CST1mRNA和CST4mRNA或其编码的蛋白质在制备膀胱癌标志物中的应用及其试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了CST1mRNA和CST4mRNA或其编码的蛋白质在制备膀胱癌标志物中的应用及其试剂盒，将CST1mRNA和CST4mRNA或其所编码的蛋白质联合用于诊断和预示膀胱癌，其特异性和灵敏度高于使用其中一个标志物；本发明还公开了检测上述标志物的试剂盒，其试剂盒使用方便，能够直接收集尿液进行检测，不需要采集血清，减少患者的取样痛苦，并且具有特异性好和灵敏度高的特点，能够用于膀胱癌诊断，治疗过程中的疗效评估及其治疗后的转移复发监控，为医生提前进行干预提供了指导。
【专利说明】CSTImRNA和CST4mRNA或其编码的蛋白质在制备膀胱癌标志物中的应用及其试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于诊断领域,具体涉及Cystatin SN和Cystatin S在制备膀胱癌标志物中的应用，还涉及诊断膀胱癌的试剂盒。
【背景技术】
[0002]膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，也是全身十大常见肿瘤之一。占我国泌尿生殖系统肿瘤发病率的第一位，而在西方其发病率仅次于前列腺癌，居第2位。2012年全国肿瘤登记地区膀胱癌的发病率为6.61/10万，列恶性肿瘤发病率的第9位。膀胱癌可发生于任何年龄，甚至于儿童。其发病率随年龄增长而增加，高发年龄50~70岁。随着我国老龄化进程加速，膀胱癌发病率呈现逐年上升的趋势。国内大城市中如北京，上海，天津，膀胱癌的发病率已位列男性常见恶性肿瘤的第六位，而死亡率位列第七位。
[0003]半胱氨酸蛋白酶抑制剂Cystatin SN和Cystatin S是人类Cystatin家族成员，分别由CSTl基因和CST4基因编码。Cystatin SN和Cystatin S为典型的分泌蛋白，分布于体液和分泌物中，如眼泪、唾液、血清、血浆等，可以作为乳腺癌标志物。而CSTl和CST4在胃肠肿瘤组织中的表达量高于正常组织，并且CSTl和CST4的表达与浸润深度、远处转移以及肿瘤分期(?M分析)相关；生存分析表明，CSTl和CST4高表达患者的5年生存率显著高于无表达组；Cox回归 分析表明，CSTl和CST4是一个独立预后因子；从而提示CSTl和CST4可能在胃肠肿瘤的发生、发展过程中发挥类似肿瘤抑制因子的作用。但迄今为止，未见CSTl和CST4与膀胱癌相关性的报道。
【发明内容】
[0004]有鉴于此，本发明的目的之一在于提供CSTlmRNA和CST4mRNA在制备诊断和预示膀胱癌标志物中的联合应用，通过CSTlmRNA和CST4mRNA联合检测，提高诊断和预示膀胱癌的特异性；本发明的目的之二在于提供CSTlmRNA和CST4mRNA联合检测试剂盒，该试剂盒具有特异性高，使用方便等优点；本发明的目的之三在于提供Cystatin SN和Cystatin S在制备诊断和预示膀胱癌标志物中的联合应用。
[0005]为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案:
[0006]1.CST ImRNA和CST4mRNA在制备诊断和预示膀胱癌标志物中的联合应用，所述CSTlmRNA的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述CST4mRNA的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0007]优选的，CSTlmRNA和CST4mRNA联合应用的判断公式为P =exp (-1.341+0.005a~0.001b) / [1+exp (-1.341+0.005a~0.001b)]，其中 a = CSTl 拷贝数，b=CST4拷贝数。
[0008]优选的，所述诊断和预示为诊断、疗效评估或转移复发监控。
[0009]2,CSTImRNA和CST4mRNA联合检测试剂盒，包括CSTlmRNA和CST4mRNA的定量检测试剂；所述CSTlmRNA定量检测试剂包括如SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8所示的检测引物和核苷酸序列如SEQ ID N0.20所示的TaqMAN探针；所述CST4mRNA定量检测试剂包括如SEQID N0.9和SEQ ID N0.10所示的检测引物和核苷酸序列如SEQ ID N0.22所示的TaqMAN探针。
[0010]优选的，所述试剂盒还包括SDHA mRNA定量检测试剂，所述SDHA mRNA定量检测试剂包括如SEQ ID N0.11和SEQ ID N0.12所示的检测引物和核苷酸序列如SEQ ID N0.24所示的TaqMAN探针。
[0011]优选的，所述试剂盒还包括特异捕获CSTImRNA、CST4mRNA和SDHA mRNA的磁珠，所述特异捕获CSTlmRNA的磁珠结合有如SEQ ID N0.4所示的探针，所述特异捕获CST4mRNA的磁珠结合有如SEQ ID N0.5所示的探针，所述特异捕获SDHA mRNA的磁珠结合有如SEQ IDN0.6所示的探针。
