水稻抗稻瘟病基因、分离克隆方法、分子标记及应用
【专利摘要】本发明公开了一个水稻抗稻瘟病基因、分离克隆方法、分子标记及应用，它以广谱高抗稻瘟病常规水稻品种：自选2号为供体，稻瘟病敏感水稻品种：丽江新团黑谷LTH为受体，通过二者正反杂交，构建F2群体，通过图位克隆的方法定位到一个含NB?ARC结构域的抗稻瘟病目标基因，该目标基因在抗感亲本之间仅存在1个氨基酸的差异，且差异位于NB?ARC结构域的磷酸结合环P?loop上，确定该基因为水稻抗稻瘟病基因Pitb，最后根据抗感基因的差异开发出相应的分子标记。将水稻抗稻瘟病基因Pitb转入感稻瘟病的水稻品种中，有助于产生新的抗稻瘟病病水稻新品种。水稻抗稻瘟病基因Pitb的分子标记可大大提高该基因应用于育种选择效率，缩短育种时间。
【专利说明】
水稻抗稻瘟病基因、分离克隆方法、分子标记及应用
技术领域
[0001]本发明涉及分子生物学技术及育种领域，尤其是涉及一个水稻抗稻瘟病基因 Pitb、分离克隆方法、分子标记及其在水稻改良中的应用。
【背景技术】
[0002]由稻痕病菌(Magnaporthe grisea)引起的稻痕病是水稻种植中最具毁灭性的真 菌病害之一，也是世界性的真菌病害(Okuyama et al · ,2011; Inoue et al · ,2013)。至今已 有80余个国家有稻瘟病发生的报道，其中以亚洲和非洲发病最为严重，据不完全统计，全球 每年因稻瘟病造成水稻减产达11%~30%，年平均超过一千万吨，严重威胁着世界的粮食 生产(Wilson et al.，2009;Zhai et al· ,2011 ;Xu et al· ,2014)。目前培育和推广应用抗 性品种是防治稻痕病最经济有效且环保安全的措施(Ashikawa et al.，2008;Takahashi et al.，2010)。常规育种囿于抗源缺乏、远缘杂交的生殖隔离和效率低下，在培育抗稻瘟病 新品种上很难满足生产要求(Hayashi et al.，2009;Yuan et &1.，2011)。实践证明，利用 分子标记辅助选择(marker-assisted selection，MAS)育种实现抗病基因的定向转移和聚 合，在培育持久抗稻瘟病新品种上显示出常规育种无法比拟的优势(李彬等，2014)。水稻抗 稻瘟病新基因的克隆则是有效地开展水稻抗病分子标记辅助选择育种的重要前提和基础。
[0003] 抗稻瘟病基因的定位和克隆是进行水稻抗病分子作用机制研究的基础，有助于揭 示寄主与病原菌互作机理，随着分子生物学的发展，定位和克隆抗性基因已成为当今分子 病理学的热门课题(Lee et al.，2009;Lei et al.，2013)。在过去的数十年，科学家对稻瘟 病抗性进行了广泛的分子遗传研究，截至2015年3月，已至少报道了69个抗稻瘟病位点，84 个主效基因，已成功克隆的有24个主效基因，其中Pik(Pik-l和Pik-2)、Pit、Pita、Piz-t、 卩1(12、？1(13/?125、？121、？136和？137等基因的抗病等位基因与感病等位基因之间的基因编 码区存在碱基替换;其他基因的抗病等位基因与感病等位基因序列或片段长度也存在多态 性（国家水稻数据中心http: //www.ricedata. cn/gene)。
[0004] 在这些报道中，除？11、？12、？19、？1-20、？1-33、？1-40、卩11111、？11^-11^^54等少数几 个具有广谱抗性外，其余大都表现为生理小种特异抗性（Qu et al.，2006;Xu et al.， 2008;Zhu et al.，2012)。同时，所定位或克隆的抗稻瘟病基因多源于野生稻资源，而从具 有优良农艺性状的水稻材料中定位和克隆抗性基因的报道不多见，由于野生稻的种质资源 本身农艺性状较差，在育种实践中容易出现不利基因的连锁累赘，导致这些抗性基因难以 被直接利用，难以满足抗稻瘟病育种的要求(Chen et al.，2006;Xu et al.，2014)。然而， 如果从农艺性状优良的广谱抗稻瘟病品种中挖掘新的抗病基因，将有利于缩短抗病品种的 育种周期从而提高育种效率。
