专利名称：万能dna片段扩增技术及万能dna片段扩增试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种扩增大小在一定范围内的具有3＇羟基和5＇磷酸基的任意DNA片段的技术方法和用以实现这种技术的试剂盒，国际专利分类号为C12 Q1/68.
目前已有的DNA片段扩增技术主要有以下几种一，经典方法，该方法是利用DNA重组技术把待扩增DNA片段或其一部分转入适当载体如质粒载体或噬菌体，病毒载体中，然后转化或转染宿主细胞，通过载体的复制或繁殖从而达到扩增目的DNA片段的目的。要想获得目的DNA片段还要再通过提取，限制酶切割，纯化等繁琐的步骤。这是一个费力，费时，费钱的过程，(<分子克隆实验指南.>J.萨姆布鲁克)二，常规PCR方法即多聚酶链式反应。这是一种体外快速扩增特异性DNA片段的方法。这种方法就是将特异性引物，耐热DNA聚合酶，四种脱氧核糖核苷三磷酸(即dNTP)，模板分子按适当的比例与PCR缓冲液(一般含有50mmol/L KCl，10mmol/L Tris.Cl，PH8.3，和1.5mmol/LMgCl2)混合，经过高温(94摄氏度)热变性，使双链的DNA分子解为单链，低温(60摄氏度)下使引物与两单链分别退大，中温(72摄氏度)下DNA链廷伸，新合成的DNA又可作为模板，之后再进行变性，退火，链延伸，反复热循环，每循环一次，从理论上讲，目的DNA的量比该次循环前增加一倍，这样，经过30--35个循环后，目的DNA将扩增千百万倍。因此PCR的突出特点是能生成大量特异性片段供分析研究检测。缺点是需要先知道待扩增DNA片段的序列，至少需要已知待扩增DNA片段的部分序列即它不能扩增序列完全未知的DNA片段，并且每扩增一个片断都需要单独设计合成合适的该片段特异的引物。并且一般情况下只能扩增模板DNA片断内部的一部分。(Marx，J.L.，Science 2401408，1988Mihovilovic，M.，Biotechniques，71，14)三，特种PCR技术，包括锚式PCR，这种PCR适用于从mRNA出发的cDNA克隆(Loh，E.Y.，Science 243217，1989)，其中有难以控制的加同聚尾反应。并且多聚C，G尾对将来克隆后的基因的表达有不良影响；Universal Amplification(CLONTECH Fall 7，1990)，Anchor-ligated PCR(Kinzler，K.W.，Nucleic Acids Res.173645，1989)等，这类PCR利用T4DNA连接酶将人工接头引物连接到平端双链(或经修平的双链)DNA上，然后再用相应引物进行PCR扩增。这类连接不可避免地导致产生接头二聚体，进而给以后的扩增带来麻烦，并且它还不能用来扩增单链DNA片段。
本发明的目的是提供一种能够快速，方便，忠实，经济地扩增大小在一定范围内的任意具有3＇羟基，5＇磷酸的DNA片段的技术方法，即万能DNA片段扩增技术和用以方便地实现该技术的试剂盒。
本发明根据PCR引物设计原理首先人工合成四个万能PCR引物第一个万能PCR引物是5＇HO-CTGCAGGATCCTGCAGGGAGG-OH3＇，记作引物1。用符号“5＇HO-ABCDEF-OH3′”表示。该引物合成时，用牛小肠磷酸单酯酶对该引物的5′-端进行去磷酸化修饰，去磷酸化的5＇端记作“5＇HO-”，该引物含有BamH1，Pst1，等限制性内切酶位点；第二个万能PCR引物是5＇P-GAGCCGTCGACAAGCTTGACC-H 3＇记作引物2，用“5＇P-KLMNOPQ-H3′”表示，在人工合成该引物时，3＇端的最后一个碱基用双脱氧鸟嘌呤(ddGTP)合成，使该引物3＇端无羟基。这样做的目的是防止在后面的连接反应中出现不期望的连接，该引物含有Handlll，Sall，Hincll，Accl等限制性内切酶位点；第三个万能PCR引物是3＇HO-CTCGGCAGCTGTTCGAACTGG-OH 5＇，记作引物3，用“3＇HO-klmnopq-OH5′”表示，该引物与修饰了3′-端的引物2互补，且5＇端经过去磷酸修饰，小写字母代表的碱基序列与的写字母代表的碱基序列互补。第四个万能引物是3＇H-ACGTCCCTCC-OH5＇，记作引物4，用“3＇H-def-OH5′”表示。