[0012]更优选的，靶序列捕获液中磁珠的浓度为500 μ g/mL，特异捕获探针的浓度为
2μ M0
[0013]优选的，所述试剂盒还包括10 XBuffer，dNTP, MgCl2, DMSO, DTT, Taq 酶、UDG、逆转录酶和RNA酶抑制剂。
[0014]3、Cystatin SN和Cystatin S在制备诊断和预示膀胱癌标志物中的联合应用，编码Cystatin SN的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，编码Cystatin S的核苷酸序列如SEQID N0.2 所示。
[0015]优选的，Cysta tin SN和Cystatin S联合应用的判断公式为P =exp (-43.523+0.272a+0.027b) /[1+exp (-43.523+0.272a+0.027b)]，其中 a = Cystatin SN浓度，b = Cystatin S 浓度。
[0016]优选的，所述诊断和预示为诊断、疗效评估或转移复发监控。
[0017]本发明的有益效果在于:本发明公开了诊断和预示膀胱癌的新标志物，即CSTlmRNA和CST4mRNA或其所编码的蛋白质，利用两个标志物联合检测的特异性和灵敏度高于使用其中一个标志物；本发明还公开了诊断和预示膀胱癌标志物的试剂盒，该试剂盒使用方便，能够直接收集尿液进行检测，不需要采集血清，减少患者的取样痛苦，并且具有特异性好和灵敏度高的特点，其诊断结果与临床诊断结果一致，在监控过程中还可以及早发现转移复发情况，为医生提前进行干预提供了指导。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图:
[0019]图1为磁珠法从尿液中特异性富集mRNA原理图。
[0020]图2为特异性探针和非特异性探针富集CSTl基因比较结果。
[0021]图3为特异性探针和非特异性探针富集CST4基因比较结果。
[0022]图4为特异性探针和非特异性探针富集SDHA基因比较结果。
[0023]图5为膀胱癌组织与癌旁组织CSTl相对表达量的比值结果图。
[0024]图6为膀胱癌组织与癌旁组织CST4相对表达量的比值结果图。
[0025]图7为CSTl绝对定量标准曲线。
[0026]图8为CST4绝对定量标准曲线。[0027]图9为检测97例样本的CSTl基因含量结果图。
[0028]图10为检测97例样本的CST4基因含量结果图。
[0029]图11为受试者CSTl基因ROC曲线。
[0030]图12为受试者CST4基因ROC曲线。
[0031]图13为受试者CSTl基因和CST4基因联合检测ROC曲线。
[0032]图14为ELISA检测Cystatin SN在膀胱癌组织及癌旁组织表达情况(1-T和2-T表示膀胱癌组织，1-N和2-N表示癌旁组织)。
[0033]图15为ELISA检测Cystatin S在膀胱癌组织及癌旁组织表达情况(1-T和2-T表示膀胱癌组织，1-N和2-N表示癌旁组织)。
[0034]图16为Cystatin SN蛋白标准曲线。
[0035]图17为Cystatin S蛋白标准曲线。
[0036]图18为Cystatin SN和Cystatin S标志物单独检测及联合检测的ROC曲线。【具体实施方式】
[0037]下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J-萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0038]实施例1、磁珠法从尿液中特异性富集CSTl、CST4和SDHA基因的mRNA
[0039]根据CST1、CST4和SDHA的mRNA序列设计捕获CST1、CST4和SDHA基因mRNA的特异探针(CSTlmRNA的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，CST4mRNA的核苷酸序列如SEQ IDN0.2，SDHA mRNA的核苷酸序列如SEQ ID N0.3)，具体如下:捕获CSTlmRNA的探针为5’_aaagagcacaactgtttcttctgca (dA) 30-3’ (SEQ ID N0.4)，捕获 CST4mRNA 的探针为 5’_taccaggtctattagaagca(dA) 30-3’(SEQ ID N0.5)，捕获内参基因SDHA (泛醌还原酶)mRNA的探针为5’ -ggagcgaatggctggcgggacg(dA) 30-3’ (SEQ ID N0.6),上述特异探针能够与磁珠(GE,货号为3815-2103-010150)的olig(dT)互补结合，得结合特异探针的磁珠。
[0040]富集CST1、CST4和RPNl基因的mRNA，具体步骤如下:将新鲜尿液与样本运输保存液按照体积比为2:1的比例混合，得处理后的尿液样本，该处理后的尿液样本4°C条件下可保存一周，-20°C条件下可保存I年；然后分别将200 μ L含有磁珠的靶序列捕获液加入到200yL处理后的尿液中，于75°C条件下处理5分钟；涡旋混匀后，室温静置15分钟；然后将样品置于磁性分离器上，5分钟后，吸弃上清，加入ImL漂洗液，涡旋混匀，上磁性分离器，5分钟后，吸弃上清；最后室温(18~25°C)静置5分钟，加入洗脱液20yL，枪头吹打混匀，上磁力架5分钟，将上清转移至新的EP管中，富集原理如图1所示。
