一种Leber遗传性视神经病变基因诊断试剂盒或试剂的制作方法
【专利摘要】本发明涉及医药领域，具体涉及一种Leber遗传性视神经病变(Leber’s?hereditary?optic?neuropathy,LHON)基因诊断试剂盒或试剂，包括PCR引物混合液:所述的引物混合液包括用来封闭野生型线粒体(没有发生突变的正常人的线粒体)的脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic?acid，缩写为DNA)的肽核酸(pentose?nucleic?acid，缩写为PNA)探针和扩增突变型线粒体DNA的正反向引物，该发明操作简便，灵敏度高，特异性好，是一种高效、灵敏、稳定、特异的Leber遗传性视神经病变基因诊断检测技术。
【专利说明】一种Leber遗传性视神经病变基因诊断试剂盒或试剂
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药试剂领域，尤其是涉及一种基因检测或诊断试剂盒。
【背景技术】
[0002] Leber 遗传性视神经萎缩（Leber，s hereditary optic neuropathy, LH0N)是一种 主要累及青年人的常见眼科疾病，平均发病年龄27岁-34岁，但也有小于1岁或大于70岁 发病的。患者一般表现为急性或亚急性的视觉损失，先是涉及一侧眼，后发展到双侧眼的高 度近视甚至视觉完全丧失。临床检查患者视野中心暗点、视神经乳头周围血管屈张。分子 水平上的研究发现线粒体基因组（mtDNA)的突变是导致该病发生的主要原因。
[0003] 到1988年Wallance及其同事才首次报道了与LH0N相关的线粒体烟酰胺腺嘌呤 二核苷酸脱氢酶亚基4基因（NADH亚基4,缩写为ND4)G11778A点突变，该点突变导致了线 粒体呼吸链NADH脱氢酶复合体I的第4个亚基340位高度保守的精氨酸变为组氨酸。之 后又在其他家系中依次发现了 ND1(NADH亚基1，缩写为ND1)G3460A，ND6(NADH亚基6,缩 写为ND6)T14484C这两个点突变。这三个点突变的存在都能单独导致LH0N的发生，而且 这三个点突变在家系中发现的点突变中出现的概率也是比较高的，因此被称为三个原发性 LH0N突变。在北欧有超过95%的家系携带这三个原发突变，在其他一些国家和地区也做了 统计，发生 ND4G11778A 的有 80%，ND1G3460A 的 33% -67%，ND6T14484C 有 68%。在家系 中同时还发现了大量的次级突变，它们所起的作用还不是十分清楚，因为它们不像原发性 突变一样出现的频率高，作用明显。推测次级突变可能在疾病的发生上起到了修饰的作用。 例如在ND4G11778A点突变单独存在的情况下，家系中LH0N的外显率是很低的，有家系报道 在T3394C存在的情况下，疾病的外显率提高很多。临床检查中我们还发现在携带G11778A 位点点突变的个体中，只有半数的男性和10%的女性才会表现出视觉损伤。对于这种现象 的解释，我们认为可能原发突变对于疾病的发生是必需的，但又不足以导致视觉的损伤。
[0004] Leber遗传性视神经病变的早期临床诊断困难，与视神经炎的症状相似，所以目 前基因诊断成为确诊该病的一个必不可少的手段。该病的发病机制是线粒体DNA出现 突变。由于DNA的具有遗传异质性。每位患者体内的DNA突变的比例都是有不一样的。 现在报道的一些方法各有缺点，很难满足临床需要。聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR)直接测序法虽然被认为是检测基因突变的金标准，但是其灵敏度只有 10% -20%，对于突变率较低的患者不能检出，容易造成误诊。等位基因特异性PCR被广泛 应用于基因突变的检测，但是由于大量野生线粒体DNA的干扰，其灵敏度只能达到1% .其 他非主流方法如 SSCP-PCR(PCR-single_strand conformation polymorphism, SSCP)， RFLP-PCR(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP-PCR)等，在操作时间、操作 简便性、抗污染、灵敏度方面都存在较大的缺陷。
