专利名称：稻瘟病抗性基因Pi7及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技 术领域，具体涉及一种水稻稻瘟病抗性基因7^/7的克隆及 其应用。
背景技术：
植物在生长的过程中，常常受到多种病原物的侵害，而植物则采取多种防御策略 以保护自身，避免受其侵袭。植物中一个最重要的防御机理就是能够识别专性致病微生物 的存在并启动自身的防御应答系统。植物对病原菌的识别由抗病基因所介导。因此，对抗 病基因产物结构进行分析与研究，是了解植物抗病机制的基础，对于其病害的预防和控制 也具有重要的指导意义。迄今为止，己经从植物中分离了 80多个抗病基因。对这些抗病基因的结构和 产物的研究发现，虽然寄主植物不同，所对应的病原物也有真菌、细菌、病毒和线虫等差 异，但抗病基因的结构和产物却有许多共同的结构特征，如C-端存在富亮氨酸重复序列 (leucine-rich repeat, LRR), N-端存在核苷酸结合位点(nucleotide binding site, NBS),亮氨酸拉链(leucine zipper, LZ),卷曲螺旋结构域(coiled-coil，CC),跨膜 结构域(transmembrane domain, TM)，蛋白激酶(protein kinase, PK),以及果蝇 Toll 蛋白及哺乳动物白介素-1 受体(Toll and interleukin - 1 receptor, TIR) 等。根据它们所编码蛋白的结构特征，可将抗病基因分为7类(Hammond-Kosack & Jones， 1997; Dangl & Jones 2001; Iyer & McCouch 2004)。第一类，毒素还原酶类抗病基因。如玉米抗病基因它是第1个被克隆的植物 抗病基因，它控制对真菌CbcWio力Wm carbonum小种1的抗性。Hml编码的解毒酶能钝化 病原真菌所产生的HC毒素，而HC毒素是真菌C. carbonum小种1产生的致病因子，它决 定该病菌只能感染玉米的某些基因型(Johal等，1992)。第二类，NBS-LRR类抗病基因。 它们编码的蛋白近N端为NBS，而近C端则由LRR组成。如似(Bent et al.，1994)、 RPMl (Grant et al. , 1995)、/2 (Simon et al. , 1998)； TP^CParker et al. , 1997)、 N (Dodd et al. , 2001)、Z 6 (Lawrence et al. , 1995) > Mlal (Zhou et al. , 2001)、 Mla6 (Halterman et al. , 2001 );7jC稻的抗病基因如 Ia7(Yoshimura et al. , 1998) (Wang et al.，1999),/^iia (Bryan et al.，2000)等。第三类，PK 类抗病基因。如番茄 Pto基因，其产物是一种位于细胞内的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，没有LRR结构域(Martin et al., 1993)。第四类，LRR-TM类抗病基因。番茄抗叶霉病不同生理小种的基因Cf_2 (Dixon et al. , 1996)、(Thomas et al. , 1997)> Cf~5 (Dixon et al. , 1998)、 Cf~9 (Jones et al. , 1994)，以及甜菜抗胞囊线虫的基因泡严(Cai et al. , 1997) 等。第五类，LRR-TM-PK类抗病基因，以水稻抗白叶枯病基因Xa21 (Song et al. , 1995) 为代表。第六类，以拟南芥的RPW8为代表，其编码的蛋白仅含有完整的CC和NBS结构域 (Xiao et al., 2001 )。第七类，以水稻的紛5基因为代表，其编码的蛋白为一个转录因 子(TFIIAy) (Iyer & McCouch, 2004)。
编码NBS-LRR类抗病蛋白的抗病基因是植物抗病基因中最大的一类抗病基因，根 据NBS-LRR类抗病蛋白N末端的结构特点，又可将该类基因分为两大类TIR-NBS-LRR和 CC-NBS-LRR (Meyers et al. , 2002; Pan et al. , 2000; Cannon et al. , 2002; Richly et al., 2002)。TIR-NBS-LRR类抗病基因主要发现在双子叶植物，至今还没有在单子叶植 物基因组中发现(Bai et al. , 2002; Meyers et al.，2002)。目前在单子叶植物中鉴定 到的抗病基因主要编码CC-NB S-LRR类抗病蛋白，双子叶植物中也存在大量的CC-NBS-LRR 类抗病基因，相对而言，单子叶植物中的CC-NBS-LRR类抗病基因比双子叶植物中的更丰富 多样(Cannon et al.，2002)。研究表明，NBS、CC、TIR结构域可能参与信号传导(Hammond-Kosack & Jones 1997)，尽管这类R蛋白不具有内在的激酶活性，但NBS可以激活激酶或G蛋白，NBS具有 结合ATP或GTP以及水解酶活性(Traut et al.，1994)。TIR结构可能参与植物抗病防 卫反应下游的信号传导(Jones et al. , 1994)。最近的证据表明，亚麻的Z族多样性选择 也发生在TIR区域，这个区域与相应的LRR区域共进化形成特异性(Luck et al. , 2000)。 