专利名称：增强对稻瘟病菌的抗性的基因以及该基因的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及增强对稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)的抗性的基因以及该基因的 应用。更具体地说，本发明涉及能够增强对稻瘟病菌的抗性的Pi5-1蛋白和Pi52蛋白、编 码这些蛋白的基因、包括些基因的重组体载体、用该重组体载体转化的植物、植物的种子、 通过在植物中表达所述基因以增强对植物病原菌的抗性的方法、抗所述蛋白的抗体、以及 包括能够增强对植物病原菌的抗性的基因的组合物。
背景技术：
天然免疫应答是植物和动物存活的关键。该应答由用病原体识别受体(PRRs ；也 叫模式识别受体或抗病性蛋白)对与病原体相关分子模式(PAMPs)(也指微生物相关分子 模式)或无毒力蛋白(Avr)的检测所介导。在动物体中，细胞质内的PRRs家族介导凋亡 和防护病原体入侵关键的炎症反应，所述细胞质内的PRRs家族包括结合核苷酸的寡聚结 构域(NOD)。植物体也含有一系列的细胞内PRR蛋白，称为NB-LRR(结合核苷酸的-富含 亮氨酸的重复单位)R蛋白，它们与动物的NOD蛋白结构相似。这些植物NB-LRR蛋白的特 征是由N-端卷曲螺旋(CC)或Toll/白介素-1受体(TIR)结构域、中心NB结构域以及 C-端 LRR 结构域(Hammond-Kosack 禾口 Jones (1997) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48 575-607)组成的三结构域结构，以及典型的识别病原体来源的Avr蛋白(也叫效 应器)(Van der Biezen 和 Jones (1998) Trends Biochem. Sci. 23 :454_456)。稻瘟病是水稻最具破坏性的疾病之一，在种植水稻的世界各地均有发生。到目 前为止已鉴定了超过70个的对不同地理位置的稻瘟病病原体的稻瘟病菌(rice blast pathogen Magnaporthe oryzae)的分离株具有抗性的稻瘟病抗性基因(Ballini等(2008) Mol. Plant Microbe Interact. 21 :859_868)。例如，Pib对大部分的稻瘟病菌的日本分离 株具有很强的抗性(Wang等(1999)PlantJ. 19 :55_64)。相反，Pi37对稻瘟病菌的日本分离 株仅具有部分抗性，但对稻瘟病菌的中国分离株具有完全的抗性。因此，需要分离多个抗性 基因，以充分认识抗稻瘟病的分子基础。通过标记辅助的育种或通过转基因方法，这些基因 的特性将促进农业上的有用的水稻品种的发展。迄今为止，共9个稻瘟病抗性基因已被克隆和表征Pib、Pita、Pi9、Pi2和Piz_t、 Pi-d2、Pi36、Pi37、以及Pikm。除了 Pi_d2 (非-RD受体样激酶)之外，这些基因都编码 NB-LRR型蛋白。这些克隆的稻瘟病抗性基因的不同的特征已经被观察到。Pib蛋白包括重 复的NB区域。Pita缺乏典型的LRR，但包括由不同长度的不完全重复所组成的富亮氨酸 结构域(LRD)。在Pita的LRD发现单个的氨酸差异，以区分易感等位基因(susceptible alleles)的抗性。等位基因Pi2和Piz_t在三个连续的LRRs内显示8个氨基酸差异，这 些残基决定了抗性的特异性。Pi9基因与Pi2和Piz-t基因高度相似，位于染色体6上的 相同区域。Pikm-介导的抗性需要两个相邻NB-LRR基因Pikml-TS和Pikm2-TS。在这些克 隆的R基因中，只有Pita被发现与相应的稻瘟病曲霉菌无毒力蛋白AvrPita相互作用。因 而，由NB-LRR型蛋白介导的防御信号在水稻中的表征较弱。
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据报道，Pi5对从韩国和菲律宾收集的许多稻瘟病曲霉菌的分离株具有抗性 (Wang等(1994) Genetics 136:1421-1434)。为了获得对Pi5_介导的稻瘟病抗性的分子 基础进一步理解，我们使用了基于图谱的方法来分离Pi5基因组区域。我们先前在RIL260 水稻品种中把Pi5插入到染色体9短臂的170-kb的区间内(Jeon等(2003) Molecular Genetics and Genomics 269 :280_289)。根据韩国专利申请No. 10-0764563，描述了用于诱导植物疾病抗性的基因、包括该 基因的载体和由该载体获得的转化株。此外，根据韩国专利申请No. 10-0701302，描述了分 离自野生水稻的植物疾病抗性ogpr 1基因、该基因的氨基酸序列和使用该基因得到的转 化株。然而，上述的基因与本发明的基因是不同的。
发明内容
本发明是考虑到上述需求而进行的。具体来说，为了进一步缩小新的图谱种群 (mapping polulation)中的Pi5抗性基因座，通过对有抗性的基因组区域的序列的分析， 确定了两种类型的CC-NB-LRR基因，作为Pi5的候选基因。此外，生产了表达一个或两个上 述候选基因的转基因水稻株，并表征了它们抗稻瘟病曲霉菌的表型。为了解决上述问题，本发明提供了对稻瘟病曲霉菌具有增强抗性的Pi5_l和 Ρ 5-2蛋白。此外，本发明还提供了编码所述蛋白的基因。此外，本发明还提供了包括所述基因的重组体载体。此外，本发明还提供了用所述重组体载体转化的植物和该植物的种子。此外，本发明还提供了通过在植物中表达所述基因以增强对植物病原体抗性的方法。此外，本发明还提供抗所述蛋白的抗体。此外，本发明还提供了一种组合物，该组合物含有用于增强对植物病原体的抗性 的基因。根据本发明，基于Pi5_l基因和Pi5_2基因间的协同作用，增强了对植物病原体 (特别是稻瘟病曲霉菌)的抗性。