[0005] 专利CN1143117,公开Leber氏遗传性视神经病变检测方法及其试剂盒，该发明仅 针对线粒体DNA G11778A点突变的患者，需要溶血液经过变性提取总DNA，PCR扩增目的基 因片断以及SfaNI限制性内切酶消化和电泳等繁琐的步骤，不仅耗时而且增加了相应的费 用。专利CN1288254C公开了 Leber氏遗传性视神经病变的基因诊断试剂盒及其检测方法， 能够同时检测3个原发性治病位点突变（T14484C，G3460A和G11778A)，但是其没有排除大 量野生线粒体DNA的干扰，其灵敏度低。
[0006] 因此，建立一个操作简便，灵敏度高，特异性好的的Leber遗传性视神经病变基因 诊断检测技术是迫不及待的。同时，尚未有能够排除大量野生线粒体DNA的试剂盒及试剂 的报道。
【发明内容】
[0007] 为了解决上述技术问题，本发明采用PNA技术，通过的设计的PNA探针封闭掉大量 的野生的线粒体DNA，只扩增突变的线粒体DNA，使其灵敏度和特异性大大提高。并且和定 量PCR技术相结合，在3-4小时即可以完成Leber遗传性视神经病变3个主要突变位点的 检测，该发明操作简便，灵敏度高，特异性好，是一种高效、灵敏、稳定、特异的Leber遗传性 视神经病变基因诊断检测技术。
[0008] 本发明通过以下技术方案实现的：
[0009] 一种Leber遗传性视神经病变基因诊断试剂盒或试剂，包括PCR引物混合液，所述 的引物混合液包括用来封闭野生线粒体DNA的PNA探针和扩增突变线粒体DNA的正反向引 物。
[0010] 上述所述的正向和反向引物的使用的终浓度范围为0.05-1 μ mol/L，PNA使用的 终浓度为 l〇-l〇〇nmol/L。
[0011] 优选上述所述的物混合液包括用来封闭野生型线粒体DNA的PNA探针和扩增突变 线粒体DNA的正反向引物，其中正向和反向引物的使用的浓度范围为0. 5 μ mol/L，PNA使用 的浓度为50nmol/L。
[0012] 所述的野生线粒体DNA是指没有发生突变的正常人的线粒体。
[0013] 所述PNA (Peptide Nucleic acid),即多肽核酸，所述的PNA探针设计如下：以检测 位点为中心向序列两端各延伸7-9个碱基，总长度为15-18碱基，用Giesen等提出的估算 PNA-DNA杂交体Tm值的公式计算出Tm值，通过实验优选出一条在不降低灵敏度的情况下， 能充分封闭野生线粒体DNA的序列。
[0014] 本发明所述的用来封闭野生线粒体DNA的PNA探针是用来封闭线粒体DNA反义链 的3460位点的野生DNA的SEQ No :1所示的寡核苷酸序列。
[0015] 本发明所述的用来封闭野生线粒体DNA的PNA探针是用来封闭线粒体DNA反义链 的11778位点的野生DNA的SEQ No :2所示的寡核苷酸序列。
[0016] 本发明所述的用来封闭野生线粒体DNA的PNA探针是用来封闭线粒体DNA反义链 的14484位点的野生DNA的SEQ No :3所示的寡核苷酸序列。
[0017] 本发明所述的正反向引物是检测线粒体基因 ND1G3460A点突变的正反向引物，分 别是SEQ No :4和SEQ No :5所示的寡核苷酸序列。用于扩增含有3460位点的DNA序列。
[0018] 本发明所述的正反向引物是检测线粒体基因 ND1G11778A点突变的正反向引物， 分别是SEQ No :6和SEQ No :7所示的寡核苷酸序列。用于扩增含有11778位点的DNA序列。
[0019] 本发明所述的正反向引物是检测线粒体基因 ND1G14484C点突变的正反向引物， 分别是SEQ No :8和SEQ No :9所示的寡核苷酸序列。用于扩增含有14484位点的DNA序列。