[0005] 水稻抗稻瘟病基因有着类似的保守结构域，根据这一特点，可将抗稻瘟病性基因 分成三类:NBS_LRR(nucleotide binding site-leucine rich repeat motif)类、凝集素 受体类和脯氨酸受体类。目前已报道的抗稻瘟病基因除Pid2(Chen et al.，2006)和pi21 (Fukuoka et al. ,2009)外都属于NBS-LRR类，NBS-LRR蛋白质含有2个典型的结构域:核苷 酸结合位点(NBS)及富亮氨酸重复序列(LRR)(刘浩等，2014) JBS结构域具有ATP或GTP结合 水解功能，通过获得能量来抵御病原菌入侵，并能够改变ATP的构象从而传递信号分子 (McHale et al.JOOehLRR结构域趋向高度可变，该区域内含有一系列的β折叠，基因片段 的插入与缺失会导致β折叠的方向改变，其易于改变的结构可能与其能够特异性识别病原 物效应蛋白质有关(Joshi et al.，2013)。
[0006] NB-ARC结构域是NBS的扩大结构域(Takken ET AL.，2009)。咄41?(：结构域中，NB指 核苷酸结合序列（Nucleotide binging site)，ARC分别指凋亡蛋白酶激活因子1 (Apoptotic protease-activating factor-1)、抗病蛋白（Resistance protein)和线虫死 亡蛋白4(Caenorhabditis elegans death_4protein) (Schmutz et al ·，2010) 〇 已有石开究 表明蛋白质的NB-ARC结构域在细胞凋亡、超敏反应及抗病反应中发挥重要作用，特定氨基 酸的变异会导致功能的改变，例如，Tameling等(2006)将番茄含有NB-ARC结构域的抗性蛋 白1-2，P-loop基序第495位氨基酸由天冬氨酸变为缬氨酸，导致该植株发生自激活的超敏 反应。Tang等(2011)将水稻含NB-ARC结构域的NLS1蛋白，NB结构域GLPL基序附近第366位由 丝氨酸变为苏氨酸，第367位氨基酸由丝氨酸变为天冬氨酸，分别导致植株产生持续激活的 防卫反应。迄今，在水稻的抗稻瘟病基因研究中还未见含NB-ARC结构域基因的报道。
[0007] 传统选育方法依赖于抗性鉴定和表型选择，不仅周期长、效率低而且受许多条件 的限制，在培育抗稻瘟病新品种上难以满足生产要求(陈德西等，2010)。随着DNA分子标记 技术的迅猛发展，利用抗病基因相应的分子标记进行辅助选择，可大大提高育种选择效率 (杨勤忠等，2009;王惠梅等，2012)。作物育种实践中已开发了许多种分子标记，如马建等 (2015)根据抗感品种中Pi35等位基因序列差异特性，开发了功能性分子标记Pi35-dCAPS， 利用该标记成功的鉴定确认了 5份藤系138衍生品种及2份微核心种质品种携带Pi35基因。 刘洋等(2008)利用抗稻瘟病基因 Pib自身序列及其等位的感病基因序列建立的分子标记结 合运用，可有效地从水稻种质资源中快速而准确地选择出抗稻瘟病基因 Pib，并能在分离世 代群体中选择出含抗稻瘟病基因 Pib的纯合单株。
【发明内容】
[0008] 本发明的第一个目的是提供一个水稻抗稻瘟病基因 Pitb，以增加水稻抗稻瘟病基 因的储备。