图1显示了 RIL260/IR50种群的Pi5基因座的染色体定位。(上)在RIL260/C039 和RIL260/M202的标记C1454和S04G03间，显示出170-kb的Ρ 5抗性基因组区域。(下) 在RIL260/IR50种群中确定的Pi5区域中8个罕见的重组体的示意图。相关的分子标记 间显示断裂点。空白条表示假定的RIL260基因组，黑条表示IR50基因组，阴影条表示在 两个基因组间的区域是杂合的。粗箭头表示通过图谱种群分析定界的携带有Pi5基因座的 130-kb的最小区间。确定了每个系F3子代对稻瘟病曲霉菌P06-6的抗性，R，抗性；S，易感 性；R/S，分离系(segregating line)。图2显示了 RIL260和Nipponbare品种中Pi5基因座的基因组序列比较。显示了 两个基因组的由RiceGAAS确定的预测的ORFs。NB-LRR基因，Ρ 5-1等位基因，以及Pi5_2 和Pi5-3基因用黑色箭头表示。在RIL260中缺失的Pi5-lNipponbare等位基因的N-端区域用绿色显示。推测的转座子(putative transposons)和假定的基因(hypothetical genes)分别用蓝箭头和灰箭头表示。有数字的空白箭头预测编码下列蛋白1、推测的真 核的翻译起始因子；2、推测的GTP-结合蛋白；3、推测的四氢叶酸酯合成酶；4、推测的醛糖 1-表异构酶；5、推测的组蛋白H5 ；6、推测的冷休克-DEAD-盒蛋白A ;7和10、锚蛋白样蛋 白；8和9、含重复HGffP的蛋白。红虚线表示RIL260和Nipponbare ORFs的高相似度(> 90%)。细线表示很少或没有同源性的染色体区域。箭头表示转录的方向。RIL260DNA序 列的间隙(gap)用虚线框表示。图3显示了对转基因水稻株的分析。(A)与稻瘟病曲霉菌P06-6接种后2天， Ρ 5-1, Ρ 5-2和PiS-l/PiSjF:转基因水稻株的PT-PCR分析。水稻Actinl基因被用于作 为这些反应的内部对照。(B)与稻瘟病曲霉菌P06-6接种后7天，Pi5-l，Pi5-2，和Pi5-1/ 卩士5-2&转基因株的疾病症状。(C)来源于对稻瘟病曲霉菌P06-6感染有反应的Pi5-l-63/ Ρ 5-2-74 F1子代的转基因株的F2子代的基因组DNA PCR分析和疾病反应。抗性品种(携 带Pi5的RIL260)和易感品种(缺失Pi5基因的Dongjin(DJ))用作对照。图4显示了 Pi5_l和Pi5_2的基因组结构，以及他们的基因产物。外显子以浅灰 色框表示，内含子以粗线表示。5'-及3'-非翻译区(UTR)以深黑框表示。ATG和TGA 分别表示翻译起始密码子和翻译终止密码子，数字显示氨基酸位置。图5和6分别显示了 Pi5_l蛋白和Pi5_2蛋白的氨基酸序列。这两种蛋白都含有 卷曲螺旋(CC)、核苷酸结合部位(NB)、富含亮氨酸的重复单位(LRR)、以及C-端区域(CT)。 用加下划线的斜体字表示的Pi5_l的31-67位氨基酸和Pi5-2的26-87位氨基酸包括CC基 序。以NB蛋白为特征的保守的内部基序(即P-环、激酶-2、RNBS-B、GLPL、RNBS-D和MHDV 结构域)用下划线和粗体表示。在许多NB-LRR蛋白的LRR中发现的保守的xLDL基序也是 加下划线的。图7显示了对用稻瘟病曲霉菌P06-6接种的RIL260品种的Pi5基因和PBZl基因 的RT-PCR分析。在病原体接种后0、4、12、24、48和72小时，从RIL260叶组织制备的cDNAs 用于试验。水稻Actinl基因被用作内部对照。
具体实施例方式为了实现上述发明目的，本发明提供了能增强对稻瘟病曲霉菌抗性的Pi5_l和 Ρ 5-2蛋白。在这方面，每种Pi5-1和Pi5-2蛋白不能独立地增强对稻瘟病曲霉菌的抗性。 相反，对稻瘟病曲霉菌抗性的增强只有通过Pi5-1和Pi5-2蛋白间的协同作用而获得。本发明的Pi5_l和Pi5_2蛋白的范围包括具有从水稻分离的SEQ IDNO :1或SEQ ID NO :2表示的氨基酸序列的蛋白和上述蛋白的功能等价物。术语“功能等价物”是指氨 基酸残基的替换或缺失的结果，所述功能等价物与SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2代表的氨 基酸序列具有至少70%、优选至少80%、更优选至少90%、仍然更优选95%的同源性，因 此，所述功能等价物表示与由SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2表达的蛋白具有基本上相同的 生物学活性的蛋白。术语“基本上相同的生物学活性”是指植物对稻瘟病曲霉菌增强的抗 性。本发明还提供了编码上述Pi5_l和Pi5_2蛋白的基因。本发明中，Pi5_l和Pi5_2 基因中的每一种均可以包括蜷曲螺旋(CC)、核苷酸结合结构域(NB)和富亮氨酸的重复单位(LRR)结构域(见图5和图6)。本发明的基因包括基因组DNA和编码Pi5-1和Pi5-2蛋 白的cDNA。