LRR结构域的功能主要涉及到蛋白质-蛋白质和与配体的相互作用(Jones & Jones，1996; Kajava et al. , 1998)，据推测是抗病基因产物直接和病原菌无毒基因编码的产物或间接 产物相互作用的部位(Bent, 1996; Baker et al.，1997)。Jia et al. (2000)通过酵母 双杂交证明JKTP-Pite编码的蛋白加工为一个176氨基酸的活性蛋白AVR-Pita176小种特异 性的激发子，传递到植物细胞质特异地与Pita受体的LRD区域结合，从而激活细胞内Pita 介导的防卫反应。当Pita中的Ala变为Ser后AtrPita176不能与LRD结合，因而表现感 病。这一结果直接证明了 LRR结构域可能就是病原菌识别的区域；Pita与AvrPita的互作 第一次从分子水平验证了水稻与稻瘟病菌的“基因对基因”关系。水稻是世界上最重要的粮食作物之一，约有一半以上的人口以稻米为主食。由病 原真菌ife卵oryzae ( ^C']& -.Pyricularia oryzae)引起的稻瘟病是对水稻生产 危害最严重的病害之一，每年都造成严重的粮食损失。从环境保护与农业的可持续发展的 观点来看，抗病品种的育成与利用是防治稻瘟病最安全有效的方法。但是，由于稻瘟病菌群 体的多样性及易变性，加之人们缺乏对抗性基因的有效利用，以及对抗性机理缺乏充分的 了解，以致抗病品种的感病化问题不但没有得到解决，反而因有效抗源基因的缺乏和抗病 品种的短命化而成为育种学家最为棘手的问题。因此，发掘、鉴定和克隆抗病基因并合理地 应用于抗病育种计划中，已成为农业科研中优先解决的重要问题。随着分子生物学的快速发展，迄今，至少有80多个水稻稻瘟病主效抗性基因已经 被报道，其中60个已经被分子定位。目前，除了水稻的第3染色体上还没有被鉴定到稻瘟 病主效抗性基因之外，其余的11条染色体上均被鉴定到有主效抗性基因位点，并且有的 染色体上含有多个稻瘟病抗性位点，而且有些基因位点的抗性基因是成簇存在的。目前， 在稻瘟病抗性基因的克隆研究方面，正式报道的已有13个抗性基因，/H (Wang et al., 1999),Pita (Bryan et al. , 2000) ,Pi9 (Qu et al., 2006) ,Pid2 (Chenet al. , 2006)， Piz-t 私 Pi2 (Zhou et al.，2006b), Ρ 36 (Liu et al. , 2007a), Ρ 37 (Lin et al., 2007),Pik-m (Ashikawa et al., 2008),Pit (Hayashi et al” 2009) ,Pi5 (Lee et al” 2009), Pid3 (Shang et al., 2009) ^Ppi21 (Fukuoka et al. , 2009)。克隆抗病基因是对水稻抗性机理深入研究的前提，揭示水稻抗稻瘟病的分子机理可以更好地控制和降低稻瘟病菌对水稻的危害。同时，对克隆的抗病基因进行修饰和改造， 可以人为地控制和增加植物的抗病性，拓宽植物的抗谱。这些方面是采用常规植物育 种和 改良技术所不能达到的。
发明内容
本发明的目的是提供一种水稻稻瘟病抗性基因和包含调控这个基因的启动子的 DNA片段。本发明的另一个目的是提供上述稻瘟病抗性基因所编码的蛋白质。本发明的另一个目的是提供上述含有上述抗性基因的载体。本发明的另一个目的是提供上述载体的宿主细胞。本发明的另一个目的是提供上述基因在制备转基因植物中的应用。本发明的进一步目的是提供上述抗性基因产生的分子标记及其在选育对稻瘟病 具有抗病性的水稻中的应用。本发明从水稻品种IRBL7-M中分离得到基因，包括2个编码NBS-LRR 类蛋白的基因Ρ 7-1和Pi7-2,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2所 示，它们分别编码SEQ ID NO. 3以及SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列，结构如附 图9和附图10所示。它们的蛋白都包含2个主要的结构域NBS和LRR区域，其中 Pi7-1 NBS 结构域含有保守的 kinase la :GLPGGGKTTVAR, kinase2:NKKYLIVIDDIff, kinase3a: DLGGRIIMTTRLNSI，GLPL EDSPCYDIV匪CYGMPLALIW -,Pi7-2 NBS 结构域含有保守的 kinasela:VLSIVGFGGVGKTTIA, kinase2LEQLLAEKSYILLIDDIff, kinase3aGGRIIVTTRFQAV, GLPL EQVPEEIWKICGGLPLAIV, RNBS-D CLLYLSIFPKGffK, MHDV KTFQVHDMVLEYI。而 Pi7_l 蛋白 的C-末端为16个不完整的LRR重复，其亮氨酸含量为14. 0% (图9);Pi7_2蛋白的C-末端 为13个不完整的LRR重复，其亮氨酸含量为17.0% (图10)。应当理解，在不影响蛋白活性的前提下(不在蛋白的活性中心)，本领域技术人员 可对SEQ ID NO. 3或SEQ ID N0. 4所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或 几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序列。