一种具有启动子功能的dna片段及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种具有启动子功能的DNA片段及其应用。该DNA片段为如下任一序列：(a)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或者其互补序列；(b)对如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列进行一个或多个核苷酸取代、缺失或添加所获得的，具有与如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列相同的作为启动子功能的核苷酸序列或者其互补序列；(c)对如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列添加一个或多个核糖体结合位点的序列。该DNA片段具有启动子的功能，有很强的特异表达活性，在不需要添加诱导物的条件下即能实现外源基因的高表达，特别是为枯草芽孢杆菌表达外源基因提供了有效的元件。
【专利说明】
一种具有启动子功能的DNA片段及其应用
技术领域
[0001]本发明涉及一种DNA片段，具体涉及一种具有启动子功能的DNA片段及其应用。
【背景技术】
[0002] 蛋白表达系统是现代生物技术的重要研究内容，广泛应用于食品、制药、洗涤剂生 产等领域。其中，原核表达系统具有生长快，易培养，表达量高，遗传背景清楚以及分子操作 简单的特点，且适合进行工程菌株改造等显著优势，已广泛地应用于异源蛋白质的表达。目 前比较成熟的原核表达系统有大肠杆菌和芽抱杆菌。由于大肠杆菌不适于作为宿主大规模 表达异源蛋白，而芽抱杆菌是大规模生产工业酶制剂的常用系统。芽抱杆菌宿主的优点是： 公认的安全菌株，分泌表达，无明显的密码偏爱性。
[0003] 基因工程中，常需构建高表达异源蛋白的载体，启动子对外源基因的表达水平有 极大影响，是基因工程表达载体的重要组成元件。启动子是RNA聚合酶结合开始转录合成 mRNA的地方，启动子与RNA聚合酶的结合效率是影响酶基因表达的关键。研究表明枯草菌属 含有丰富的σ因子(12种），RNA聚合酶与启动子的特异性结合取决于σ因子，因此在芽孢菌属 中搜寻高效的启动子比较难。目前报道用于芽孢菌属表达重组蛋白的有三类启动子，首先 是诱导型启动子，需要添加不同的诱导物，其弱点是启动效率较低;其次是与生长阶段相关 的启动子类型，在不同的生长阶段被激活，启动强度高，但不能持续表达;最后是自诱导启 动子。因此，研究启动子功能对于了解生物生长发育、探讨生物适应环境的机制及实现外源 基因的尚效表达等均有重要意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种具有启动子功能的 DNA片段。
[0005] 本发明的另一目的在于提供所述所述DNA片段的用途。
[0006] 本发明的目的通过下述技术方案实现:一种具有启动子功能的DNA片段，所述DNA 片段为如下任一序列：
[0007] (a)如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列或者其互补序列；
[0008] (b)对如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列进行一个或多个核苷酸取代、缺失或添加 所获得的，具有与如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列相同的作为启动子功能的核苷酸序列 或者其互补序列；
[0009] (C)对如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列添加一个或多个核糖体结合位点的序列。
[0010]所述核糖体结合位点的序列为如SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。
[0011] 所述具有启动子功能的DNA片段在蛋白表达中的应用。
[0012] 一种载体，包含如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列和如SEQ ID N0.2所示的核糖体 结合位点的序列
[0013] 所述载体，含有如SEQ ID N0.10所示的核苷酸序列。
[0014] -种表达质粒，包含上述载体以及与该载体可操作连接的位于该载体下游编码异 源蛋白质核苷酸序列。
[0015] 所述异源蛋白质核苷酸序列为好热地芽孢杆菌(Geobacillus kaustophilus)编 码的耐热半乳糖苷酶的核苷酸序列，或为茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensia)编码 的转谷氨酰胺酶的核苷酸序列。
[0016] -种重组工程细胞，为上述载体或者上述质粒转化或转导宿主细胞得到的细胞 株。
[0017] 所述的宿主细胞为芽孢杆菌。
[0018] 所述的宿主细胞为枯草芽孢杆菌。
