛋白质的核苷酸序列，每一构建体具有针对单独的（separate)病原体-特异性的蛋白酶 的异源识别序列。尽管各经修饰的底物蛋白质具有彼此不同的异源识别序列，每一经修饰 的底物蛋白质均与NB-LRR蛋白质相关并可使其激活。可供选择地，所述第一核酸构建体可 编码一种以上经修饰的底物蛋白质，其中，各经修饰的底物蛋白质具有彼此不同的异源识 别序列，且其中，每一经修饰的底物蛋白质均与NB-LRR蛋白质相关并可使其激活。可供选 择地，所述第二核酸构建体可编码一种以上经修饰的底物蛋白质，其中，各经修饰的底物 蛋白质具有彼此不同的异源识别序列，且其中，每一经修饰的底物蛋白质均与NB-LRR蛋白 质相关并可使其激活。所述系统可用