[0020] 为了更好的实现本发明：
[0021] 优选所述的PCR引物混合液包括下述三组中的一组或一组以上，多组之间按照等 比例组成。
[0022] 具体包括：
[0023] 用来封闭线粒体DNA反义链的3460位点的野生DNA的SEQ No : 1和检测线粒体基 因 ND1G3460A点突变的正反向引物分别是SEQ No :4、SEQ No :5所示的寡核苷酸序列、
[0024] 和/或用来封闭线粒体DNA反义链的11778位点的野生DNA的SEQ No :2和检测 线粒体基因 ND1G11778A点突变的正反向引物分别是SEQ No :6、SEQ No :7所示的寡核苷酸 序、
[0025] 和/或用来封闭线粒体DNA反义链的14484位点的野生DNA的SEQ No :3和检测 线粒体基因 ND1G14484C点突变的正反向引物分别是SEQ No :8、SEQ No :9所示的寡核苷酸 序列。
[0026] 本发明所述的试剂盒或试剂，其中还包括PCR混合反应液。
[0027] 所述的PCR混合反应液可以市购，如TransStart? Green qPCR SuperMix (2X)，也可 以按照下述组分及比例自行配制
[0028] 所述的PCR混合反应液包括dNTP，PCR缓冲液、taq酶、荧光染料。
[0029] 所述的 dNTP，是 deoxy-ribonucleoside triphosphate (脱氧核糖核苷三憐酸）的 缩写，其是包括dATP，dGTP，dTTP，dCTP，dUTP等在内的统称，N是指含氮碱基，代表变量指代 A、T、G、C、U 等中的一种。在生物 DNA、RNA 合成中，以及各种 PCR(RT-PCR、Real-time PCR) 中起原料作用。
[0030] 所述的 PCR 缓冲液：Tris-HCl pH8. 52-50mM、KC110-200mM、MgC121-10mM、 Tween20(X 05%?1%。
[0031] 所述的Taq酶即TaqDNA聚合酶。
[0032] 所述的突光染料包括但不限于Green，SYBR Green，EvaGreen，SyberGreen I等，优 选 SyberGreen I 染料。
[0033] 本发明优选PCR混合反应液的成分为：Tris-HCl pH8. 52-50mM、KC110-200mM、 MgC121-10mM、Tween200.05%?1%、taq 酶 0· l-0.5u/ul、SyberGreen I 0.01% -0· 1%、 dNTPO. 1-0. 5mM。
[0034] 本发明最佳PCR混合反应液的成分为：Tris-HCl pH8. 5100mM、KC150mM、 MgC122. 5mM、Tween200. 1 %、taq 酶 0· 2u/ul、SyberGreen I 0· 05 %、dNTPO. 2mM。
[0035] 本发明所述的试剂盒或试剂，优选包括PCR混合反应液与PCR引物混合液体积比 4-1:1-4,优选PCR混合反应液与PCR引物混合液体积比2-1:1-3，最佳为1:1或2:1或2:3。
[0036] 本发明所述的试剂盒或试剂还包括阳性对照、阴性对照。优选阴性对照品为野生 线粒体DNA，阳性对照品为线粒体第3460、11778和14484突变位点的质粒的混合物。（附 图 3, 4)
[0037] 本发明所述的DNA扩增长度，对于3460位点，正向引物的设计区域可选择线粒体 3300-3450碱基位置，反向引物的设计区域可选择3470-3600。优选正向引物的设计区域为 3400-3450,反向引物的设计区域为3470-3520。最佳的正向引物为3400-3422序列，即SEQ No :4 ;反向引物为3481-3500碱基序列，S卩SEQ No :5。扩增片段长度100bp。