[0019] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0020] 本发明涉及运用RNA-seq技术测定地衣芽孢杆菌在对数生长后期的全基因转录 组，筛选高表达的基因，在地衣芽孢杆菌中找到一个转录活性高的基因。克隆所筛选的高表 达基因对应的启动子序列，并应用于耐热β-半乳糖苷酶基因（bgaB)的表达，通过测定bgaB 的活性，证明筛选的启动子在枯草芽孢杆菌中具有高活性。应用于转谷氨酰胺酶(MTG)的表 达，通过SDS-PAGE电泳图验证其蛋白表达。
[0021]即，本发明提供了一种DNA片段，该DNA片段具有启动子的功能，有很强的特异表达 活性，在不需要添加诱导物的条件下即能实现外源基因的高表达，特别是为枯草芽孢杆菌 表达外源基因提供了有效的元件。
【附图说明】
[0022]图1是实施例2中生长对数后期的地衣芽孢杆菌提取总RNA电泳图；其中，泳道1和2 分别为生长对数后期的解淀粉芽孢杆菌提取总RNA。
[0023] 图2是实施例3中扩增PgivA的PCR产物电泳图；其中，泳道Μ为DNA Marker;泳道1为 PgivA的PCR扩增产物。
[0024]图3是实施例4中扩增SamyQ信号肽的PCR产物电泳图；其中，泳道Μ为DNA Marker， 泳道1为SamyQ信号肽PCR扩增产物。
[0025] 图4是实施例4质粒pBE-rbs-SamyQ-bgaB的构建示意图。
[0026] 图5是实施例4表达质粒pBE-PgivA-SamyQ-bgaB的构建示意图。
[0027] 图6是实施例5中扩增PgivA-samyQ片段电泳图；其中，泳道Μ为DNA Marker，泳道1为 PgivA-samyQ扩增产物。
[0028] 图7是实施例5表达质粒pBE-PgivA-SamyQ-proMTG的构建示意图。
[0029] 图8是实施例6B.subtilis ATCC6051(pBE-PgivA-SamyQ-bgaB)转化子的bgaB酶活 曲线图。
[0030] 图9是实施例6B.subtilis ATCC6051 (pBE-PgivA-SamyQ-proMTG)转化子MTG表达的 SDS-PAGE电泳胶图。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0032] 以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、DNA片段酶 切、连接、凝胶电泳等具体参见《分子克隆实验指南》（第三版）（Sambrook J，Russell DW, Janssen K,Argentine J.黄培堂等译，2002,北京:科学出版社）。
[0033]从一株地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis ATCC14580,购于NBRC，货号为 NBRC12200)培养的生产对数后期阶段提取细菌RNA。对细菌RNA进行转录组测序建库，去掉 核糖体RNA，对mRNA进行反转录建立cDNA文库。对细菌全转录组进行分析，根据代表基因转 录水平的标准化数据RPKM值判断其表达量水平较高的基因，然后分析其启动子区。将所选 的启动子接入载体，测定启动子在枯草芽孢杆菌(B.subtilis ATCC6051，购于NBRC，货号为 NBRC13719)中的活性。
[0034] 实施例1
[0035] (1)细菌的培养:将地衣芽孢杆菌ATCC14580(-80°C)甘油管取出划线于LB固体平 板上37°C培养16h，挑取单菌落于10mL的含1%终浓度淀粉的LB液体培养基，37°C，200rpm培 养至0D6QQ 20~25(分光光度计，日本Hitachi公司）。
[0036] (2)细菌总RNA的提取和RNA-Seq测序:收集步骤（1)得到的细胞培养液lmL于8000g 快速离心lmin，用于提取细菌总RNA(见图1)。具体的提取方法参考Omega Bio-tek公司的细 胞细菌总RNA提取试剂盒。用于RNA-Seq测序文库制备的样品经Agilent Technologies 210013；[0&仙15^61'检测合格，经过0他861(1^&86?代6)处理混入的0财分子，用1?；[130-261'0 (Gram-Positive Bacteria) kit (USA)去掉占总RNA绝大多数的rRNA，纯化得到的mRNA。将 mRNA先打断为合适大小的片段，以片段化的mRNA为模板，加入反转录酶和随机引物，合成双 链cDNA，然后用试剂盒QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen)纯化合成的cDNA。补平 cDNA的粘性末端，然后在一条链上加上一个腺嘌呤核苷酸，以这个突出的A配对含有突出的 T的一级接头序列。在分别能配对一级接头两端的引物存在的条件下进行PCR扩增，经过多 次循环，将PCR结果进行凝胶电泳并切胶回收预定大小的胶带，这时得到的加上二级接头的 序列组成的文库进行上机测序(按专利文献:潘力等.一种具有启动子功能的DNA片段与应 用.CN201510074949.0[P]. 2015.方法）ANA-Seq文库的测序由广州基迪奥生物科技有限公 司提供测序服务。测序时分别将两端向中心的l〇〇bp的序列信息读出（PE100)，称为reads， 将这些reads比对到细菌基因组上就可以进行注释及表达量计算等后续生物信息学分析。
[0037] (3)筛选并克隆启动子片段:通过RNA-Seq测序数据分析地衣芽孢杆菌转录本结构 及全基因组分析含有转录起始位置的基因，通过RPKM量化，筛选一株表达量高的基因，其核 苷酸序列如下所示：