此外，考虑到密码子的简并性，例如可在其编 码区，在不改变氨基酸序列的条件下，或在其非编码区在不影响蛋白表达的条件下，对编码 上述蛋白的基因序列进行修改。因此，本发明还包含对编码上述蛋白的基因序列进行的替 换、添加和/或缺失一个或多个核苷酸，具有与上述编码基因具有相同功能的核苷酸序列。 本发明还包括基于所述基因的正义序列或反义序列，包括含有所述核苷酸序列或其片段的 克隆载体或表达载体、含有所述载体的宿主细胞、含有所述核苷酸序列或其片段的转化的 植物细胞和转基因植物。本发明同样包括将7^/7抗性基因的主要结构部分有效地连接上合适的调节序列 所形成的嵌合基因，以及在基因组中包含这种基因的植物和这种植物的种子。这种基因可 以是天然的或是嵌合的。例如，将包含该基因的片段和一个组成型表达的启动子连接，该启 动子可以在任何条件下和细胞发育的任何时期表达。这种组成型表达的启动子包括花椰菜 花叶病毒的35S启动子等。另一方面，也可以将该基因和一个组织特异性表达的启动子或 发育时期特异性表达的启动子或精确环境诱导的启动子连接，这些启动子称之为诱导型启 动子。这样，环境的改变，发育时期的不同都可以改变该基因的表达。同样地，也可以将该基因的表达限定在某一个组织内，使由该基因诱导的抗病反应得到人为的控制。其中环境 条件包含病原菌的攻击、厌氧条件和光等，组织和发育时期包括叶、果实、种子和花等。本发明还进一步克隆得到所述基因的启动子，包含调控该基因的启动子的DNA片 段分别如SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6所示。
根据本发明提供的朽7基因序列信息(SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2)，本领域技 术人员可以通过以下方法容易地获得与等同的基因(1)通过数据库检索获得；(2) 以基因片段为探针筛选水稻或其它植物的基因组文库或cDNA文库获得；(3)根据
基因序列信息设计寡核苷酸引物，用PCR扩增的方法从水稻或其它植物的基因组、mRNA和 cDNA中获取；(4)在/基因序列的基础上用基因工程方法改造获得；(5)用化学合成的方 法获得该基因。本发明提供的稻瘟病抗性基因/具有重要的应用价值，其赋予植物对稻瘟病菌 CMagnaportAe orj^^)所引起的病害产生特异性的抗病反应。其适用于对所有对该病原菌 敏感的植物，这些植物包括单子叶植物和双子叶植物。应用之一是将所述的基因序列 连接到任何一种植物转化载体，用任何一种转化方法将抗病基因导入水稻或其他植物 细胞，可获得表达所述基因的转基因抗病品种，从而应用于生产。本发明所述的基因构建到 植物转化载体中，可以对所述基因或其调控序列作适当的修饰，也可以在其转录起始密码 子前用其它启动子取代所述基因原有的启动子，从而拓宽和增强植物对病原菌的抗性。本发明提供的抗性基因的另一个应用是根据所述基因序列信息产生特异性的分 子标记，包括但不限于SNP (单核苷酸多态)、SSR (简单序列重复多态)、RFLP (限制性内切 酶长度多态)、CAPS (切割扩增片段多态)。用此标记可鉴定水稻或其它植物的抗性基因型， 用于分子标记辅助选择育种，从而提高育种的选择效率。本发明具有明显的优点和效果。将克隆的抗病基因转入感病的植物，有助于产生 新的抗病植物。特别是可以用转化技术在植物中累加多个抗病基因，而不会产生传统育种 技术中伴随出现的基因组中不良基因的连锁问题，并且可以缩短育种时间。抗病基因的克 隆是克服传统育种中不能在植物种间转移抗病基因的问题的前提。本发明能够进一步提供或应用基于上述DNA片段获得的抗病的转基因植株和相 应的种子，以及用本发明的基因或基于该基因的重组体转化的植株或由这类植株获得的种 子。可以用有性杂交的方式将本发明的基因转入其他的植株中。
图1为水稻稻瘟病抗性基因的克隆策略图。先前有报导称A7 (C101LAC)、 RIL29)以及Pik对来自菲律宾的多个稻瘟病菌菌株表现出相同的反应型(Tsunematsu
et al. 2000, Breeding Science 50: 229-234) 和/事实上是/的等位基因或 与其完全相同的基因(Campbell et al. 2004，Phytopathology 94: 302-307)。结合本研 究室对与上述Pii等位基因具有“基因对基因，gene-for-gene”相互作用的稻瘟病菌无毒 基因定位、克隆的结果，从而推测可能就是/7^新的等位基因。因此，本发明以已公布 的Pi7定位的信息(Campbell et al. 2004，Phytopathology 94: 302-307)为基础，构建 该目的基因区域的电子物理图谱；采用与Pii等位基因之Z7^- (Ashikawa et al. 2008， Genetics 180: 2267 - 2276^PPiKZhai et al. 2010，New Phytologist DOI 10.1111/j. 1469-8317. 2010. 03462. χ)相似的克隆策略来克隆该抗性基因。图2为^^簇等位基因对8个稻瘟病菌群体抗谱的比较。图中纵坐标为抗性频率， 横坐标为8个稻瘟病菌群体(GD，广东；FJ，福建；ΗΝ，湖南；GZ，贵州；SC，四川；LN，辽宁JL, 吉林；HLJ，黑龙江)。5 个/7Z左簇等位基因(IRBLks-S, PiAs] IRBLk-Ka, Pik\ Tsuyuake, Pik-m ； IRBLkp-K60, Pik~p ； IRBL7-M, Pi7\由此可以看出，对广东、湖南、贵州、四 川和辽宁的稻瘟病菌群体表现较高的抗性。