诱导植物雄性不育相关调控的microRNA167a及其应用的制作方法

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及诱导植物雄性不育相关调控的microRNA167a及其应用。

背景技术：

现代农业生产中，杂种优势利用被认为是今后小麦生产水平大幅度提高的主要途径。目前，育种工作者已利用转基因技术将一些育性调控相关基因转入到植物中，并获得了部分甚至完全雄性不育的植株。

MicroRNAs(miRNAs)是一类21-25nt的非编码蛋白质的小RNA分子，能通过碱基配对与mRNA分子的3′端非翻译区结合来降解mRNA或抑制靶基因的转录。关于miR167在植物研究中的报道，拟南芥中发现只有miR167a过表达引起了花卷曲，短花絮，抑制了花的发育；在水稻中，将人工合成的miR167导入体外培养的水稻细胞内发现，ARF8mRNA及其调控的OsGH3-2(水稻的一个吲哚乙酸结合酶)表达水平下降。敲除和过表达ARF8，都会影响下胚轴的伸长和根的发育习性。目前，还未有小麦miR167功能的相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种调控植物雄性不育相关的miRNA tae-miR167a。

本发明的另一目的是提供编码上述调控植物雄性不育相关tae-miR167a的前体序列tae-pre-miR167a。

本发明的另一目的是提供包含上述microRNA前体的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述microRNA前体的转基因细胞系。

本发明的另一目的是提供上述调控植物雄性不育相关tae-pre-miR167a的应用。

本发明所提供的调控植物雄性不育的相关tae-miR167a，来源于杂交小麦品种京麦7号(京审麦2009003)的母本BS366，其成熟体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：tae-miR167a

5ˊ-UGAAGCUGCCAGCAUGAUCUA-3ˊ

其前体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2，tae-pre-miR167a所示。

SEQ ID NO.2：

5ˊ-CUGCCCAAGGGAACGAGUGAAGCUGCCAGCAUGAUCUAGCUCCGAGUGAUCAAACAAGAAACGCUGCGGCAGCCUCACUUCUUCCCGCCGUUGGGCACAACUACUUCU-3ˊ

根据本发明的tae-miR167a及其前体序列tae-pre-miR167a可人工合成，也可以根据公开的序列设计引物，通过PCR扩增得到。

根据本发明的调控植物雄性不育相关tae-miR167a的前体序列tae-pre-miR167a的表达会诱导植株出现花药不开裂，花粉不育及果荚退化不结实。

含有tae-pre-miR167a的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有tae-pre-miR167a的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元表达载体系统和可用于植物微弹轰击法的载体等。

为了便于对转基因植物细胞或植株进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。

本发明的另一个目的是提供一种培育雄性不育植株的方法。本发明所提供的培育雄性不育植物的方法，是将上述任一种含有tae-pre-miR167a的重组表达载体导入植物细胞中，得到雄性不育植物，优选所述植物为小麦。

利用任何一种可以引导外源microRNA在植物中表达的载体，将本发明所提供的tae-pre-miR167a基因导入植物细胞，可获得花器官发育缺陷以及雄性不育的转基因细胞系及转基因植株。携带有tae-pre-miR167a的载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、小麦、长穗偃麦草、拟南芥、水稻、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。

本发明以杂交小麦品种京麦7号(京审麦2009003)的母本BS366为实验材料，利用设计的特异引物，从小麦克隆获得小麦来源的tae-pre-miR167a，并将tae-pre-miR167a导入拟南芥，使得拟南芥花药不开裂，与对照组相比，转基因植株的育性降低，从而通过基因工程的方法验证其功能。对于小麦来源的tae-pre-miR167a，本发明发现它也可以诱导拟南芥雄蕊的花粉不育，果荚出现不结实现象，研究小麦中该microRNA与育性的关系是本发明的一个重要创新点。

本发明的诱导雄性不育相关microRNA对培育光温敏雄性不育小麦有很大的推进作用，使二系法育种更加实际，对杂种优势的利用和推广有十分重要的理论和实际意义。总之，运用基因工程方法构建雄性不育转基因植株，可以简化育种程序，改进育种模式，尤其是对光温敏雄性不育相关基因的研究和利用，可以推进二系法育种，从而加速杂种优势在小麦遗传育种中的应用。

附图说明

图1显示诱导雄性不育相关调控tae-pre-miR167a的克隆。以BS366cDNA为模板，PCR扩增tae-pre-miR167a的cDNA片段，1,2为tae-pre-miR167a扩增产物；M，DL2000marker(100，250，500，750，1000，2000bp)。

图2显示转基因拟南芥阳性植株检测，其中，1为阴性对照，2为野生型，3～8为转基因拟南芥检测株，9为载体对照。

图3显示转基因拟南芥整株表型，其中，转基因拟南芥，花器官发育不正常，不能完成受精作用，果荚不发育。

图4显示tae-pre-miR167a表达导致拟南芥果荚发育异常，其中，A为野生型拟南芥的果荚，果荚大并且饱满；B为转基因拟南芥的果荚，果荚小并且干瘪。

图5显示tae-pre-miR167a表达导致拟南芥花器官发育异常，其中A为野生型拟南芥花器官，花丝长度正常，花药正常开裂，花粉自然散出；B为转基因拟南芥花器官，花丝短小，花药不开裂，无花粉散出。