更具体地说，Pi5-1的cDNA序列包括5 ‘和3 ‘非翻译区域(分别包括70bp和 220bp)，并且Pi5-1的cDNA序列编码1，025个氨基酸。Pi5_2的cDNA序列包括5'和3' 非翻译区域(分别包括73bp和164bp)，并且Pi5-2的cDNA序列编码1，063个氨基酸。优选地，本发明的Pi5_l和Pi5_2中的每一种的基因组DNAs均可以能包括如SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列。此外，本发明的Pi5_l和Pi5_2中的每一种 的cDNAs均可以包括如SEQ ID NO :5或SEQ IDNO :6所示的核苷酸序列。上述核苷酸序列 的变体也在本发明范围内。具体地说，所述基因可以包括与如SEQ ID NO :3至SEQ ID NO: 6所示的核苷酸序列具有至少70 %，优选至少80 %，更优选至少90 %，仍然更优选95 %的同 源的核苷酸序列。对于某一多核苷酸，术语“序列同源性”由对最佳排列的具有待比对区域 的两个核苷酸序列的比对来确定的。在这方面，待比对的区域中的部分核苷酸序列可以包 括相对于与最佳排列的两个序列有关的参比序列(无任何插入或缺失)而言的插入或缺失 (即，间隙)。此外，本发明提供了一个重组体载体，其中，该重组体载体包括本发明的Pi5_l和 Pi5-2。术语“重组体”是指能够复制异源核苷酸或表达该异源核苷酸的细胞、肽、异源肽 或由所述异源核苷酸编码的蛋白质。重组体细胞能够表达自然状态下的细胞中未发现的正 义或反义形式的基因或基因片段。此外，当通过人工方法将所述基因修饰并再次引入到所 述细胞中时，所述重组体细胞能够表达在自然状态中发现的基因。此处所用术语“载体”是指被递送至细胞的DNA片段和核苷酸分子。载体能复制 DNA，并在宿主细胞中独立地复制。术语“递送系统”和“载体”通常可以互换地使用。术语 “表达载体”是指包括期望的编码序列和对于在特定的宿主有机体中表达可操作连接的编 码序列所必需的其他适当的核苷酸序列的重组体DNA分子。优选地，本发明的重组体载体是一个重组的植物表达载体。所述植物表达载体的优选例子是Ti-质粒载体，当所述载体位于合适的宿主(诸 如根癌土壤杆菌)中时，所述Ti-质粒载体能转移它本身的一部分(即所谓的T区域)到 植物细胞中。目前，其他类型的Ti-质粒载体(见EPO 116 718 Bi)用于将杂和基因转移 到原生质体中，该原生质体通过将所述杂合DNA适当地插入到植物基因组中而产生新的植 物。特别地，Ti质粒载体的优选形式是在EP 0 120 516 Bl和USP No. 4，940，838中描述 的所谓二元载体。其他可以用于将本发明的DNA转移到植物宿主中的载体，可以选自双链 植物病毒(如，CaMV)、单链植物病毒、以及来源于复染色体病毒等的病毒载体(例如，不完 整的植物病毒载体)。所述载体的使用是有益的，特别是当植物宿主不适宜被转化的时候。
所述表达载体可以包括至少一个选择性标记。所述选择性标记是具有允许基于通 常的化学方法进行选择的特性的核苷酸序列。能被用来从非转化细胞中区分出转化的细胞 的任何种类基因均可以作为选择性标记。例子包括对除草剂(如草甘膦和磷酸麦黄酮) 有抗性的基因；以及对抗生素(如卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素和氯霉素)有抗性的基 因，但不局限于此。 对于根据本发明的一个具体实施方式
的所述植物表达载体，启动子可以是CaMV 35S、肌动蛋白、泛素、pEMU、MAS或组蛋白启动子中的任意一种，但不局限于此。术语“启动子”是指为了起始DNA的转录，RNA聚合酶所结合的DNA分子，并且启动子对应于结构基因 的上游DNA区域。术语“植物启动子”表示能在植物细胞中启动转录的启动子。术语“结构 启动子”表示在大多数环境情况和发育状态或细胞分化状态下有活性的启动子。由于转化 株可以在不同阶段通过不同的机制筛选出，因此，结构启动子对本发明就是优选的。因而， 本发明中并不限制筛选结构启动子的可能性。对于所述终止子，任何常规的终止子均可用于本发明。所述终止子的例子包括 胭脂碱合酶(NOS)、水稻α-淀粉酶RAmylA终止子、菜豆碱终止子和用于根癌土壤杆菌的 optopine基因的终止子等，但是不局限此。关于终止子的必要性，已知该区域能增加植物细 胞转录的可靠性和有效性。因而，由本发明的上下文看来，优选使用终止子。此外，本发明提供了一种植物，其中，该植物由根据本发明的重组体载体转化。根据本发明，所述植物是单子叶植物，包括水稻、大麦、玉蜀黍、小麦、黑麦、燕麦、 草坪草(turfgrass)、干草、粟、甘蔗、黑麦草、果树草(turfgrass)等等。最优选的是水稻。此外，本发明提供了所述植物的种子。优选地，所述种子是水稻种子。此外，本发明提供了增强对植物病原体的抗性的方法，其中，该方法包括用包括 Pi5-1和Pi5-2基因的本发明的重组体载体转化植物，并在该植物中表达Pi5-1和Pi5-2基 因的步骤。优选地，该病原体为稻瘟病曲霉菌。更优选地，所述植物是单子叶植物，包括水稻、 大麦、玉蜀黍、小麦、黑麦、燕麦、草坪草、干草、粟、甘蔗、黑麦草、果树草等等。最优选水稻。植物转化是指能够将DNA转入到植物的任何方法。这样的转化方法不必须具有再 生和/或组织培养的时期。目前植物物种的转化不只对于双子叶植物，对单子叶植物也非 常普遍。原则上，任何转化办法均可以用于将本发明的杂合DNA引入到适当的祖细胞。