[0041] 富集过程中，样品运输保存液中各组分浓度如下:110mM LiDS(十二烷基硫酸锂)，IOmM NaH2PO4, IOmM Na2HPO4, 5mM EDTA, 7mM EGTA, pH7.5 ;靶序列捕获液中各组分浓度如下:135mM HEPES, 1.25M LiCl, IlOmM LiOH, IOmM EDTA, ρΗ7.0，500 μ g/mL 磁珠，2 μ M 捕获探针；漂洗液中各组分浓度如下:100mM HEPES,350mM NaCl, IOmM NaOH，2mM EDTA,3%乙醇，0.2%羟基甲酯，0.1%羟基丙酯，0.1% SDS, pH7.5 ;洗脱液中各组分浓度如下:20mMTris-HCl，ρΗ7.5，ImM EDTA0
[0042]同时以非特异性探针oligo(dT)按上述相同的方法非特异性富集mRNA。[0043]将上述富集获得的mRNA通过定量PCR分别检测CSTImRNA、CST4mRNA和SDHAmRNA的相对含量，检测所使用的引物如下:
[0044]CSTl 检测引物:上游引物:5，-agagccaggcaacagacc-3’ (SEQ ID N0.7)
[0045]下游引物:5，-gttcatggaaggcacagg-3’ (SEQ ID N0.8)
[0046]CST4 检测引物:上游引物:5’ -atgaacagccagaactgca-3’ (SEQ ID N0.9)
[0047]下游引物:5，-caagaaggaaggagggag-3，(SEQ ID N0.10)
[0048]SDHA 检测引物:上游引物:5，-attactccaagcccatcc-3’ (SEQ ID N0.11)
[0049]下游引物:5，-gcacagtcagcctcgttc-3’ (SEQ ID N0.12)
[0050]然后构建如下检测体系:SYBR Green2XMixlO μ L(购于东洋纺(上海)生物科技有限公司)，终浓度分别为250ηΜ的上游引物和下游引物，模板2 μ L，加ddH20将体积补充M 20 μ Lo
[0051 ] 并按如下条件检测:先预变性5分钟，然后在95°C变性10秒、60°C退火15秒、72°C延伸20秒，进行45个循环；最后熔解:95°C，I分钟；40°C，I分钟；65°C，I秒；95°C，I分钟，冷却 50°C，30sec。
[0052]同时以oligo(dT)非特异性富集的mRNA为对照,检测引物、体系和检测条件按上述方法进行，然后比较CSTl 、CST4和SDHA基因mRNA CP值(Cross Point)，结果如图2_4所
/Jn ο
[0053]由图2-4可知，使用特异探针富集到的CSTImRNA、CST4mRNA和SDHA mRNA的CP值更小，表明其富集的浓度更高，具有背景低，信噪比高的特点，优于使用非特异探针富集的mRNA ο
[0054]实施例2、检测CSTl和CST4在膀胱癌组织中表达情况
[0055]从上海第五人民医院泌尿外科收集膀胱癌、癌旁配对组织样本30例，切至米粒大小，放至RNAlater保存液中_80°C贮存，使用前平衡至室温。然后按照实施例1的方法分别富集膀胱癌和癌旁配对组织的CSTlmRNA、CST4mRNA和SDHA mRNA，再分别以CSTl检测引物、CST4检测引物和内参基因SDHA检测引物检测30例样本膀胱癌和癌旁配对组织中CSTl基因和CST4基因相对表达量，检测体系和检测条件与实施例1相同。检测结果采用法计算相对表达量，然后统计膀胱癌与癌旁配对组织相对表达量的比值(C/N)，统计结果如图5和图6所示。由图5和图6可知，CSTl基因和CST4基因在膀胱癌组织中明显上调，明显高于癌旁组织的表达量，上述结果预示检测CSTlmRNA和CST4mRNA含量可以用于诊断膀胱癌。
[0056]实施例3、构建膀胱癌检测试剂盒
[0057]1、构建CSTl重组质粒
[0058]以膀胱癌细胞株T24为材料提取膀胱癌细胞株T24总mRNA，然后以提取的mRNA为模板合成cDNA，并根据CSTl基因序列设计构建CSTl重组质粒的引物，上游引物为5，_ctggagccccaaggagga_3，(SEQ ID N0.13),下游引物为 5，_accagtccaggggtggga_3，(SEQID N0.14)，以SEQ ID N0.13和SEQ ID N0.14所示核苷酸为引物，合成的cDNA为模板进行PCR扩增，扩增条件为:94°C变性5分钟；94°C变性30秒、60°C退火30秒、72°C延伸I分钟，进行45个循环；72°C延伸5分钟，4°C冷却。将扩增产物与PTZ57R载体连接，构建CSTl重组质粒，并将重组质粒送测序机构测序，测序表明扩增产物的核苷酸序列如SEQ IDN0.15所示。该序列与理论扩增子序列相同，然后将CSTl重组质粒用甘油保种，作为检测CSTl基因的标准品。
[0059]2、构建CST4重组质粒