该引物与引物1的3＇端互补，小写字母代表的碱基序列与大写字母代表的碱基序列互补。在人工合成该引物时，3＇端最后一个碱基用双脱氧鸟嘌呤核苷三磷酸(ddGTP)合成，5＇端用小牛肠磷酸单酯酶切除磷酸基，该引物较短，其长度为引物1长度的1/3到1/2。再在T4RNA连接酶的作用下将引物1和引物3与待扩增DNA单链(如果待扩增DNA片段为双链，则先加热变性淬冷变成单链)连接，使待扩增DNA片段带上万能PCR引物接头，然后再用引物1和引物3进行扩增。为实现上述技术，而将各种必要试剂按一定比例组装成万能DNA片段扩增试剂盒，该试剂盒包含四种万能PCR引物，T4RNA连接酶，耐热DNA聚合酶，ATP，四种脱氧核糖核苷三磷酸，DNA连接缓冲液，PCR缓冲液等。
实施例1.待扩增DNA片段为单链(以5＇P————OH3＇表示)时在10ul反应体系中加入20ng单链DNA片段，引物1(终浓度为lumol/L)，ATP(终浓度为10mmol/L)和T4RNA连接酶5U，在连接缓冲液中37摄氏度下保温30分钟，使引物1与待扩增DNA片段的单链的5＇-端连接，然后加入过量的引物4(终浓度为10umol/L)继续保温1小时，以封闭引物1的3＇端；加入引物2，再于37摄氏度下保温30分钟，使引物2与待扩增DNA片段的单链的3′-端进行连接。得到扩增用模板5＇HO-ABCDEF——————JKLMNOPQ-H3＇；68摄氏度加热20分钟灭活连接酶后，加入引物3，引物1，四种脱氧核糖核苷三磷酸，PCR缓冲液，耐热DNA聚合酶，进行PCR扩增，即可得到目的产物5＇HO-ABCDEF——————JKLMNOPQ-OH3＇3＇HO-abodef——————jklmnopq-OH5＇这种产物可以直接进行PCR测序。
实施例2.待扩增DNA片段为双链(以A链3＇HO————P5＇B链5＇P————OH3＇表示)时在10ul反应体系中加入20ng双链DNA片段，经97摄氏度下保温10分钟，进行热变性，冰水中淬冷，便其解链变成单链，加入引物1(终浓度为1umol/L)，ATP(终浓度为10mmol/L)和T4RNA连接酶5U，在连接缓冲液中37摄氏度下保温30分钟，使引物1与待扩增DNA片段的单链的5′-端连接，然后加入过量的引物4(终浓度为10umol/L)继续保温1小时，以封闭引物1的3＇端；加入引物2，再于37摄氏度下保温30分钟，使引物2与待扩增DNA片段的单链的3＇-端进行连接从而得到扩增用模板A链5＇HO-ABCDEF——————JKLMNOPQ-H3＇B链3＇H-QPONMLKJ——————FEDCBA-OH5＇，68摄氏度加热20分钟灭活连接酶后，加入引物3，引物1，四种脱氧核糖核苷三磷酸，PCR缓冲液，耐热DNA聚合酶，进行PCR扩增，即可得到目的产物5＇HO-ABCDEF——————JKLMNOPQ-OH3＇3＇HO-abcdef——————jklmnopq-OH5＇和5＇HO-qponmlkj——————fedcba-OH3＇3＇HO-QPONMLKJ——————FEDCBA-OH5＇实施例3.待扩增DNA片段为具有平端或具有5＇突出端的双链DNA片段(以A链3＇HO——————P5＇B链5＇P——————OH3＇表示)时在10ul反应体系中加入20ng双链DNA片段，经97摄氏度下保温10分钟，进行热变性，冰水中淬冷，使其解链变成单链，加入引物1(终浓度为2umol/L)，ATP(终浓度为10mmol/L)和T4RNA连接酶5U，在连接缓冲液中37摄氏度下保温30分钟，使引物1与待扩增DNA片段的单链的5＇-端连接5＇HO-ABCDEF-OH3＇＋5＇P————OH3＇，3＇OH———— P5＇＋3＇HO-FEDCBA-OH5＇，连接后得到5＇HO-ABCDEF————OH3＇，3＇HO————FEDCBA-OH5＇68摄氏度加热40分钟灭活连接酶后，加入引物1，四种脱氧核糖核苷三磷酸，PCR缓冲液，耐热DNA聚合酶，这两种连接产物相互复性再经聚合酶补平生成扩增用模板5＇HO-ABCDEF————fedcba-OH3＇3＇HO-abcdef————FEDCBA-OH5＇再直接用原引物进行PCR扩增，得到目的产物5＇HO-ABCDEF————fedcba-OH3＇3＇HO-abcdef————FEDCBA-OH5＇为了方便广大生物医学科技工作者应用该技术，将上述四种万能PCR引物，T4RNA连接酶，ATP，耐热DNA聚合酶，四种脱氧核糖核苷三磷酸(dATP，dGTP，dCTP，dTTP)，DNA连接缓冲液，PCR缓冲液等按一定的比例组合在一起，形成万能DNA片段扩增试剂盒。