[0038] 对于11778位点，正向引物的设计区域可选择线粒体11600-11760碱基位置，反向 引物的设计区域可选择11780-11900。优选正向引物的设计区域为11700-11760,反向引物 的设计区域为11790-11850。最佳的正向引物为11701-11718序列，即SEQ No :6 ;反向引物 为11804-11820碱基序列，S卩SEQ No :7。扩增片段长度120bp。
[0039] 对于14484位点，正向引物的设计区域可选择线粒体14350-14460碱基位置，反向 引物的设计区域可选择14500-14600。优选正向引物的设计区域为14400-14460,反向引物 的设计区域为14500-14550。最佳的正向引物为14423-14440序列，即SEQ No :6 ;反向引物 为14510-14528碱基序列，即SEQ No :9。扩增片段长度105bp。
[0040] 本发明所述的PNA探针、表1所示的引物、染料、酶、dNTP、溶剂等为市购或专业公 司合成。
[0041] 表1PNA探针及引物DNA序列表
[0042]
【权利要求】
1. 一种Leber遗传性视神经病变基因诊断试剂盒或试剂，包括PCR引物混合液，其特征 在于：所述的引物混合液包括用来封闭野生线粒体DNA的PNA探针和扩增突变线粒体DNA 的正反向引物。
2. 如权利要求1所述的试剂盒或试剂，其中所述的用来封闭野生线粒体DNA的PNA探 针是用来封闭线粒体DNA反义链的3460位点的野生DNA的SEQ No :1所示的寡核苷酸序列。
3. 如权利要求1所述的试剂盒或试剂，其中所述的用来封闭野生线粒体DNA的PNA探 针是用来封闭线粒体DNA反义链的11778位点的野生DNA的SEQ No :2所示的寡核苷酸序 列。
4. 如权利要求1所述的试剂盒或试剂，其中所述的用来封闭野生线粒体DNA的PNA探 针是用来封闭线粒体DNA反义链的14484位点的野生DNA的SEQ No :3所示的寡核苷酸序 列。
5. 如权利要求1所述的试剂盒或试剂，其中所述的正反向引物是检测线粒体基因 ND1G3460A点突变的正反向引物，分别是SEQ No :4和SEQ No :5所示的寡核苷酸序列。
6. 如权利要求1所述的试剂盒或试剂，其中所述的正反向引物是检测线粒体基因 ND1G11778A点突变的正反向引物，分别是SEQ No :6和SEQ No :7所示的寡核苷酸序列。
7. 如权利要求1所述的试剂盒或试剂，其中所述的正反向引物是检测线粒体基因 ND1G14484C点突变的正反向引物，分别是SEQ No :8和SEQ No :9所示的寡核苷酸序列。
8. 如权利要求1所述的试剂盒或试剂，其中所述的PCR引物混合液包括用来封闭线粒 体DNA反义链的3460位点的野生DNA的SEQ No :1和检测线粒体基因 ND1G3460A点突变的 正反向引物分别是SEQ No :4、SEQ No :5所示的寡核苷酸序列、 和/或用来封闭线粒体DNA反义链的11778位点的野生DNA的SEQ No :2和检测线粒 体基因 ND1G11778A点突变的正反向引物分别是SEQ No :6、SEQ No :7所示的寡核苷酸序、 和/或用来封闭线粒体DNA反义链的14484位点的野生DNA的SEQ No :3和检测线粒 体基因 ND1G14484C点突变的正反向引物分别是SEQ No :8、SEQ No :9所示的寡核苷酸序列。
9. 如权利要求1所述的试剂盒或试剂，其中还包括PCT混合反应液，所述混合反应液包 括dNTP，PCR缓冲液、taq酶、荧光染料。
10. 如权利要求9所述的试剂盒或试剂，是由PCT混合反应液与PCR引物混合液体积比 4-1:1-4 组成。
【文档编号】C12Q1/68GK104046687SQ201410234184
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年5月29日 优先权日:2014年5月29日
【发明者】张建珍, 焦守恕, 李全 申请人:同昕生物技术（北京）有限公司