图6显示转基因拟南芥花药碘染结果，其中，A为野生型拟南芥花粉能被碘染，具有活力；B为转基因拟南芥花粉不能被碘染，没有活力。

具体实施方式

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

实施例1：小麦光温敏雄性不育相关tae-pre-miR167a的cDNA克隆

取小麦BS366的花药，用Trizol法提取花药的总RNA，用superscript II(购自invitrogen公司)反转录酶反转录获得到cDNA。利用tae-pre-miR167a的特异引物P1和P2，以反转录得到的cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增产物如图1所示。引物P1和P2的序列如下：

P1：5’-CTGCCCAAGGGAACGAGTGAA-3’

P2：5’-AGAAGTAGTTGTGCCCAACGGC-3’

PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到长度约为120bp左右的条带，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(TIANGEN)回收该片段。将该回收片段与pGEM-T Easy(购自Promega公司)连接，参照Cohen等的方法(Proc Natl Acad Sci，69:2110)，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，根据pGEM-T Easy载体上的氨卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。

实施例2：用Tae-pre-miR167a基因培育雄性不育转基因植物

1、重组表达载体的构建

tae-pre-miR167a双子叶植物重组表达载体的构建

以小麦BS366的总microRNA反转录得到的cDNA为模板，用含有XbaI和SmaI接头序列的特异引物进行PCR扩增；然后酶切PCR产物，回收，将酶切产物插入载体pBI121，得到重组载体pBI121-tae-pre-miR167a。

引物序列如下：

tae-pre-miR167a[XbaI]：5’–GCTCTAGACTGCCCAAGGGAACGAGTGAA-3’

tae-pre-miR167a[SmaI]：5’–TCCCCCGGGAGAAGTAGTTGTGCCCAACGGC-3’

2、转基因拟南芥的获得和鉴定

1)转基因拟南芥的获得

将上述构建的重组表达载体pBI121-tae-pre-miR167a用冻融法转化根癌农杆菌C₃₈C₁，再用浸花法将整合有pBI121-tae-pre-miR167a的根癌农杆菌C₃₈C₁转化拟南芥。在含有100mg/L卡那霉素的MS培养基进行筛选，得到候选阳性转基因植株。

对tae-pre-miR167a转基因拟南芥候选阳性植株经PCR扩增可获得长度为120bp大小的条带，如图2所示，结果获得5株阳性植株。

2)转tae-pre-miR167a拟南芥雄性不育表型鉴定

将T2代转tae-pre-miR167a拟南芥阳性株与野生型植株在培养室培养，22℃，湿度40％，光周期：12h/12h，观察表型并拍照。在开花期结合花器官生长情况，做花粉碘染实验，观察花粉的育性。

结果表明：pBI121-tae-pre-miR167a转基因植株在正常温室条件下能正常生长，生长初期花器官发育正常，与对照植株相比无明显差别。到开花期时，转基因植株和野生植株花器官呈现出明显差异，转基因株的育性明显下降。tae-pre-miR167a调控拟南芥花器官发育鉴定结果证明，tae-pre-miR167a在植物开花期或繁殖期调控植株雄性不育。图3显示了pBI121-tae-pre-miR167a转基因植株在正常生长条件下的情况，其中，转基因拟南芥花器官发育不正常，不能完成受精作用，果荚不发育。

拟南芥tae-pre-miR167a转基因植株与对照植株在开花期和果荚成熟期表现出明显的不同。如图5所示，A为野生型拟南芥花器官，花丝长度正常，花药正常开裂，花粉自然散出；B为转基因拟南芥花器官，花丝短小，花药不开裂，无花粉散出，开花期主要表现在雄蕊的生长发育上，转基因植株花药形态异常，花丝不能伸长，花药不开裂，花粉不能散出。而对照植株雄蕊发育正常，花丝正常伸长，花药正常开裂，花粉正常散出，且能完成受精作用。如图4所示，tae-pre-miR167a表达导致拟南芥果荚发育异常，其中，A为野生型拟南芥的果荚，果荚大并且饱满；B为转基因拟南芥的果荚，果荚小并且干瘪果荚成熟期的转基因植株表现为果荚异常，与对照组相比，转基因植株的果荚小，干瘪，无正常种子形成。图6所示，显示转基因拟南芥花药碘染结果，其中，A为野生型拟南芥花粉能被碘染，具有活力；B为转基因拟南芥花粉不能被碘染，没有活力。用1％KI-I₂对花粉进行碘染，结果发现对照组花粉粒较多并且饱满，能被碘染，而转基因组花粉粒较少且不能被碘染，为碘败，证明转基因植株的花粉无活力。

<110> 北京市农林科学院

<120> 诱导植物雄性不育相关调控的microRNA167a及其应用

<160> 2

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> 小麦

<400> 1

ugaagcugcc agcaugaucu a 21

<210> 2

<211> 108

<212> RNA

<213> 小麦

<400> 2

cugcccaagg gaacgaguga agcugccagc augaucuagc uccgagugau caaacaagaa 60

acgcugcggc agccucacuu cuucccgccg uugggcacaa cuacuucu 108