一种多等位基因型pcr扩增片段的筛选方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种多等位基因型PCR扩增片段的筛选方法及其应用。该筛选方法是通过NCBI查找已经公布的染色体相关资料，确定疑似存在的SNP聚集，然后针对疑似存在的SNP聚集区域设计引物并PCR扩增，通过测序以检测PCR扩增片段是否真正存在多个SNP位点，并进一步通过SNP位点的关联性分析，确定扩增片段是否具有多等位基因型，从而筛选出多等位基因型PCR扩增片段，用于动物个体身份识别、肉产品溯源技术的研发及产业化等。
【专利说明】—种多等位基因型PCR扩增片段的筛选方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学领域，涉及一种多等位基因型PCR扩增片段的筛选方法及其应用。
【背景技术】
[0002]近年来食品安全事件频发，政府管理部门及消费者对食品安全的关注也史无前例，因此研发动物个体身份识别技术及肉产品溯源技术，特别是DNA识别技术迫在眉捷。
[0003]为此，我们对动物个体身份识别及肉产品溯源的SNP条形码技术开展了系列研究，并深感如果要真正实现动物个体身份识别等技术研发及真正产业化，需要使动物个体身份DNA识别及肉产品DNA溯源技术及其研发变得更为简单，那么必须要筛选到一些同时含有多个SNP位点的PCR扩增片段，且PCR扩增片段多等位基因型，由这些PCR扩增片段内的有效SNP位点组合成SNP条形码。多等位基因型PCR扩增片段主要针对染色体上的基因间隔序列筛选，不仅只针对功能基因筛选。针对基因间隔序列筛选不仅易于发现大量的SNP位点，而且大量SNP位点所组成的多等位基因型PCR扩增片段信息量较大，进而使动物个体身份DNA识别及肉产品溯源DNA溯源技术及其研发变得更为简单，技术产业化成本更低；而功能基因序列相比较于 染色体上的基因间隔序列相对保守，突变相对较少，SNP筛选效率相对不高，且扩增的PCR片段大多只含有一个SNP位点，信息量相对有限。为此，我们提出了“多等位基因型PCR扩增片段”概念，并建立了一种多等位基因型PCR扩增片段的简易筛选方法。
【发明内容】
[0004]本发明目的是针对现有技术的上述不足，提供了一种多等位基因型PCR扩增片段的筛选方法。
[0005]本发明的另一目的是提供该方法的应用。
[0006]本发明的技术方案如下:
[0007]一种多等位基因型PCR扩增片段的筛选方法，是通过NCBI查找已经公布的染色体相关资料，确定疑似存在的SNP聚集，然后针对疑似存在的SNP聚集区域设计引物并PCR扩增，扩增片段通过测序以检测PCR扩增片段是否真正存在多个SNP位点，并进一步通过SNP位点的关联性分析，确定扩增片段是否具有多等位基因型，从而筛选出多等位基因型PCR扩增片段，用于动物个体身份识别、肉产品溯源等技术的研发及产业化。
[0008]其中，所述的多等位基因型PCR扩增片段是指PCR扩增片段至少存在2个或以上的SNP位点，且(在群体中)扩增片段分离到的等位基因型数量> 4。
[0009]所述的染色体相关资料(数据)，是指NCBI上公布的染色体DNA序列及DNA序列上的疑似SNP位点。
[0010]所述的SNP聚集，是指NCBI公布的DNA序列的某一区段(一次测序长度为宜)内存在多个疑似SNP位点，且疑似存在的SNP位点数量越多越好。[0011]按照本发明所述的筛选方法获得的多等位基因型PCR扩增片段可应用于动物个体身份识别、肉产品溯源技术研发、分子遗传标记筛选等方面，优选应用于猪个体身份识别技术研发等方面所需的多等位基因型PCR扩增片段的筛选。
[0012]有益效果:本发明是根据NCBI已经公布的染色体相关资料(数据)，来筛选基因组DNA的疑似高变区，并设计引物扩增获得多等位基因型扩增片段，用于动物个体身份识另O、肉产品溯源技术的研发及产业化等。不同于目前主要针对功能基因(功能基因序列相对保守)的大多数SNP筛选，本发明的多等位基因型PCR扩增片段筛选不考虑筛选对象，且筛选的PCR扩增片段大多位于染色体上的基因间隔序列。基因间隔序列相比较于功能基因，序列相对不保守，且存在大量的高变区，因此SNP筛选更为容易，效率相对较高。而且，筛选的扩增片段多等位基因型，相比较于只有一个SNP位点的PCR扩增片段，信息量相对较大，有利于动物个体身份识别、肉产品溯源等技术的研发及产业化。例:如果筛选的PCR扩增片段基因型数在9个以上，那么5对引物(理论上)就可用于95个猪个体(5.9万头)的身份识别，基本可以满足规模猪场的猪个体身份识别，而如果筛选的PCR扩增片段仅只含有一个SNP位点，那么达到同样的个体身份识别效果，理论上则需要10对引物。因此，多等位基因型PCR扩增片段的筛选有利于动物个体身份识别等技术的研发及产业化。同时，由于筛选的多等位基因型PCR扩增片段大多位于染色体上的基因间隔序列，属于高变区，因此多等位基因型PCR扩增片段存在一些不同品种共有的SNP位点，或同时存在不同品种的SNP突变位点，这样筛选到的这些PCR扩增片段可同时用于动物多个品种的个体身份识别或肉产肉溯源等，从而实现动物个体身份识别、肉产品溯源等技术的深度研发及产业化。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为以69头杜洛克猪样本的混合DNA模板为PCR模板，引物对I扩增序列的部分测序峰图。