[0038] agccctccggccaacccgtaccacaatggtttggattccctcagccacagccatacgagatagccgcccgcgatttc agccaaacccgccagtaaaaataaaccgattgcgatcatcatcaacaacacactccaattcacgtgaattgtctcta ttctacacgacataaaacggccgggaaagttcccgtttttcgggaaaataaacagaacgcgagtataggaactgtct cccccgaacctgttggaacggctccttcagcatgatataagtaaattgtaaacgcttataagggggctt。
[0039] 以地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis ATCC14580)的基因组DNA为模板，弓丨 物F_PgivA(5 '-cggaattcagccctccggccaacccgt-3 '）和R_PgivA(5 ' -ggactagtaagcccccttataagcgttt-3'）进行扩增300bp大小的DNA片段，即PgivA启动子片段 (见图2)，与目的产物大小相符。引入酶切位点E C〇RI，SpeI。
[0040] (4)构建bgaB胞外表达质粒
[0041 ]以质粒pBE-rbs-biobrick-bgaB (按专利文献:潘力等·一种具有启动子功能的DNA 片段与应用.CN201510074949.0[P].2015.构建)为表达质粒，用限制性内切酶Sail在酶切 位点切开成线性质粒，用？-1'匕8-3311179(5'-aactgcaggtaagagaggaatgtcgacatgattcaaaaacgaaagcg-3'）和R-rbs-SamyQ(5 '-attgaggataacacattcatggctgatgtttttgtaatcg-3'）扩增信号肽SamyQ(如SEQ ID NO. 7所 示）约150bp大小的PCR产物（见图3)，含有核苷酸序列：caattataggtaagagaggaatgtcgac，为 核糖体结合位点的序列。用In-fusion方法（具体操作方法见NEBuilder公司的HiFi DNA Assembly Master Mix)将信号肽和质粒连接，得到pBE-rbs-SamyQ-bgaB质粒(见图4)。 [0042] 步骤(3)中得到带Ec〇RI，Spe頂每切位点的PglvA启动子片段经过酶切、纯化后插入 用相同限制性内切酶EcoRI和SpeI切开的上述pBE-rbs-SamyQ-bgaB质粒构建得到目的启动 子的bgaB基因胞外表达质粒pBE-PgivA-SamyQ-bgaB (见图5)。
[0043] (5)构建MTG胞外表达质粒
[0044]以质粒pBEp43-pr〇MTG(按专利文献:潘力等.一株重组的枯草芽孢杆菌及其生产 转谷氨酰胺酶的方法.CN201210052578.2[P].2012.构建）为表达质粒，用限制性内切酶 EcoRI和BamHI的酶切位点。以pBE-PgivA-SamyQ-bgaB质粒为模板，引物？-?814(5'_ cggaattcagccctccggccaacccgt-3 '）、R_SamyQ(5 '-aaggatccggctgatgtttttgtaatcg-3 '）扩 增5'端带有EcoRI酶切位点，3'端带有BamHI酶切位点的约450bp PgivA-SamyQ片段(见图6)。 用限制性内切酶EcoRI和BamHI消化P givA-SamyQ片段，回收，纯化后插入用相同内切酶酶切 位置的质粒pBEp43-pr 〇MTG(专利文献:潘力等.一株重组的枯草芽孢杆菌及其生产转谷氨 酰胺酶的方法.CN201210052578.2[P] .2012.)，构建得到MTG表达胞外质粒pBE-PgivA-SamyQ-proMTG (见图7)。其中：PgivA-SamyQ核苷酸序列为： agccctccggccaacccgtaccacaatggtttggattccctcagccacagccatacgagatagccgcccgcgatttc agccaaacccgccagtaaaaataaaccgattgcgateatcatcaacaacacactccaattcacgtgaattgtctcta ttctacacgacataaaacggccgggaaagttcccgtttttcgggaaaataaacagaacgcgagtataggaactgtct cccccgaacctgttggaacggctccttcagcatgatataagtaaattgtaaacgcttataagggggcttcaattata ggtaagagaggaatgtcgacatgattcaaaaacgaaagcggacagtttcgttcagacttgtgcttatgtgcacgctg ttatttgtcagtttgccgattacaaaaacatcagcc〇
[0045] (6)启动子表达水平的检测