图3为目的基因区域电子物理图 谱的构建图。图3A:上述Campbell等(2004) 构建的区域粗略的遗传图谱；图3B 根据/^左- (Ashikawa et al. 2008, Genetics 180: 2267 - 2276)和/^左(Zhai et al. 2010，New Phytologist D0I: 10.1111/ j. 1469-8317. 2010. 03462. χ)的定位信息构建的7^/7与Pii簇等位基因的整合物理图；图 3C 选基因区域存在的4个BAC克隆；图3D fii基因候选区域(Zhai et al. 2010, New Phytologist 180: 2267 - 2276)；图3E :朽7基因位点在日本晴类型基因组上存在的具有 NBS-LRR保守结构的6个抗病候选基因；图3F :朽7基因位点在IRBL7-M/Tsuyuake类型基 因组上存在的具有NBS-LRR保守结构的2个抗病候选基因。由此可以看出，在基因位 点上存在两种类型的基因组，彼此之间存在很大的缺失/插入；基因只有2个候选基因 {Pi7-1 和 Pi7-2、。图4为水稻稻瘟病抗性基因Pi7 (由Pi7_l和Pi7_2组成)之遗传互补Ttl植株的 抗性鉴定实物图。图中实线箭头所指的是抗病植株，虚线箭头所指的是感病植株，说明抗性 基因Pi7由Pi7-1和Pi7-2组成才能表现功能。图5为水稻稻瘟病抗性基因朽7遗传互补的部分Ttl转化体的选择标记HPT基因 的PCR检测图。图中由左至右，泳道1、15 分子量标记DL2000 ；泳道2 空载体(Vector)， 阳性对照；泳道3 转化受体品种Q1063，阴性对照；泳道4 供体品种IRBL7-M，阴性对照；泳 道5-14 =Ttl转化体。结果表明，所有抗病的转化体都检测到了选择性标记的PCR扩增产物， 而感病的转化体没有检测到选择性标记的PCR扩增产物，说明抗病的转化体是由于转化构 建体已经整合到了高感的受体品种Q1063的基因组中获得了表达而恢复了抗性。R 高抗； MR 中抗；MS 中感；S 感病。图6为水稻稻瘟病抗性基因/^/7遗传互补后代基因型与表现型的共分离分析图。 图中由左至右，泳道1、11 分子量标记DL2000 ；泳道2 空载体(Vector)，阳性对照；泳道 3 转化受体品种Q1063，阴性对照；泳道4-10 =T1转化系的分离后代。结果表明，在T1转化 系的分离后代中，所有抗病的1\转化体都检测到了选择性标记的PCR扩增产物，而感病的T1 转化体没有检测到选择性标记的PCR扩增产物，说明该T1转化系后代个体的基因型与表现 型共分离，亦即转基因在其分离后代中已经稳定遗传表达。R 高抗；MR:中抗；S:感病。图7为水稻稻瘟病抗性基因之RNA干涉(RNAi) F1植株的抗性鉴定实物图。 图中HF4为供体品种IRBL7-M与朽左-力傻Pi7高度同源的等位基因)之RNAi T1转化 子kh4i-ll遗传杂交的F1植株，其接种后的表现病为感病(S)，说明Pi7的功能被Aj-力 之RNAiT1转化子所含有的构建体而干涉(破坏)了 ；HF6为供体品种IRBL7-M与之 RNAiT1转化子kh4i-26遗传杂交的F1植株，其接种后的表现病为感病，说明朽7的功能 lPik-h之RNAiT1转化子所含有的构建体而干涉(破坏)了 ；图中HFlO为含有Pia的品种 Aichi ksohi与Pik-h、Pia^%Pik-h/Pi7位置不同的非等位基因)之RNAi T1转化子kh4i-9遗传杂交的F1植株，其接种后的表现型为抗病(R)，说明Pia的抗性功能并没有被 Pik-h之RNAiT1转化子所含有的构建体而干涉(破坏)了，因此，可作为非特异性RNA干涉的 对照；IRBL7-M是/的供体品种，其接种后的表现型为抗病(R)，说明接种所用的稻瘟病菌 株CHL381是合适的。图8为水稻稻瘟病抗性基因之RNA干涉(RNAi) F1植株的分子鉴定实物图。 图中由左至右，泳道M (两侧):分子量标记DL2000 ；泳道1 上述IRBL7-M，没有检测到RNAi 构建体特异的分子标记(ΦΟ，即不含有构建体；泳道2:RNAi T1转化子kh4i-ll，检测 到了 RNAi构建体特异的分子标记(φ )，即含有构建体；泳道3 上述冊4之F1植株，含有 构建体；泳道4:RNAi T1转化子kh4i-26，含有构建体；泳道5、6 上述HF6之F1植株，含 有构建体；泳道7:上述Aichi Asahi，不含有构建体；泳道8:RNAi T1转化子kh4i_9，含 有构建体；泳道9、10 上述HFlO之F1植株，含有构建体。以上结果说明，HF4和HF6之F1 植株因为受到等位基因特异性的RNA干涉而使其含有的抗性基因(/^7)的功能不表达；作 为对照，HFlOiF1植株因为受到的是非等位基因特异性的RNA干涉而使其含有的抗性基因 (.Pia)的功能正常表达。图9为水稻稻瘟病抗性基因朽7之组成基因Pi7_l的基因结构及序列图。图9A 图中浅色方框表示5’和3’ -UTR ；深色方框表示外显子；线条表示内含子；该基因编码区的 启动子(ATG)和终止子(TAG)以及各个区域的大小(bp)亦标示于其中。图9B:图中CC结 构域带下划线的黑体字表示形成CC motif的氨基酸，NBS区域带下划线的黑体字表示NBS 中保守的氨基酸序列。