[0060]根据CST4基因序列设计构建CST4重组质粒的引物，上游引物为5，_tctgaggagaccatggcc_3，(SEQ ID N0.16)，下游引物为 5，-tgtaccaggtctattagaagcaag-3’ (SEQ ID N0.17)，然后以SEQ ID N0.16和SEQ ID N0.17的核苷酸为引物，合成的cDNA为模板进行PCR扩增，扩增条件为:94°C变性5分钟；94°C变性30秒、60°C退火30秒、72°C延伸I分钟，进行45个循环；72°C延伸5分钟，4°C冷却。将扩增产物与pTZ57R载体连接，构建CST4重组质粒，并将重组质粒送测序机构测序,测序表明扩增产物的核苷酸序列如SEQ IDN0.18所示。该序列与理论扩增子序列相同，然后将CST4重组质粒用甘油保种，作为CST4基因的标准品。
[0061]分别将CSTl重组质粒和CST4重组质粒，通过双酶切(EcoR 1、BamH I )线性化目标序列，割胶回收得到纯的线性化片段。使用体外转录试剂盒，以线性化的序列为模板，在T7RNA聚合酶的作用下，制备得到RNA，经RNA纯化试剂盒纯化后，得到RNA标准品贮液，测定浓度。经Agilent2100作RNA完整性分析，电泳图谱显示除目标序列外无其他明显的杂带及RNA降解带，则可以作为RNA标准品贮液，以备下游使用。
[0062]实施例4、绘制CSTl和CST4的标准曲线
[0063]将实施例3获得的mRNA标准品作如表1和表2的梯度稀释，具体如下:
[0064]表1、CSTIRNA标准品稀释梯度 [0065]
【权利要求】
1.CSTlmRNA和CST4mRNA在制备诊断和预示膀胱癌标志物中的联合应用，所述CSTlmRNA的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述CST4mRNA的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于=CSTlmRNA和CST4mRNA联合应用的判断公式为 P = exp (-1.341+0.005a~0.001b) /[1+exp (-1.341+0.005a~0.001b)]，其中 a = CSTl拷贝数，b = CST4拷贝数。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于:所述诊断和预示为诊断、疗效评估或转移复发监控。
4.CSTlmRNA和CST4mRNA联合检测试剂盒，其特征在于,包括CSTlmRNA和CST4mRNA的定量检测试剂；所述CSTlmRNA定量检测试剂包括如SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8所示的检测引物和核苷酸序列如SEQ ID N0.20所示的TaqMAN探针；所述CST4mRNA定量检测试剂包括如SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10所示的检测引物和核苷酸序列如SEQ ID N0.22所示的TaqMAN 探针。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还包括SDHAmRNA定量检测试剂，所述SDHA mRNA定量检测试剂包括如SEQ ID N0.11和SEQ ID N0.12所示的检测引物和核苷酸序列如SEQ ID N0.24所示的TaqMAN探针。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还包括特异捕获CSTlmRNA、CST4mRNA和SDHA mRNA的磁珠，所述特异捕获CSTlmRNA的磁珠结合有如SEQ ID N0.4所示的探针，所述特异捕获CST4mRNA的磁珠结合有如SEQ ID N0.5所示的探针，所述特异捕获SDHA mRNA的磁珠结合有如 SEQ ID N0.6所示的探针。
7.根据权利要求4-6任一项所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还包括IOXBuffer, dNTP, MgCl2, DMSO, DTT, Taq 酶、UDG、逆转录酶和 RNA 酶抑制剂。
8.Cystatin SN和Cystatin S在制备诊断和预示膀胱癌标志物中的联合应用，其特征在于:编码Cystatin SN的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示,编码Cystatin S的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于:CystatinSN和Cystatin S联合应用的判断公式为 P = exp (-43.523+0.272a+0.027b) /[1+exp (-43.523+0.272a+0.027b)]，其中 a=Cystatin SN 浓度，b = Cystatin S 浓度。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于:所述诊断和预示为诊断、疗效评估或转移复发监控。
【文档编号】C12Q1/68GK103966348SQ201410233905
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年5月29日 优先权日:2014年5月29日
【发明者】王弢, 渠香云, 何林富 申请人:上海度微医学技术有限公司