所 述转化方法可以选自以下方法用于原生质体的钙/聚乙烯甘醇方法(Krens，F. Α.等人， 1982, Nature 296,72-74 ；Negrutiu I.等人，June 1987，Plant Mol. Biol. 8,363-373)；用 于原生质体的电穿孔方法(Shillito R.D.等人，1985 Bio/Technol. 3，1099-1102)；用于 植物成分的纤维注射方法(Crossway A.等人，1986，Mol. Gen. Genet. 202，179-185)；用于 多种植物成分的粒子轰击方法(DNA或RNA包被的)(Klein Τ. Μ.等人，1987，Nature 327， 70)；或通过植物入侵或完整成熟花粉或小孢子转化(EP 0 301 316)而由根癌土壤杆菌介 导的基因转移中的(非完整)病毒感染方法。本发明中优选的方法包括土壤杆菌属介导的 DNA转移。尤其，在EP A 120 516和USP No. 4，940，838中描述的双载体技术优选用于本发 明。用于根据本发明的植物转化的术语“植物细胞”可以是任何植物细胞。植物细胞可 以是培养细胞、培养组织、培养器官或整体植物；优选地是培养细胞、培养组织或培养器官； 更优选的是培养细胞的任何形式。优选地，该植物是水稻。术语“植物组织”包括具有用于培养的各种形态的分化或未分化的植物组织(包 括根、茎、叶、花粉、种子)，例如单细胞、原生质体、蓓蕾和愈合组织，但不局限于此。植物组 织可以是整株的，或为器官培养、组织培养或细胞培养的状态。此外，本发明还提供了抗本发明的Pi5_l和Pi5_2蛋白的抗体。根据本发明，术 语“抗体”包括单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼源抗体(camelised antibody)、嵌合体抗体、单链Fvs (scFv)、单链抗体、单结构域抗体、Fab片段、F(ab)片段、
7结合有二硫化物的Fvs (SdFv)、抗个体遗传型(抗-Id)抗体或能够结合上述任何表位的片 段。尤其是免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段(例如包括抗原结合区域的 分子)，也包括在本发明的抗体内。免疫球蛋白分子可以是IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY 中的任意一类，或IgGp IgG2, IgG3、IgG4, IgA1和IgA2或它们的亚类中的任何一类。本发明的抗体可以根据常规的方法制备，该方法包括通过下述典型的操作将本 发明的基因克隆在表达型载体中，以获得蛋白并从这种蛋白中制备抗体。因此，也包括能够 从所述蛋白中生成的部分肽。关于本发明的部分肽，它含有至少7个氨基酸，优选至少9个 氨基酸，更优选至少12个氨基酸。本发明的抗体的类型是没有明确的限制的。单克隆抗体、 多克隆抗体和具有抗原结合特性的部分抗体都包括在本发明的抗体中。各种免疫球蛋白抗 体也包括在内。而且，如人源化抗体的特殊抗体等也包括在本发明的抗体内。此外，本发明还提供了含有能够增强对植物病原体抗性的Pi5_l和Pi5_2基因的 组合物。由于本发明的Pi5_l和Pi5-2蛋白基于它们之间的协同作用能够增强对植物病原 体的抗性，因此，含有Pi5-1和Pi5-2基因的组合物可以被用来增强对植物病原体的抗性。 优选地，该植物病原体是稻瘟病曲霉菌。参照下述实施例对本发明进行更详细的说明。然而，这只是具体地举例说明本发 明，本发明绝不局限于这些例子。实施例植物材料携带Pi5等位基因的RIL260水稻品种和稻瘟病易感品种(IR50)被用作本研究中 的亲本品系。RIL260和IR50品种杂交生成用于基因连锁分析的图谱种群。RII^eO/IRSOFi 个体的自花授粉种子(F2)被收集，以获得足够大的图谱种群。一种山茶水稻品种(Dongjin) 被用作稻瘟病曲霉菌接种和水稻转化实验的易感对照。RIL260和携带Pi5的单基因水稻品 系IRBL5-M被用来作为在稻瘟病曲霉菌实验有抗性的对照品种。另外的8个单基因水稻品 系，IRBLi-F5、IRBL9-W、IRBLb-B、IRBLta-Kl、IRBLz-Fu、IRBLks-F5、IRBLkm-Ts 和 IRBLsh-S 以及这些单基因品系易感背景品种Lijiangxintuanheigu(LTH)也被用于确定稻瘟病曲霉 菌分离株的毒力模式的接种实验。水稻幼苗生在白天室温30°C和夜里20°C的14/10小时 周期的光/暗循环的温室。病原体接种和疾病评估与Pi5抗性基因座不相容的一种菲律宾分离株稻瘟病曲霉菌P06-6已被通常地用 于检测这个基因座。为了在Pi5转基因水稻株中分析稻瘟病的抗性，使用了另外5个不同 的韩国稻瘟病曲霉菌分离株KJ105a、KJ107、KJ401、KI215和R01-1。所有接种和疾病评估 在 Kyung Hee 大学温室设施内，使用从 Liu 等(2002，Mol. Genet. Genomics 267:472-480) 轻微改良的方法进行。每种确定的重组体品系和转基因植物的F3子代的3周龄植物被用 于接种实验。稻瘟病曲霉菌在燕麦片琼脂培养基上于24°C黑暗中生长2周。分生孢子在收 集前4天通过用消毒的环刮盘表面而被诱导。接种的植物被放置于密封的容器内在黑暗中 24°C保持湿度24小时，然后转到在14/10小时(光/暗)光周期下24°C和80%湿度的生 长室。接种后7天，完成疾病评估。来自RIL260/IR50图谱种群子代的基因型分析C1454和JJ817的酶切扩增多态序列(CAPS)标记和一个序列特征扩增区域