下部分独立列出的氨基酸残基为C-末端LRR区域；带下划线的黑体 字表示形成LRR区域的xLDL保守基序；LRR区域后面还带有一段CNL (C端非LRR区域)氨 基酸序列。双下线标示的氨基酸序列为特异的氨基酸替换[substitution，与^^簇的 其他等位基因(Pik, Piks, Pik-p, Pik-m)相比]。图10为水稻稻瘟病抗性基因朽7之另一组成基因朽7-2的基因结构及序列图。 图IOA 图中浅色方框表示5’和3’ -UTR ；深色方框表示外显子；线条表示内含子；该基因 编码区的启动子(ATG)和终止子(TAG)以及各个区域的大小(bp)亦标示于其中。图IOB 图中CC结构域带下划线的黑体字表示形成CC结构的氨基酸，NBS区域带下划线的黑体字 表示NBS中保守的氨基酸序列。下部分独立列出的氨基酸残基为C-末端LRR区域；带下划 线的黑体字表示形成LRR区域的xLDL保守基序。双下线标示的氨基酸序列为/^/7特异的 氨基酸替换[substitution,与/7^簇的其他等位基因、Pik, Piks, Pik-p, Pik-m)相 比]。图11为水稻稻瘟病抗性基因7^/7表达特性的定量RT-PCR检测图。左图为组成基 因朽7-7在不同的接种时间点(0 hr, 12 hr, 24 hr, 72 hr，120hr)的相对表达水平，由此 可以看出，该基因的表达类型为，从12 hr—72 hr逐步上调，然后逐步下调。右图为另一个 组成基因在不同的接种时间点的相对表达水平，由此可以看出，该基因的表达类型 为，12 hr—24 hr逐步上调，然后逐步下调。由此还可以看出，该基因在接种对照(H2O)和 接种病原菌之间表现明显不同的诱导型表达。2个基因都表现为组成型表达，因为接种之前 和之后都能检测到2个基因的表达。图中纵坐标为相对表达水平，横坐标表示时间，单位为 小时(h)，斜纹框图为对照(接种之前)，黑框图为接种对照(H2O),空白框图为病原菌接种。图12为利用水稻稻瘟病抗性基因7^/7的特异性分子标记的基因型鉴定图。由此可以看出，2个特异性分子标记的组合使用能够将/与其它几个等位基因区分开。图12Α为 标记T1-795G，该标记可以将抗性品种IRBL7-M的基因型GdZ7/°/7)与抗性品种IRBLkp_K60 (朽左-/ //7^-/ )和感病受体品种龙粳24Q1063 (/7i7/!7i7)区分开；图12B为标记A2-1879G， 该标记能将抗性品种IRBL7-M的基因型、Pi 7/Pi 7)与抗性品种IRBLk-Ka iPik/Pik )、 IRBLkm-Ts iPik-m/Pik-m),IRBLks-S (/^々-■s/0^-·^)、感病受体品种 Q1063 Qpi7/pi7\惑 病受体品种龙粳24 (,pi7/p i7)区分开。图中，M 分子量标记DL2000。
具体实施例方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明 的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。 在本发明的实施例部分，我们阐述了基因的抗性特征、分离克隆、功能特征以及分子鉴 定，分离的基因能够与适当的载体连接，转入植物体中，使该植物体带有一定的抗性。实施例1抗性基因Ζ^/ 的抗性特征
为了比较和明确Pi7与Pik位点4个等位基因、Pik, Pik-p, Piks, Pik-ni)的抗谱， 利用从广东(60个菌株)，福建(40个)，湖南(41个)，贵州(60个)，四川(66个)，辽宁(108 个)，吉林(60个)和黑龙江(63个)收集的总计498个菌株对上述5个等位基因的所持品种 (分别是 IRBL7-M, IRBLk-Ka, IRBLkp-K60, IRBLks-S 和 Tsuyuake)进行了抗谱比较分析。 结果表明，/Y/对广东、湖南、贵州、四川和辽宁的稻瘟病菌群体表现较高的抗性，由此说明 该基因可在上述地区使用(图2)。水稻品种RBL7-M, IRBLk-Ka, IRBLkp_K60和IRBLks-S 已在文献(Kobayashi et al. Development of new sets of international standard differential varieties for blast resistance in rice {Oryza sativa L. ). JARQ, 2007,41: 31-37)中公开。/K稻品种 Tsuyuake 已在文献(Wang et al. Characterization of rice blast resistance genes in the Pik cluster and fine mapping of the Pik~p locus. Phytopathology, 2009,99: 900-905)中公开。实施例2水稻稻瘟病抗性基因7^/7的克隆策略及电子物理图谱的构建 先前的定位研究表明朽7基因定位于与Pii簇基因相同的基因组区域(Campbell et