[0009] 本发明的第二个目的是提供一种水稻抗稻瘟病基因 Pitb的分离克隆方法。
[0010]本发明的第三个目的是提供一个水稻抗稻瘟病基因 Pitb的分子标记。
[0011] 本发明的第四个目的是提供水稻抗稻瘟病基因 Pitb在水稻育种中的应用。
[0012] 本发明的第一个目的是这样实现的：
[0013] 一个水稻抗稻瘟病基因 Pitb，特征是:水稻抗稻瘟病基因 Pitb的基因组序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0014] 本发明的第二个目的是这样实现的：
[0015] 一种水稻抗稻瘟病基因 Pitb的分离克隆方法，特征是：
[0016] A、以广谱高抗稻瘟病常规水稻品种：自选2号，为抗稻瘟病基因的供体材料，并与 稻瘟病敏感水稻品种：丽江新团黑谷LTH为试验材料，通过二者正反杂交，构建F2群体；其 中：广谱高抗稻瘟病常规水稻品种：自选2号是在水稻常规品种lemont与广西普通野生稻杂 交的后代中，筛选得到的水稻抗稻瘟病水稻材料，目前已进行了6代连续自交，抗病性状稳 定;通过来自全国ZA、ZB和ZC三个种群的15个菌株接种鉴定试验，确认其为广谱高抗水稻材 料；
[0017] B、通过图位克隆的方法定位到一个抗稻瘟病目标基因，三个步骤如下：
[0018] (1)、首先利用BSA技术进行初步定位，将抗稻瘟病目标基因锁定在水稻基因组第 12号染色体短臂上；
[0019] (2)、然后利用染色体步移的方法进行抗稻瘟病目标基因的精细定位，将抗稻瘟病 目标基因锁定在了 143kb的区间内；
[0020] (3)、最后通过生物信息学分析和测序比对，该区间内有一个含NB-ARC结构域的基 因（0sl2g0270300)，该基因总长3454bp，包含1个外显子和2个内含子，编码899个氨基酸序 列;将含NB-ARC结构域的基因（0sl2g0270300)确定为抗稻瘟病目标基因；
[0021]编码899个的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示，或该序列替换、缺失、或添加一个或 几个氨基酸残基而形成的具有相同功能的氨基酸多肽；
[0022] C、经测序分析:该抗稻瘟病目标基因在抗感亲本之间仅存在1个氨基酸的差异，即 第189位抗病产物为组氨酸，而感病产物为谷氨酰胺，且该差异位于NB-ARC结构域的磷酸 结合环P-loop上，因此确定该基因为水稻抗稻瘟病基因 Pitb;
[0023] D、通过抗性鉴定和遗传分析发现:F1代的个体都表现为稻瘟病抗性，F2代植株呈 现明显的抗感分离，在正交群体中，抗、感稻瘟病植株数分别为158、42,分离比为3:1(x 2 = 0.9<乂2(0.05)=3.8);在反交群体中，抗、感稻瘟病植株数分别为143、57，分离比为3:1(乂 2 =0.63<x2(0.05) = 3.8)，结果说明：自选2号对稻瘟病菌的抗性由1对显性主效基因控制， 该显性主效基因为水稻抗稻瘟病基因 Pitb。
[0024] 本发明的第三个目的是这样实现的：
[0025] 一个水稻抗稻瘟病基因 Pitb的分子标记，特征是:根据序列差异，利用BioEdit软 件搜索酶切位点，再利用Primer 5.0设计的扩增引物，得到适合水稻抗稻瘟病基因 Pitb的 分子标记（CAPS): GGGATTGATGGTCCAAGG/CTTTTATCTTTCAAGAAT，Bsp 12861。
[0026] 本发明的第四个目的是这样实现的：
[0027] 水稻抗稻瘟病基因 Pitb在水稻育种中的应用，得到抗稻瘟病的水稻。