8(SCAR)标记JJ803(符合先前报道的占主导地位的标记JJ803)被用于RIL260/IR50分离子 代的分析(表1)。按需使用占主导地位的标记JJ113-T3和S04G03。表1.本研究中使用的PCR引物 通过简单的小量方法从水稻株幼叶中分离基因组DNA (Chen和Ronal d (1999) Plant Mol. Biol. Rep. 17 :53_57)。用50ng基因组DNA做为模板，在最终的30 μ 1体系 (每种引物 ΙΟΟρΜ、每种 dNTP 200 μ MUOmM ρΗ 9. O 的 Tris-盐酸、2mM MgCl2、50mM KCl, 0. 聚乙二醇辛基苯基醚X-IOO和0. 5UTaq聚合酶)进行PCR分析。针对CAPS标 记，C1454和JJ817PCR产物随后分别被MluI和AseI消化，然后在琼脂糖凝胶上分级 (size-fractionated)。DNA测序和基因预测跨越Pi5基因座的RIL260双BAC(BIBAC)克隆被选作DNA序列分析。由小量制 备纯化的质粒被Sau3AI部分消化，并进行琼脂糖凝胶电泳分离。用商业试剂盒(凝胶提 取试剂盒，Qiagen)分离该0. 5-3. Okb的基因组DNA片段，亚克隆到pBluescriptll SK(-) (Clontech)的BamHI部位，然后用电穿孔转化到Ε. coli DH10B。为了对每种带有25_kb平 均大小的插入的BIBAC克隆进行DNA测序，筛选约60个克隆并用T3和T7引物在一个或两 个方向上进行测序。用BLAST(基本的局部对比检索工具)执行对NCBI资料库(http://www.ncbi. nlm. nih. gov/)的相似性检索。为了预测蛋白质编码基因区域，使用水稻基因组自动注释系 统(水稻 GAAS) (http://RiceGAAS. dna. affrc. go. jp/)。用于遗传互补实验的载体构建通过来自于BIBAC克隆的亚克隆重建Pi5_l和Pi5_2的基因组DNA区域(Jeon 等人.(2003)Mol. Genet. Genomics 269:280-289)。为了 构建携带整个 Pi5_l 编码区的
c1454
JJ8I7
jj803
PiS-/
Ρ 5-2
Actinl
PB7J
gtattacctgaaatcctagtggtg (seq id no: 7)
gatatggttgaaaagctaatctca (seq id no: 9)
aa<3tgagcatcx:agtgcctaatga
(seq id no: u)
tacaagttggcagctttatctgag (shq id no: 13}
agtgaactccaaacatgtgaacac (seq id no; 15) ggaactggataggtcaaggc (seq id no: 17)
accatctacaccatgaagcttaac (seq id no: 19)
9克隆，将包括0. 5-kb预测启动子的JJ80载体的6. 6-kbBamHI-SacI片段亚克隆到双载体 pC1300intC(基因库登记号· AF294978)中。合成的质粒JJ104用BamHI和BstEII进行消 化，并融合到JJ106的7. 3-kbHindIII-BstEII插入片段，构建具有5. 2_kb启动子区域的 JJ105。0. 5-kbSacI-XhoI 片段用引物5' -GTCCAAAGAGAAATGCGACAACAC-3‘ (SEQ IDNO 21) 和 5' -CGCTCGAGGTGGCATTTCATCCAATAGGCAAC-3' (SEQ IDNO 22)通过 PCR 进行扩增。将 合成的产物插入到JJ105延伸终止子区域，产生携带11，516-bp Ρ 5-1基因组区域的JJ204 构建体。Pi5-2基因由以下4个片段的多重配位构建4. 2-kbJJ113的EcoRI-BglIIDNA片 段；用引物 5' -GGATGATGTGATCTGCAGAGAAAC-3 ‘ (SEQ ID NO: 23)和 5' -CAGCCTCACTGA AATTGCGAAGCA-3‘ (SEQ ID NO :24)扩增的 200-bp BglII-ClaI PCR 产物；4. 2_kb JJ120 的ClaI-XbaI DNA片段；以及EcoRI-XbaI消化的pC1300intC载体片段。在合成的构建体 11117中，通过克隆11120的3.7-吐NsiI-Ec0RI片段，启动子区域被延伸。最后，通过插入 0. 9kb-延伸的终止序列到JJ142质粒的Eco065I部位，构成JJ212中Ρ 5-2的13，250-bp 的整个基因组序列。在JJ204和JJ212的克隆的基因组序列通过DNA测序被确定。转基因水稻株的产生通过电穿孔将Pi5_l和Pi5_2的基因组克隆转化到根癌土壤杆菌EHA105或 LBA4404，并根据已经确定的程序由土壤杆菌属转入到易感的水稻品种(Jeon等人.(2000) Plant J. 22 :561-570)。转基因植物(Ttl)是自花授粉的，T1种子被收集。因基于转基 因的分离模式的1\品系的自花授粉，继而从T2子代中选取纯合子Pi5-l(Pi5-l-63)和 Ρ 5-2 (Ρ 5-2-74)转基因品系。