al. Development of co-dominant amplified polymorphic sequence markers in rice that flank the Magnaporthe grisea resistance gene Pi7{t) in recombinanant inbred line 29. Phytopathology, 2004,94: 302-307 ；图 3A)；本研究室的抗谱分析显示 基因与Pii簇3个等位基因(除了抗性较弱的/^ii-S之外)对大部分测试菌株表现出相 同的抗性反应(图2)；本研究室先前的研究表明，与朽7相对应的无毒基因也是与 Aj簇抗性基因对应的无毒基因JKTftj/^ /如是等位的。综合上述三方面的结果，依据植 物病害系统的“基因对基因”学说，推断应该也是/如的等位基因。因此，本发明 采用了与本研究室克隆Aj等位基因相似的策略和方法，完成了目标区域电子物理图 谱的构建(图1)。亦即，以水稻参考品种日本晴(Nipponbare)的序列信息为基础，通过生物 信息学手段，把与朽7连锁的标记(Campbe 11 et al. 2004 ；图3A)以及与Pii基因共分离 的标记(Zhai et al. 2010，New Phytologist D0I: 10. 1111/j. 1469-8317. 2010. 03462. χ ；图3B)进行物理位置整合，并由此构建了目的基因区域的重叠群图(图3C)，以及电子物理图(图3D)。实施例3水稻稻瘟病抗性基因Pi7候选基因的注释及序列分析
为了确定的候选基因，申请人利用日本晴的参考序列，通过3种基因预测软件 RiceGAAS (http://ricegaas.dna.affrc.go.jp) 、Gramene (http://143.48.220.116/ resou rces/)禾口 Softberry 的 FGENESH (http //www. softberry. com)对目的基因区域进 行了基因预测及注释分析，初步确定了的候选抗性基因为6个核苷酸结合位点和富 亮氨酸重复(nucleotide binding site - leucine-rich repeat, NBS-LRR)的候选基因 (.Pi71-NP, Ρ 72-ΝΡ, Ρ 73-ΝΡ, Ρ 74-ΝΡ, Ρ 75-ΝΡ,和 Pi76_NP)。对6个候选基因进行基于基因特异性标记的存在/缺失(presence/absence，P/ Α)分析，结果表明，与PiA簇3个等位基因一样，在日本晴参考序列存在的4个候选基因 、Ρ 71-ΝΡ,Pi72-NP,Pi73-NP,Pi74-NPHPi7 W[赛私納 IRBL7-M 中是不存在的(图 3E，3F)。 因此，的候选抗性基因只有和朽7-么下一步将通过以下的基因功能互补实验确 认其功能。实施例4水稻稻瘟病抗性基因Pi7的遗传互补实验及转化子的鉴定
先前的研究表明，Pi左簇的2个等位基因/^左- (Ashikawa et al. 2008, Genetics 180: 2267 - 2276)和/^左(Zhai et al. 2010，New Phytologist D0I: 10.1111/ j. 1469-8317. 2010. 03462.x)都是由2个紧密连锁的基因组成的。因此，利用高保真酶 phusion 结合长片段 PCR (long-range PCR, LR-PCR)技术，以 IRBL7-M 的总 DNA 为模板，根 据或参考 Liu et al. (2007，Genetics, 176: 2541-2549)和 Zhai et al. (2010，New Phytologist D0I: 10. 1111/j. 1469-8317. 2010. 03462. χ)描述的实验方法和程序，将上述 2个候选基因作为一个整体基因进行了扩增、克隆，然后进行了基于遗传互补的功能获得性 实验(图1)。结果表明，在遗传互补后代中获得了功能互补的转化体(表1 ；图4)。扩增、克隆朽7-72的引物为
正向引物:TTTTGGCGCGCCGGTGCGGGAAGAAGACGGGATAAAGA 反向引物:TTTTGGCGCGCCGCCGACGATAGCAACCGACAGGAGTG
利用转化载体中的潮霉素基因(φ )标记对转化体进行了 PCR检测。检测结果证明目 的基因片段已经导入抗病转化体中，而没有导入感病转化体中(图5)。
表1. /^/7 2个组成基因的遗传互补实验分析结果 戈选基因T;, ^iM反,2 ^功ft互於
均建太 受本品铀 R MR MS S成功率(％”
- a
PI7-12 Longjmg24 110 34 13 35
Pi -] 2 Ql 063 10 1612%
自各个构建体的Ttl植株接种对无毒性的菌株CHL346。R，抗病；MR，中抗；MS，中 感；S，感病。b 功能互补成功率(％)为 R+MR/R+MR+MS+S*100%上述遗传互补的实验结果表明，候选基因就是的功能基因。水稻品种Q1063 以及生物材料载体 PCAMBIA1300 已在文献(Lin et al. 2007, Genetics 177: 1871-1880) 中公开；水稻品种 Longjing 24(龙粳 24)已在文献(Zhai et al. 2010, New Phytologist D0I: 10. 1111/j. 1469-8317. 2010. 03462. χ)中公开。为了进一步确认转基因构建体在转化后代的遗传稳定性，选择部分的转化后代T1 株系，进行了抗性表现型/抗性基因型的共分离分析(图6)。结果表明，抗性表现型与抗性 基因型完全共分离。亦即，转基因构建体在转化后代中能够稳定遗传、表达。实施例5水稻稻瘟病抗性基因7^/7基于Aj等位基因RNAi植株杂交后代的抗性 及分子鉴定 为了进一步确认的功能，以及是否就是Aj簇新的等位基因，申请人进行了 基于Pii等位基因(PiH)RNAi之T1转化子杂交后代的功能丧失性实验(图1)。