[0014]图2为引物对I扩增的+470和+502 二个SNP位点在69头杜洛克猪样本中组合而成的5种基因型。
[0015]图3 3对引物在杜洛克猪中获得SNP位点及用于基因分型的有效SNP位点
[0016]图4 3对引物扩增片段在杜洛克、长白、大约克3个猪种中筛选到的SNP位点，其中有的SNP位点为三个品种所共有，有的二个品种所共有。
【具体实施方式】
[0017]实施例1杜洛克猪基因组DNA的多基因型PCR扩增片段筛选及个体身份识别
[0018]1.1引物设计(以猪10号染色体为例)
[0019]L L I 在 NCBI 的 Nucleotide 数据库(http:1Iwm.ncb1.nlm.nih.gov/nuccore)中搜索关键词Sus scrofa breed mixed chromosomelO (在其他染色体上设计引物，将“10”改为相应染色体号)。打开页面后，依次点击超链接Sus scrofa breed mixedchromosomelO, Sscrofal0.2、Graphics。
[0020]在图 形界面中点击configure按钮弹出选项卡,在Tracks选项卡下的所有选项中，仅保留sequence和SNP前的“ V”。点击configure按钮确认。
[0021]1.1.2右键点击SNP条形码中蓝色较深(SNP密集)的地方，弹出菜单中选择“Zoomto sequence”,通过“Zoom bar”调整至标尺以k为单位显示。在标尺上按住鼠标左键划出SNP密集区域,释放鼠标左键时弹出的菜单中点击“set new marker for selection”。鼠标指向markerl,记录range的起始位置数值。
[0022]1.1.3 点击 “Tools”，弹出菜单中选择 “sequence text view” 后，点击 “go toposition”,输入1.1.2步骤记录的range起始位置数值，点击“0K”键，方括号内显示“Makerl”标记序列，复制该序列作为引物设计的模板(使用Ctrl+C按键复制)。复制序列用记事本保存后，可通过在线或本地软件设计引物。
[0023]1.1.4右键点击Markerl区域，在弹出菜单中左键点击:“Zoom In”，直至markerl区域充满可见窗口后，再在该菜单中左键点击“B1AST and Primer Search/PrimerBlAST(visible Range)”。
[0024]1.1.5弹出新页面按照以下要求填写:
[0025]Primer Parameters 栏:PCR product size 项目下 Min 项填入 500, Max 项填入1000。Primer Pair Specificity Checking Parameters 栏:石角保 Specificity check 项目被勾选；database 项的下拉菜单中选择 Genome (chormosomes from all organisms)；Organism 项填入 Sus scrofa (taxid: 9823)。
[0026]最后点击Get Primers按钮。在弹出的新页面中的Detailed primer reports栏目中即可获得数个引物组合，结合后续的PCR扩增及直接测序，筛选有效引物。
[0027]实施例共筛选3对引物(由于同窝同胞仔猪最难区分，所以实施例仅列举了 9头同窝同胞仔猪的个体身份识别，9头同胞仔猪仅需3对引物就可实现个体身份识别)。
[0028]表1筛选的3对引物的相关信息
【权利要求】
1.一种多等位基因型PCR扩增片段的筛选方法，其特征在于所述的多等位基因型PCR扩增片段是指PCR扩增片段至少存在2个或以上SNP位点，且在群体中扩增片段分离到的等位基因型数量> 4，所述的筛选方法是通过NCBI查找已经公布的染色体相关资料，确定疑似存在的SNP聚集，然后针对疑似存在的SNP聚集区域设计引物并PCR扩增，扩增片段通过测序以检测PCR扩增片段是否真正存在多个SNP位点，并进一步通过SNP位点的关联性分析，确定扩增片段是否具有多等位基因型，从而筛选出多等位基因型PCR扩增片段。
2.根据权利要求1所述的多等位基因型PCR扩增片段的筛选方法，其特征在于所述的公布的染色体相关资料为NCBI上公布的染色体DNA序列及DNA序列上的疑似SNP位点。
3.根据权利要求1所述的多等位基因型PCR扩增片段的筛选方法，其特征在于所述的SNP聚集，是指NCBI公布的DNA序列的某一区段内存在多个疑似SNP位点。
4.权利要求1所述的多等位基因型PCR扩增片段的筛选方法在动物个体身份DNA识别或动物肉产品DNA溯源技术、分子遗传标记中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于权利要求1所述的多等位基因型PCR扩增片段的筛选方法在猪 个体身份DNA识别及猪肉产品DNA溯源中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK103966349SQ201410234407
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年5月29日 优先权日:2014年5月29日
【发明者】邢光东, 丁潜, 胡肄农, 张浩明, 纪红军, 徐银学, 赵庆顺 申请人:江苏省农业科学院