携带 Pi5_l 和 Pi5_2 的 F1 株从 Pi5_l_63 和 Pi5_2_74 品系 间的交叉产生，并自花授粉产生F2株。Ρ 5-1 和 Pi5_2cDNAs 的分离从与稻瘟病曲霉菌P06-6接种后24和48小时收集的水稻叶，并用Trizol试剂制 备两种总RNA制品。用PolyATtract mRNA隔离系统(Promega)从每批总RNA中获得纯化 的mRNA，并以1 1比例混合以合成cDNA。经由凝胶过滤按大小进行分级分离，以筛选超 过0. 5kb的cDNA，用单ZAP XR载体构建(Stratagene) cDNA文库。然后，经由集落印记杂 交(colony blothydridization)分别用Pi5_l和Pi5_2编码区域的相应的探针(570-bp JJ204的HindIII-KpnI片段和589-bp JJ212的EcoRV-SpeI片段部分)，筛选文库。通过 DNA测序分析对分离出的cDNA克隆进行分析。RT-PCR 分析为了检测响应病原体治疗在转录本积累上的变化，收集不同时期的来自于 10RIL260、IRBL5-M和与稻瘟病曲霉菌P06-6接种的转基因水稻株中的每一种的叶子，以进 行RT-PCR分析。总RNA用Trizol试剂和一种寡_dT的逆转录引物以及第一链cDNA合成 试剂盒(Roche)制备。在PCR反应中使用第一链cDNA和基因特异性引物。水稻Actinl基 因和发病机制相关的可诱导的烯丙苯噻唑(PBZl)基因的引物用于内部对照(表1)。PCR 条件如下94°C 5min，随后 28-35 个以下循环94°C，lmin ；56°C, Imin ；72°C,lmin,以及最 后在72°C 5min的延伸。对每个引物设定三个独立的扩增。实施例1 携带Pi5的130-kb的染色体区域的基因特征先前，Pi5抗病基因被划分到在水稻染色体9的两个侧翼标记S04G03和C1454之间的170-kb的区间。这个发现是我们先前分析产生于携带Pi5的RIL260和易感品种C039 之间的杂交，以及RIL260和另一个易感品种M202之间的杂交的两个种群的结果(Jeon等 人· (2003)Mol. Genet. Genomics269 :280-289)。为 了进一步描绘 Pi5 基因，在本研究中，我 们产生了来源于RIL260和另一个易感品种IR50之间杂交的第三个图谱种群。通过PCR筛 选，我们发现在检测过的易感品种中，只有IR50包括占主导地位的标记JJ817，这也在抗性 品种RIL260被发现(未显示数据)。相反，我们不能在包括C039和M202的其他易感品种 中扩增JJ817的PCR产物。我们选定IR50作为基于RIL260和IR50基因组区域之间的相 似性的一个标测亲本，我们推测其能促进在这个区间的重组。 为了确定在170-kbPi5基因座内的罕见重组，运用CAPS标记JJ817和C1454以及 SCAR标记JJ803的预先筛选策略，在我们目前的RIL260/IR50F2种群分析中使用。在被分 析的2，014个F2个体中，我们确定了 JJ817和JJ803之间的8个重组体，但没有位于JJ803 和C1454之间的重组体(图1)。用占主导地位的标记JJ113-T3和S04G03,我们随后确定 了我们在它们的子代(F3)株分离的这8个重组体的断裂点，这使我们能从杂合子基因型区 分出纯合子。总的来说，发现所有8个品系中含有JJ113-T3和JJ817之间的重组体。
在每例的F3子代中确定了源自这8个确定品系的稻瘟病曲霉菌P06-6感染的疾病 表型。这些实验进一步将Pi5基因定位在标记JJ817和C1454间一个130_kb的区间(图 1)。我们先前的和目前的结果显示标记JJ803和JJ113-T3都与Pi5介导的抗性共分离(图 1)。我们不能进一步在Pi5基因座上细致标测R基因。实施例2 包括Pi5基因座的130-kb染色体区域的基因序列分析为了确定候选在Pi5基因座的R基因，涵盖130_kbPi5区域的7个BIBAC克隆—— JJ80、JJ98、JJ106、JJ110、JJ113、JJ120和JJ123被筛选和测序。用这些序列对照公共数据 库的BLAST搜索和并且用水稻GAAS程序基因注释分析在RIL260品种的Pi5基因座预测整 体18个可读框(ORFs) :7个假定轭蛋白、2个NB-LRR蛋白、2个推测的转座子蛋白、1个推 测的真核生物的翻译起始因子、1个推测的GTP-结合蛋白、1个推测的四氢叶酸酯合成酶、1 个推测的醛糖1-表异构酶、1个推测的组蛋白H5、l个推测的冷休克-DEAD-盒-蛋白A和 1个锚定蛋白(图2)。从这基因组序列分析，2个显示与NB-LRR抗病基因同源性的Pi5候 选基因在RIL260和指定的Pi5-1和Pi5_2被确定。130-kb RIL260 Ρ 5区间的从JJ803到JJ817的接近90kb的区域，与由已测 序的品系Nipponbare表示的山茶基因组的相应区域进行比较(国际水稻基因组测序计 划2005;图2)。作为结果的序列分析显示，Nipponbare Pi5区间包括2个NB-LRR基因、 0s09gl5840(—个Pi5-1等位基因)和在RIL260、0s09gl5850、被指示的Pi5_3中没有确 定的基因。相反，Nipponbare缺乏相应的Pi5-2。值得注意的是，RIL260和Nipponbare的 Ρ 5-1等位基因的5个上游序列非常不同，显示在这些等位基因调节序列内的极端序列趋 势。另外，我们没有在RIL260和Nipponbare的90_kbPi5区间的任何其他部分发现显著的 序列相似性(图2)。这些结果提示Pi5抗病基因座在这些抗病和易感水稻品种有显著的差