结果表 明，Pii等位基因RNAi纯合稳定的2个植株(kh4i-ll和kh4i_26)与供体品种IRBL7-M的 杂交F1植株都表现朽7抗性功能的丧失。亦即，的抗性功能由于被Aj等位基因RNAi 之T1转化子所含有的构建体而干涉(破坏)了(图7中HF4和HF6)。作为非特异性RNA干 涉的对照，含有/7Za的品种Aichi ksahi与Pik-h iPia I与Pik_h/Pi7位置不同的非等 位基因)之RNAi T1转化子kh4i-9遗传杂交的F1植株，其接种后的表现型仍为抗病(图7 中HF10)，说明Pia的抗性功能并没有被Pi^之RNAiT1转化子所含有的构建体而干涉(破 坏)。IRBL7-M是/的供体品种，其接种后的表现型为抗病，说明接种所用的稻瘟病菌株 CHL381是合适的。为了确认杂交后代抗性功能的丧失是否与RNAiT1转化子所含有的构建体相关，对 上述3个杂交组合的亲本及其后代进行了基于构建体特异性分子标记的分子鉴定。结果表 明，特异性RNA干涉的后代(HF4和HF6)抗性表现型与其分子标记基因型相关(图8之泳 道3、5、6)，而非特异性RNA干涉的后代(HFlO)抗性表现型与其分子标记基因型不相关(图 8之泳道9、10)。实施例6朽7基因的结构
采用移步法对的DNA序列进行了测定。利用RACE技术，获得了朽7的全长cDNA序 列并对其进行了测序。基因DNA长度为16. 9 kb (包含朽7-7和朽7-力，其中，朽7-7的 全长cDNA序列为3723 bp，含有一个3429 bp的开放读码框，5，和3，非翻译区分别为104 bp和190 bp。通过比较基因组DNA和cDNA序列，发现该基因的开放读码框含有2个内含 子和3个外显子(图9 A)。另一个组成基因的全长cDNA为3690 bp，含有一个3066 bp的开放读码框，5，和3，非翻译区分别为380bp和244bp。通过比较基因组DNA和cDNA 序列，发现该基因的开放读码框含有1个内含子和2个外显子，而在5’非翻译区内含有一 个内含子(图10 A)。实施例7 抗性蛋白的结构
基因包含的2个组成基因编码的蛋白序列如序列表中Pi7 SEQ ID No. 3和Pi7SEQ ID No. 4 所示。朽7-7基因编码1个由1142个氨基酸残基组成的蛋白多肽，分子量为126.60 KD, 等电点为6. 46。利用COIL分析表明该蛋白多肽具有CC (coiled-coil)结构域。Pi7_l蛋 白属于NBS-LRR蛋白，NBS结构域中保守的kinase la (GLPGGGKTTVAR)位于该多肽的第290个氨基酸残基；kinase 2 (NKKYLIVIDDIff)位于该多肽的第376个氨基酸残基；kinase 3a (DLGGRIIMTTRLNSI)位于该多肽的第 402 个氨基酸残基，GLPL (EDSPCYDIV匪CYGMPLALIW) 位于该蛋白多肽461个氨基酸残基。而该蛋白的C-端的610-960个氨基酸残基为16个不 完整LRR重复，其亮氨酸含量为14. 0%，其C末端还有个非LRR结构(CNL)的氨基酸序列(图 9 B)。图中双下线标示的氨基酸序列为/^/7基因特异性的氨基酸替换(substitution)，该 位点与下述另一个组成基因的基因特异性氨基酸替换位点结合起来，可以鉴别基因与 其他等位基因0°/毛Pik-m, Pik-p, Aj-S)的不同(详见实施例9)。朽7-2基因编码 1个由1021个氨基酸残基组成的蛋白多肽，分子量为114. 57 KD, 等电点为8. 64。利用COIL分析表明该蛋白多肽没有CC结构域，但是利用更为强大的预测 工具Paircoil2分析发现有CC结构域。Pi7_2蛋白属于NBS-LRR蛋白，NBS结构域中保守 的 kinase la (GFGGVGKTTIA)位于该多肽的第 211 个氨基酸残基；kinase 2(KSYILLIDDIff) 位于该多肽的第330个氨基酸残基；kinase 3a (GGRIIVTTRFQAV)位于该多肽的第358个 氨基酸残基，GLPL (EQVPEEIWKICGGLPLAIV)位于该多肽的第415个氨基酸残基，RNBS-D (CLLYLSIFPKGffK)位于该多肽的第488个氨基酸残基，MHDV (KTFQVHDMVLEYI)位于该多肽 的第553个氨基酸残基。而该蛋白的C-末端的610-960个氨基酸残基为13个不完整LRR 重复，其亮氨酸含量为17.0% (图10B)。图中双下线标示的氨基酸序列为基因特异性 的氨基酸替换(substitution)，该位点与上述另一个组成基因的基因特异性氨基酸替换位 点结合起来，可以鉴别基因与其他等位基因(朽毛Pik-m, Pik-p, /^ii)的不同(详 见实施例9)。实施例8 7^/7基因的表达特性分析
利用定量RT-PCR技术对基因的表达模式进行了分析。在抗病品种IRBL7-M接种 后不同的时间点(0 hr，12 hr, 24 hr, 72 hr, 120h)上采集叶片并提取其总RNA，利用反 转录试剂盒Superscript Reverse Transcriptase II进行反转录cDNA第一条链的合成。 RT-PCR的引物为，