[0028] 水稻抗稻瘟病基因 Pitb的分子标记在水稻育种中的应用，得到抗稻瘟病的水稻。 [0029]本发明具有如下的有益效果：
[0030] 将本发明提供的水稻抗稻瘟病基因 Pitb转入感稻瘟病的水稻品种中，有助于产生 新的抗稻瘟病水稻新品种。本发明提供的水稻抗稻瘟病基因 Pitb的分子标记可大大提高该 基因应用于育种选择效率，缩短育种时间。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
[0032] 实施例1:水稻抗稻瘟病基因 Pitb的遗传分析
[0033] 以广谱高抗稻瘟病常规水稻品种：自选2号为水稻抗稻瘟病基因的供体，稻瘟病敏 感水稻品种:丽江新团黑谷LTH为水稻抗稻瘟病基因的受体，通过二者正反杂交，构建F2群 体，通过抗性鉴定和遗传分析发现:F1代的单株都表现为稻瘟病抗性，F2代植株出现了抗感 分离，且符合3:1的分离比，即：自选2号对稻瘟病菌的抗性由1对显性主效基因控制，该显性 主效基因为水稻抗稻瘟病基因 Pitb。
[0034] 实施例2:水稻抗稻瘟病基因 Pi tb的定位
[0035] 采用图位克隆的方法定位水稻抗稻瘟病基因 Pitb，分为三个步骤：
[0036] (1)、首先利用BSA技术进行初步定位，将抗稻瘟病目标基因锁定在水稻基因组第 12号染色体短臂上；
[0037] (2)、然后利用染色体步移的方法进行抗稻瘟病目标基因的精细定位，将抗稻瘟病 目标基因锁定在了 143kb的区间内；
[0038] (3)、最后通过生物信息学分析和测序比对，该区间内有一个含NB-ARC结构域的基 因（0sl2g0270300)，该基因总长3454bp，包含1个外显子和2个内含子，编码899个氨基酸序 列;将含NB-ARC结构域的基因（0sl2g0270300)确定为抗稻瘟病目标基因；
[0039]编码899个的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示，或该序列替换、缺失、或添加一个或 几个氨基酸残基而形成的具有相同功能的氨基酸多肽。
[0040]经测序分析:该抗稻瘟病目标基因在抗感亲本之间仅存在1个氨基酸的差异，即第 189位抗病产物为组氨酸，而感病产物为谷氨酰胺，且该差异位于NB-ARC结构域的磷酸结合 环P-loop上，因此确定该基因为目标基因：水稻抗稻瘟病基因 Pitb。
[0041 ] 实施例3:水稻抗稻痕病基因 Pitb的分子标记(CAPS)的开发
[0042]水稻抗稻瘟病基因 Pitb在抗感亲本之间仅存在1个氨基酸的差异，即：第189位抗 病产物为组氨酸，而感病产物为谷氨酰胺，该差异也是由1个碱基变异引起(C/A)。
[0043]
【申请人】根据这一特点，利用BioEdit和Primer5.0软件设计和开发了分子标记 (GGGATTGATGGTCCAAGG/CTTTTATCTTTCAAGAAT，Bsp 12861)，分子标记在群体中未检测到重组 体，表现为共分离。
[0044] 实施例4:
[0045] 水稻抗稻瘟病基因 Pitb用在水稻育种中，得到抗稻瘟病的水稻。
[0046] 实施例5:
[0047]水稻抗稻瘟病基因 Pitb的分子标记用在水稻育种中，得到抗稻瘟病的水稻。
[0048] 附录：
[0049] 序列表独立文本：
[0050] A、水稻抗稻瘟病基因 Pitb的基因组序列：SEQ ID NO: 1;
[0051 ] 〈110>井冈山大学
[0052] 〈120>水稻抗稻瘟病基因、分离克隆方法、分子标记及应用
[0053] <160>3
[0054] <210>1
[0055] <211>3454
[0056] <212>DNA
[0057] 〈213>水稻（Oryza sativa L.)