已 升。由于该基因座的大间隙，我们没有比较Pi5抗病基因座与公开序列的籼稻品种 93-11的基因座。在一个接种实验，我们发现Nipponbare和93-11都对稻瘟病曲霉菌P06-6 易感(未显示数据)，说明它们都没有携带Pi5抗病基因。
实施例3 表达Pi5候选基因的转基因水稻株的特征要确定Pi5_l和Pi5_2两个候选基因哪个为Pi5对M.曲霉菌介导的抗病性负责， 我们分别用携带Pi5_l和Pi5-2的基因组克隆JJ204和JJ212，在天然启动子的对照下，转 化用土壤杆菌介导转化的易感粳稻品种Dongjin。生成的转基因品系的RT-PCR分析显示 独立转化的品系的15个Pi5-1中的13个以及13个Pi5-2中的12个，表达它们的在稻瘟 病曲霉菌P06-6接种的转基因(图3A)。主要的携带Pi5-1或Pi5-2的转基因品系(Ttl)被 与稻瘟病曲霉菌P06-6接种。令人惊讶的是，无论如何，13个Pi5-1或12个Pi5-2转基因 株中没有显示对稻瘟病曲霉菌分离株P06-6显示出抗性(图3B)。为了确定这些结果，我们 接种来自于这些Ttl品系的T1子代，并发现所有子代对对稻瘟病曲霉菌分离株的易感性与野 生型对照Dongjin品系相同。这显示无论Pi5-1或Pi5-2都不能单独赋予对稻瘟病曲霉菌 P06-6的抗性。实施例4 表达Pi5_l和Pi5_2的转基因水稻株的特征因为最近的报道(Sinapidou等人.(2004) Plant J. 38 :898_909)已经证实对于病 原体感染的抗性2个R基因是必需的，我们决定检测表达抗稻瘟病的2个候选基因株。我 们因而通过一个高度易感纯合子Pi5-1品系#63(Pi5-l-63)与高度易感纯合子Pi5_2品系 #74(Pi5-2-74)杂交生成携带Pi5-1和Pi5-2的转基因株。基因表达分析显示来源于在稻 瘟病曲霉菌P06-6接种上Pi5-1和Pi5-2基因均表达的杂交的F1株。引人注目的是，23个 PiS-l-eS/PiSHAF:株检测均显示完全抗稻瘟病曲霉菌P06-6。携带Pi5_l或Pi5_2转 基因品系像先前确定的那样易感(图3B)。为了确定这个发现，我们把来自于Pi5-l-63/Pi5-2_74 F1品系的F2子代株与瘟病 曲霉菌分离株P06-6接种。72个被检测的F2子代中37个携带2个转基因，并赋予抗稻瘟 病曲霉菌P06-6。相反，缺乏Pi5-1和Pi5-2的F2子代是易感的(图3C)。RT-PCR分析证 实Pi5-l-63/Pi5-2-74品系在稻瘟病曲霉菌P06-6接种之前和之后在相似于RIL260的水 平表达它们的转基因。为了检测如果Pi5_l和Pi5-2对抗其他稻瘟病曲霉菌分离株是必需 的，我们接种与Pi5不相容的带有4个另外的分离株的转基因株。这些分离株显示在携带不 同单R基因水稻品系的不同的毒力模式，确认这些是真正不同的稻瘟病分离株。我们发现 共表达Pi5-1和Pi5-2的转基因株抗所有被检测的稻瘟病曲霉菌分离株。抗病供者RIL260 和携带Pi5的单基因品系IRBL5-M也抗这4个分离株。相反，Dongjin和只携带Pi5_l或 Pi5-2的植株对检测的稻瘟病曲霉菌分离株易感(表2)。这些结果证实2个NB-LRR基因 Ρ 5-1和Pi5-2对Pi5-介导的抗稻瘟病曲霉菌分离株是必需的。表2.转基因株对稻瘟病曲霉菌分离株的疾病反应
a转基因植株bR，抗性；S，易感性。Ρ 5单基因品系IRBL5-M对稻瘟病曲霉菌KI215易感。基因组序列分析显示携带 Ρ 5的IRBL5-M基因组区域与RIL260的相同(未显示数据)。另外，RT-PCR分析进一步证 实IRBL5-M在稻瘟病曲霉菌P06-6接种之前和之后，表达Pi5_l和Pi5_2的水平与RIL260 相似。基于这些结果，我们假定Pi5-1和Pi5-2均表达的转基因株将也对稻瘟病曲霉菌 KI215易感。实际上，我们的接种结果显示Pi5-1和Pi5-2均表达的转基因株对稻瘟病曲霉 菌KI215易感。相反，RIL260被发现抗稻瘟病曲霉菌KI215，这显示可能包含另一个对这个 分离株赋予抗性的R基因(表2)。实施例5 由Pi5_l和Pi5_2编码的蛋白的特性和系统进化分析为了分离研究中相对于2个Pi5基因的cDNA克隆，用从稻瘟病曲霉菌P06-6接 种24和48小时后收集的水稻叶分离的mRNA的Uni-ZAP XR载体，建立RIL260的cDNA文 库。该文库用集落杂交法筛选，用Pi5_l和Pi5-2的基因特异区域作为探针。我们分别确定 Ρ 5-1和Pi5-2的7个和5个cDNA克隆。序列分析进一步显示包含整个开放阅读框(ORF) 的Pi5-1 cDNA的3个克隆，而其他缺失包绕ATG翻译起始密码子的N-末端。在全部ORF 克隆中，最长的克隆(#1-7)被全部测序。这些实验显示T Pi5-1编码1，025个氨基酸的蛋 白，ORF分别侧临70bp和220bp的5'-和3'-非翻译区(基因库登记号· EU869185 ；图 4和5)。克隆的序列分析显示了包括整个ORF的5个克隆中的3个。在它们中间，最长的 克隆(#2-4)被进一步通过测序特征化。该分析显示Pi5-2编码1，063个氨基酸的ORF，并 且这个ORF分别侧临73bp和164bp的5'-和3'-非翻译区(基因库登记号.EU869186 ； 图4和6)。