RRT5F :GAAGCTCTGATCAACGGTATTCC, RRT5R :TCTTTGATCATCTTCGGGATACG ； RRT17F TGAACTTCCACGATTGGATCCAC, RRT17R :ACATGGTTCTTGAATACATCATGTC。定量RT-PCR 使用 CFX96 Real-time PCR 检测系统和 SYBR Premix Ex Taq 试剂盒 (宝生物公司)，操作按照试剂盒说明进行。图11 (左)为组成基因在不同的接种时间 点的相对表达水平，由此可以看出，该基因的表达类型为，从12 hr—72 hr逐步上调，然后 逐步下调。图11 (右)为另一个组成基因在不同的接种时间点的相对表达水平，由 此可以看出，该基因的表达类型为，12 hr—24 hr逐步上调，然后逐步下调。由此还可以看 出，该基因在接种对照(H2O)和接种病原菌之间表现明显不同的诱导型表达。2个基因都表 现为组成型表达，因为接种之前和之后都能检测到2个基因的表达。实施例9 7^/7基因序列在分子标记辅助选择育种中的应用
如实施例7所述，在/基因的2个组成基因中分别存在一个基因特异性的氨基酸 替换位点，利用这2个位点分别开发基因特异性的分子标记Pi7-SNP-1 (Pi7-SNP-1F: GCAGGTCAGCCAAGCAAT, Pi7_SNP_lR CAACCGTTGTTTTGCCTCC,扩增产物用限制性内切酶MseI 进行酶切)和 Pi7-SNP-2 (Pi7_SNP_2F: CGTGGAAGTTCAACAAAAGG, Pi7_SNP_2R CAGCACCTGTATTATCCCAT，扩增产物用限制性内切酶MfeI进行酶切)，二者结合既可用于鉴 别7^/7基因与其他等位基因QPik, Pik-p, Pik-m, Pik-s)的不同(扩增产物的酶切效果不 同；图12之泳道1与泳道2-5比较)，也可在杂交后代用于鉴定/^/7位点上的各种基因型， 即朽7/外7和/7i7//7i7的植株(酶切效果不同；图12之泳道1与泳道6-7比较)。这些信息 可在分子标记辅助选择育种过程中加以应用，以提高育种的目的性和效率。实施例10遗传转化/^/7基因产生的抗性植株的应用
将/^/7基因克隆到PCAMBIA1300等植物转化载体，导入EHA105等农杆菌菌株中，用于 转化感病的水稻品种Longjing 24 (龙粳24)及Q1063，共获得了 285株转化植株，其中155 株表现抗性反应(表1)。这说明可以用基因转化水稻感病品种，经过自交、纯化选择等 一系列育种程序之后，即可产生抗病品种而应用于生产中。
序列说明
SEQ ID NO. 1 & 2 是Pi7-7 和Pi的 核苷酸序列；SEQ ID NO. 3 & 4 是 SEQ ID NO. 1 & 2的编码产物；SEQ ID NO. 5 & 6是带有启动子的7^/7-7和/^7-J 核苷酸序列。SEQ ID NO. 7 & 8 是用来扩增 Pi的引物对；SEQ ID N0. 9 & 10 禾口 SEQ ID NO. 11 & 12 分别 是引物对 RRT5F、RRT5R 和 RRT17F、RRT17R ;SEQ ID NO. 13 & 14 是引物对 Pi7_SNP_lF 和 Pi7-SNP-1R ；SEQ ID N0. 15 & 16是引物对Pi7_SNP_2F和Pi7_SNP_2R ;SEQ ID NO. 17 26 分别是Pi的 kinase la、kinase 2、kinase 3a、GLPL 序列以及的 kinase la、 kinase 2、kinase 3a、GLPL、RNBS-D、MHD 序列。
权利要求
1.稻瘟病抗性基因朽7，其核苷酸序列如SEQID NO: 1或SEQ ID N0:2所示，或者是 SEQ ID NO: 1 和 SEQ ID NO:2 的串联序列。
2.根据权利要求1稻瘟病抗性基因Pi7，至少编码a)和b)所述氨基酸序列中的一种a)SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列；b)SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列。
3.权利要求1或2所述稻瘟病抗性基因7^/7基因的cDNA序列。
4.权利要求1或2所述稻瘟病抗性基因/^/7基因编码的蛋白。
5.由权利要求1或2所述稻瘟病抗性基因/^/7基因或权利要求3所述cDNA与启动子 构建的表达盒。
6.含有权利要求1或2所述稻瘟病抗性基因/^/7基因或权利要求3所述cDNA的表达 载体。
7.权利要求1或2所述稻瘟病抗性基因朽7基因、权利要求3所述cDNA、权利要求4 所述蛋白、权利要求5所述表达盒或权利要求6所述表达载体在制备转基因植物中的应用。
8.权利要求1或2所述稻瘟病抗性基因朽7基因、权利要求3所述cDNA、权利要求4 所述蛋白、权利要求5所述表达盒或权利要求6所述表达载体在提高水稻抗稻瘟病中的应用。
9.根据权利要求1或2所述稻瘟病抗性基因/^/7基因产生的分子标记。
10.权利要求9所述分子标记在水稻抗稻瘟病的辅助育种中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种稻瘟病抗性基因Pi7及其应用。本发明提供了所述水稻稻瘟病抗性基因Pi7的核苷酸序列及其编码的氨基酸多肽序列，该序列包含有2个基因，都属于CC-NBS-LRR抗性基因家族的成员，且皆为组成型表达的基因。本发明还提供了该基因在转化水稻或其它植物培育抗病品种方面的应用以及根据该基因序列产生的分子标记在育种中的应用。
文档编号C12N15/82GK102094027SQ20101057863
公开日2011年6月15日 申请日期2010年12月8日 优先权日2010年12月8日
发明者林菲, 潘庆华, 王玲, 甘霖, 翟纯 申请人:华南农业大学