由于本发明合成了四个在合成时或合成后进行特别修饰的万能PCR引物，并使这些引物与待扩增DNA片段相连接，在连接过程中，采用末端阻断法防止出现不期望的连接，从而获得了两端带有万能PCR引物接头的待扩增的DNA片段模板分子，从而不必合成待扩增DNA片段的特异性引物，就能够利用万能PCR引物进行扩增，同时，由于扩增用引物是万能PCR引物，其扩增条件可经最优化固定下来，且引物2和引物4在退火时降低扩增用引物的有效浓度，变性时释放扩增用引物，具有引物浓度平衡剂的作用，实现了无论待扩增的DNA片段的序列是已知的还是未知的，是单链还是双链，具有平端还是黏端，都能够进行快速，方便，忠实，经济，有效地扩增。
权利要求
1.一种通过将人工合成的万能PCR引物连接于待扩增DNA片段单链，使其两端带上万能PCR引物接头，从而利用PCR技术扩增长度在一定范围内的具有5＇-磷酸和3＇羟基的任意DNA片段的方法，其特征在于该方法包括人工合成四个在合成前或合成后进行末端修饰的万能PCR引物，将其中的一个或两个万能PCR引物连接到待扩增DNA片段单链末端，再用相应万能PCR引物进行扩增。
2.根据权利要求1所述的方法，其中四个万能PCR引物，引物1，引物2，引物3，引物4；合成引物1时，用牛小肠磷酸单酯酶对该引物的5′-端进行去磷酸化修饰，合成引物2时，3＇端的最后一个碱基用双脱氧核糖核苷三磷酸合成，使该引物3＇端无羟基，引物3与修饰了3＇-端的引物2互补，且5＇端在合成后作去磷酸修饰，引物4与引物1的3＇端互补，在人工合成该引物时，其3＇端最后一个碱基用双脱氧核糖核苷三磷酸，5＇端用小牛肠磷酸单酯酶切除磷酸基，该引物较短，其长度为引物1长度的1/3到1/2。
3.根据权利要求1所述的方法，其中将双链DNA热变性，淬冷使其成为单链，在T4RNA连接酶的作用下便其与引物1连接。
4.根据权利要求1所述的方法，其中待扩增DNA片段单链与引物1连接完成后，用过量的引物4封闭引物1的3′-端，之后使待扩增DNA片段单链与引物2连接。
5.根据权利要求1，2，3，4所述的方法，其中以连接产物为模板，用引物1，引物3进行PCR扩增。
6.根据权利要求1，3所述的方法，其中引物1或引物3分别与平端或5＇突出端的双链DNA的两条单链的5′-端连接，连接有万能PCR引物接头的待扩增DNA片段单链之间退火后，经DNA聚合酶补平后用引物1或引物3进行PCR扩增。
7.根据权利要求1，2，3，4，5，6，所述的方法，借此进行单链DNA的测序，单链或双链DNA，cDNA的快速扩增和克隆。
8.一种通过将人工合成的引物连接到单链DNA上后，再通过原引物或原引物和原引物的互补引物的廷伸而扩增DNA片段的试剂盒，即万能DNA片段扩增试剂盒，该试剂盒包括1)四个万能PCR引物或其中的一个，2)T4RNA连接酶，及其缓冲液，3)腺苷三磷酸(ATP)，超纯水，4)耐热DNA多聚酶，PCR缓冲液，5)四种脱氧核糖核苷三磷酸dATP，dTTP，dCTP，dGTP。
9.权利要求8所述的试剂盒，其中四个万能PCR引物在合成前或合成后进行了末端修饰。
10.上述任一项权利要求所述的方法，用于扩增DNA片段和组装DNA片段扩增试剂盒。
全文摘要
本发明万能DNA片段扩增技术及万能DNA片段扩增试剂盒提供了一种扩增大小在一定范围内的具有3′羟基和5′磷酸基的任意DNA片段的技术方法和用以实现这种技术的试剂盒，国际专利分类号为C12Q1/68，由于本发明合成了四个万能PCR引物，并使这些引物与待扩增DNA片段单链相连接，获得了两端带有万能PCR引物接头的待扩增的DNA片段模板分子，从而直接利用万能PCR引物将待扩增的DNA片段高效，方便地进行扩增。
文档编号C12Q1/25GK1133344SQ9511131
公开日1996年10月16日 申请日期1995年4月12日 优先权日1995年4月12日
发明者夏庆杰 申请人:夏庆杰