其推导的氨基酸序列比较显示，Pi5_l和Pi5_2编码N-末端CC，中心定位的NB和 LRR,并且也编码C-末端区域(图5和6)。用Pfam和SMART数据库的保守的区域扫描预测 Ρ 5-1的109-576位和Pi5_2的109-567位残基包括NB区域，这是被植物R基因产物共享 的信号基序。以NB-包含R基因产物为特征的保守的内部结构域也在Pi5-1和Pi5-2中确 定，包括P-环、激酶_2、RNBS-B、GLPL、RNBS-D和MHDV结构域。另外用Paircoil2程序分析 (http://groups, csail.mit. edu/cb/paircoil2/)用阈值 0· 1 预测一个在 Pi5_l 的 31-67 位和Pi5-2的26-87位氨基酸之间潜在的CC结构域，显示这些蛋白属于NB-LRR抗蛋白CC亚群。Ρ 5-1和Pi5_2的LRR区域分别由24. 3%和22. 6%的亮氨酸残基组成，并包含一 系列不同长度的不完整的重复单位(10-12)(图5和6)。值得注意的是，Ρ 5-1和Pi5-2 蛋白的一些重复单位与在其他细胞浆R蛋白发现的共有序列LxxLxxLxxLxLxxC/N/SxOO LxxLPxx匹配。Pi5_l的第一和第三个重复区域以及Pi5_2的第三和第六个重复区域包括 xLDL基序，该基序在许多NB-LRR蛋白的第三个LRR是保守的(图5和6)。仍然值得注意 的是，Ρ 5-1和Pi5-2蛋白包含一个与其他NB-LRR蛋白不同的独特的C末端，不与任何已 知蛋白基序匹配。cDNA和这些R基因的基因组序列之间的序列比较显示，Pi5_l和Pi5_2分别携带 5个和6个外显子(图4)。Pi5基因比较其他对M.曲霉菌赋予抗性的克隆的水稻R基因， 在它们的编码区域内有更大数量的内含子。而且，Pi5-1和Pi5-2基因在它们的RNBS-D和 MHDV结构域均包含内含子。实施例6 :Pi5-l和Pi5_2基因的表达分析为了检测是否这两个确定的R基因的表达在病原体治疗时有变化，我们在稻瘟病 曲霉菌P06-6感染的RIL260、IRBL5-M和Pi5_l-63/Pi5-2_74转基因植物进行这两个基因 的RT-PCR分析(图7)。为了这个目的，使用从在稻瘟病曲霉菌P06-6接种后不同时间点 收集的3周龄植株的叶子分离总RNA。该结果显示Pi5-1在病原体攻击12小时后表达增 加，而Pi5-2基因在感染前后的RIL260均持续低水平表达(图7)。IRBL5-M和Pi5_l_63/ Ρ 5-2-74品系也展示与Pi5基因相似的表达模式。这些发现显示Pi5-1和Pi5_2均在病 原体感染期间表达，提示被编码的蛋白也共表达。PBZl转录本——病原体诱导基因——在 M.曲霉菌处理的叶子累积到高水平(图7)。
1权利要求
增强对稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)的抗性的Pi5 1蛋白和Pi5 2蛋白，其中，该Pi5 1蛋白和Pi5 2蛋白分别由SEQ ID NO1和SEQ ID NO2组成。
2.编码权利要求1所述的Pi5-1蛋白和Pi5-2蛋白的基因。
3.根据权利要求1所述的基因，其特征在于，所述Pi5-1蛋白和Pi5-2蛋白的基因组 DNA分别由SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4的核苷酸序列组成，并且所述Pi5_l蛋白和Pi5_2 的cDNA分别由SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6的核苷酸序列组成。
4.一种重组体载体，其中，该重组体载体包括权利要求2所述的基因。
5.一种植物，其中，该植物由权利要求4所述的重组体载体转化。
6.根据权利要求5所述的植物，其特征在于，该植物为单子叶植物。
7.权利要求5所述的植物的种子。
8.一种增加对植物病原体的抗性的方法，其中，该方法包括如下步骤用权利要求4所 述的重组体载体转化植物，并继而在该植物中使Pi5-1蛋白和Pi5-2蛋白的基因表达。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述植物病原体为稻瘟病菌 (Magnaporthe oryzae)0
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述植物为单子叶植物。
11.权利要求1所述的Pi5_l蛋白和Pi5-2蛋白的抗体。
12.一种用于增强对植物病原体的抗性的组合物，其中，该组合物含有权利要求2所述 的基因。
全文摘要
本发明涉及能够增强对稻温病菌(Magnaporthe oryzae)的抗性的Pi5-1蛋白和Pi5-2蛋白、编码这些蛋白的基因、包括这些基因的重组体载体、用重组体载体转化的植物、植物的种子、通过在植物中表达所述基因以增强对植物病原菌的抗性的方法、抗所述蛋白的抗体、以及包括能够增强对植物病原菌的抗性的基因的组合物。
文档编号C12N1/11GK101932710SQ200980100692
公开日2010年12月29日 申请日期2009年7月15日 优先权日2008年7月18日
发明者P·罗纳德, 卢在焕, 安镇兴, 宋玟英, 徐廷弼, 徐荣秀, 曹培健, 李祥圭, 李起焕, 田钟声, 金惠景, 韩胎龙, 高世虎 申请人:庆熙大学校产学协力团;加州大学校务委员会