[0046] 将构建好的目的启动子的bgaB表达质粒pBE-PgivA-SamyQ-bgaB和MTG表达质粒 pBE-PgivA-SamyQ-pr〇MTG先用化学转化法转化至大肠杆菌(E. co 1 i JM110)，得到阳性克隆 子，经测序后提取质粒，用电转化的方法转化至枯草芽孢杆菌B. subti 1 is ATCC6051，具体 方法参考非专利文献记录Natalia P，Zakataeva，Oksana V et al.A simple method to introduce marker-free genetic modification into chromosome of naturally nontransformable Bacillus amyloliquefaciens strains[J].Appl Microbiol Biotechnol. 2010,85:1201-1209)，得转化菌株B.subtilis ATCC6051 (pBE-PgivA-SamyQ-bgaB)和B · subti 1 is ATCC6051 (pBE-PgivA-SamyQ-proMTG) 〇
[0047] 将得到的转化子B. subtilis ATCC6051(pBE-PgivA-SamyQ-bgaB)和B. subtilis ATCC6051 (pBE-PgivA-SamyQ-proMTG)培养于 1 OmL LB培养基中（卡那霉素20yg/mL)，37 °C， 200rpm活化12h，将活化的种子液接种于50mL LB培养基中（卡那霉素20yg/mL，l%葡萄糖） 接种量为1 % (体积比），37°c，200rpm总发酵48h，每隔6小时取样。
[0048] β-葡萄糖半乳糖苷酶酶活的测定：将32yL发酵上清液与288以1^0.25%0即6(〇-Nitrophenyl-0-D_Galactopyranoside，邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷）混合，55°C下温育 15min，反应终止加入320yL的10 %Na2C03。反应呈显色反应，在405nm波长下测定吸光值。对 照菌株B·subti 1 is ATCC6051 (pBE-rbs-SamyQ-bgaB)无显色反应，在405nm波长下测定吸光 值与空白对照(LB)差不多，无 β-葡萄糖半乳糖苷酶活性。结果表明启动子PgivA启动β-葡萄 糖半乳糖苷酶表达，酶活在30_48h的表达最高，其中48h达到最高酶活13.09U/mL(见图8)。 [0049] SDS-PAGE:将48h发酵液离心取上清，上清液跑SDS-PAGE电泳，与野生型枯草芽孢 杆菌B. subti 1 is ATCC6051作为对照，蛋白胶图显示在44-46KDa有条带和MTG蛋白大小一 致，而野生型对照在此大小范围内无条带，实验结果说明MTG蛋白酶原得到表达(见图9)。 [0050]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种具有启动子功能的DNA片段，其特征在于:所述DNA片段为如下任一序列： (a) 如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列或者其互补序列； (b) 对如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列进行一个或多个核苷酸取代、缺失或添加所获 得的，具有与如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列相同的作为启动子功能的核苷酸序列或者 其互补序列； (c) 对如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列添加一个或多个核糖体结合位点的序列。2. 根据权利要求1所述具有启动子功能的DNA片段，其特征在于:所述核糖体结合位点 的序列为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。3. 权利要求1或2所述具有启动子功能的DNA片段在蛋白表达中的应用。4. 一种载体，其特征在于:包含如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO.2所 示的核糖体结合位点的序列。5. 根据权利要求4所述的载体，其特征在于:含有如SEQ ID NO. 10所示的核苷酸序列。6. -种表达质粒，其特征在于:包含权利要求4或5所述的载体以及与该载体可操作连 接的位于该载体下游编码异源蛋白质核苷酸序列。7. 根据权利要求6所述的表达质粒，其特征在于:所述异源蛋白质核苷酸序列为好热地 芽孢杆菌(Geobacillus kaustophilus)编码的耐热β-半乳糖苷酶的核苷酸序列，或为茂原 链霉菌(31：代口1：01]17〇63 1]1(^3瓜611813)编码的转谷氨酰胺酶的核苷酸序列。8. -种重组工程细胞，其特征在于:为权利要求4或5所述的载体或者权利要求6或7所 述的质粒转化或转导宿主细胞得到的细胞株。9. 根据权利要求8所述的重组工程细胞，其特征在于:所述的宿主细胞为芽孢杆菌。10. 根据权利要求9所述的重组工程细胞，其特征在于:所述的宿主细胞为枯草芽孢杆 菌。
【文档编号】C12N15/75GK106086025SQ201610430767
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月15日
【发明人】潘力, 刘欣, 王斌, 廖瑜玲
【申请人】华南理工大学