[0058] <400>1
[0060]
[0061 ] B、水稻抗稻瘟病基因 Pitb的编码区序列：SEQ ID N0:2;
[0062] <210>2
[0063] <211>2700
[0064] <212>DNA
[0065] 〈213>水稻（Oryza sativa L.)
[0066] <220>
[0067] <221>CDS
[0068] <222>(1)...(2700)
[0069] <400>2
[0071]
[0072] C、水稻抗稻瘟病基因 Pitb的编码氨基酸序列：SEQ ID N0:3;
[0073] <210>2
[0074] <211>899
[0075] <212>PRT
[0076] 〈213>水稻（Oryza sativa L.)
[0077] <400>3
[0078]
[0079]
[0080]
[0081]
【主权项】
1. 一个水稻抗稻瘟病基因 Pitb，其特征在于：水稻抗稻瘟病基因 Pitb的基因组序列如 SEQ ID N0:1 所示。2. -种水稻抗稻瘟病基因 Pitb的分离克隆方法，其特征在于： A、 以广谱高抗稻瘟病常规水稻品种：自选2号为抗稻瘟病基因的供体材料，并与稻瘟病 敏感水稻品种:丽江新团黑谷LTH为试验材料，通过二者正反杂交，构建F2群体； B、 通过图位克隆的方法定位到一个抗稻瘟病目标基因，三个步骤如下： (1) 、首先利用BSA技术进行初步定位，将抗稻瘟病目标基因锁定在水稻基因组第12号 染色体短臂上； (2) 、然后利用染色体步移的方法进行抗稻瘟病目标基因的精细定位，将抗稻瘟病目标 基因锁定在了 143kb的区间内； (3) 、最后通过生物信息学分析和测序比对，该区间内有一个含NB-ARC结构域的基因： 0sl2g0270300,该基因总长3454bp，包含1个外显子和2个内含子，编码899个氨基酸序列;将 含NB-ARC结构域的基因：0sl2g0270300确定为抗稻瘟病目标基因； 编码899个的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示，或该序列替换、缺失、或添加一个或几个 氨基酸残基而形成的具有相同功能的氨基酸多肽； C、 经测序分析：该抗稻瘟病目标基因在抗感亲本之间仅存在1个氨基酸的差异，即第 189位抗病产物为组氨酸，而感病产物为谷氨酰胺，且该差异位于NB-ARC结构域的磷酸结合 环P-loop上，因此确定该基因为水稻抗稻瘟病基因 Pitb; D、 通过抗性鉴定和遗传分析发现:F1代的个体都表现为稻瘟病抗性，F2代植株呈现明 显的抗感分尚，在正交群体中，抗、感稻痕病植株数分别为158、42,分尚比为3:1，x 2 = 0.9< 7(0.05)=3.8;在反交群体中，抗、感稻瘟病植株数分别为143、57，分离比为3:132 = 0.63 <x2(0.05) = 3.8，结果说明：自选2号对稻瘟病菌的抗性由1对显性主效基因控制，该显性 主效基因为水稻抗稻瘟病基因 Pitb。3. -个水稻抗稻瘟病基因 Pitb的分子标记，其特征在于：根据序列差异，利用BioEdit 软件搜索酶切位点，再利用Primer 5.0设计的扩增引物，得到适合水稻抗稻瘟病基因 Pitb 的分子标记:GGGATTGATGGTCCAAGG/CTTTTATCTTTCAAGAAT，Bsp 12861。4. 水稻抗稻瘟病基因 Pitb在水稻育种中的应用。5. 水稻抗稻瘟病基因 Pitb的分子标记在水稻育种中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK106086032SQ201610414870
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月15日 公开号201610414870.2, CN 106086032 A, CN 106086032A, CN 201610414870, CN-A-106086032, CN106086032 A, CN106086032A, CN201610414870, CN201610414870.2
【发明人】孙惠敏, 郑卓, 吴丽花
【申请人】井冈山大学