专利名称：用组培获得100％不育群体的白菜制种技术的制作方法
技术领域：
本发明是一种通过白菜雄性不育系组织培养的方法生产一代杂种种子的技术。属于组织培养与大白菜杂种优势利用领域。国际专利分类为C12N5/00。
目前国内外大白菜杂优利用的主要途径是自交不亲和系和雄性不育两用系。
1、自交不亲和系日本从五十年代初期开始应用自交不亲和系配制杂交种，近年日本育成的大白菜杂交种几乎全部都是自交不亲和系杂交种。国内，青岛市农科所于一九六八年首先采用自交不亲和系法育成了“青杂早丰”，此后自交不亲和系逐渐成为国内大白菜杂优利用的主要途径之一。自交不亲和系法的缺点，一是杂种纯度不理想，真杂种率不可能达到100%，二是自身繁殖困难，成本高。
2、雄性不育两用系这是我国独创的大白菜杂优利用方法。在一九七四年的全国蔬菜科研协作会议上，中国农科院、沈阳农业大学、沈阳市农科所、郑州市蔬菜所同时发表了“大白菜雄性不育两用系研究和利用的研究报告”，此后，雄性不育两用系亦逐渐成为国内大白菜杂优利用的主要途径之一。雄性不育两用系的缺点是只有50%不育株率，制种时需加密定植母本行，随之在开花前又必须拔除占50%株数的可育株。
鉴于大白菜自交不亲和系和雄性不育两用系尚不尽理想，所以，一九七八年至一九八二年国家农业部曾组织全国大白菜雄性不育系攻关协作组，攻关协作组利用从法国和美国引进的具有萝卜细胞质和aa染色体组的雄性不育系R1转育大白菜不育系，但始终未能克服R1的叶片黄化、密腺退化和杂种优势不强的严重缺陷。此后，一九八七年黑龙江省园艺所鉴定了“王兆红萝卜×白菜”远缘杂交，回交育成的134大白菜胞质不育的育种材料，但该不育材料亦因叶片黄化尚不能用于生产。另据《四川农业科学》报导(1988年第五期)，成都市农科所育成大白菜“早皇白”雄性不育系，并育成不育系杂交种“六十天早”推广应用。该不育系采用属间远缘杂交，回交育成不育株率虽达到97.56%。但不育性尚欠稳定。
在组织培养方面，目前还未见大白菜组织培养的报道关于植物组织培养的报道较多，分别概述如下1、专利文献中有关组织培养的报道。日本专利JP58-28278至JP58-28282，JP58-116677，JP59-28471，JP60-2183，JP60-16589，JP60-105491，JP61-78379至JP61-78381，JP61-88876，JP60-166281，JP60-186281，JP60-105491，苏联专利SU1036306，SU1076034，SU810160，欧洲专利EP-183-973A20，EP-111-664-A24，英国专利GB208983T，GB2112-413A，中国专利申请CN87101002，CN86103374，CN87104202，CN87107542，CN86104756，CN86103448，CN86108050，CN87104410，CN87107227均报道了有关植物组织培养技术，其培养基大部分选择MS培养基，在培养基中加进一定微量元素，培养材料选择有原生质体、植物各种器官等。消毒培养条件根据植物特点选定。
2、PlantcellRepts1986.5期5-8页报道了《用组织培养法进行LeptospermamSPP的无性繁殖》研究了促进三种Leptospermam(L.brachyandrum，L.petersonii和L.flavescens)的繁殖条件。将腋芽的外植体和轴外植体置于含有常量元素、微量元素、维生素、氨基酸、蔗糖(0.06克分子)和苄氨基嘌呤(0.04-1.0微克分子)的培养基上，在16小时照明条件下培养。降低培养基中的琼脂浓度(由0.8降至0.2%)，能大大刺激腋芽的发育和L.flavescens和L.brachyandrum的生长。2.4-D和对氯苯氧基乙酸在L.flavescens中当浓度分别为5和1微克分子时，能刺激腋芽生根。在L.petersonii中，刺激根萌发及其发育的是β-萘乙酸(1微克分子)，而在L.brachyandrum中则是吲哚丁酸和α萘乙酸。
PlantcellRepts19865期17-18页报道了《用腋芽组织培养繁植薄荷属的种》介绍了利用腋芽进行6种薄荷的快速繁殖方法。将一年生植物薄荷(M.arvensis)辣薄荷(M.piperita)，唇萼薄荷(M.pulegium)，留兰香(M.spicata)和薄荷(M.viridesl.)的节片接在含有6苄胺基嘌呤(10.2毫克/升)和激动素(10毫克/升)的MS培养基上，于28℃静置，并照明12小时。经过30天在外植体上生成若干枝(平均每个外植体15-20个枝)和根，将获得的再生植体移入土壤中作进一步培养。列举了关于2.4-D、萘乙酸、吲哚乙酸、激动素和6-苄胺基嘌呤对再生过程的影响资料。
本发明的目的是采用组织培养技术快速繁殖大白菜雄性不育系，从而简化制种程序获得100%的不育群体，用于杂交制种。
本发明是一种利用组织培养获得白菜100%不育群体生产一代杂种种子的方法，其特征是取雄性不育系的白菜种子，或不育株的其他器官和组织，经过组织培养快速繁殖，形成试管苗，将试管苗移栽形成100%不育群体，用该不育群体生产杂种一代种子。
(1)取雄性不育株的白菜种子，或不育株的其他器官和组织，经表面消毒，在无菌条件下接种在88-13或88-52或CC-1、或CC-1A基本培养基中，该培养基另加6BA(或KT)3.0-5.0mg/L，NAA(或IAA)0.1-0.5mg/L，活性炭0.15-0.50%，培养5-15天后生长成幼苗。
(2)在无菌条件下，将幼苗顶芽切下，接种在88-13或88-52或CC-1、或CC-1A基本培养基中，该培养基另加6BA(或KT)2.0-4.0mg/L，NAA(或IAA)0.1-1.0mg/L，诱导产生不定芽，以后每隔10-20天继代一次。
(3)在无菌条件下，将不定芽转移到88-13或88-52或CC-1A或CC-1基本培养基中，该培养基另加6BA(或KT)1.0-4.0mg/L，NAA(或IAA)0.5-1.0mg/L，活性炭0.15-0.50%。培养20天后，形成具根可移栽的试管苗。
(4)将试管苗移栽到装有营养土的培养钵内，在气温＞-5℃的条件下，试管苗可直接移植到阳畦中。经过栽培管理，形成正常开花的不育群体。制种技术采取适期移栽和定植、合理密植、适宜行比，从而提高种子产量。
为了克服自交不亲和系繁殖困难、不亲和性稳定度差和退化问题，以及克服不育系拔除有粉株的麻烦，本发明利用组织培养方法繁殖不育株获得了100%不育群体。与现有方法比较，它有下列优点1、由于获得的群体达到100%的不育率，可保证100%的杂交率;
2、不会因自交而出现生活力退化;
3、由于可容易地从自然群体或通过转育获得不育株，所以该方法简单易行，且亲本来源广泛;
4、有利于工厂化生产;
5、由于制种群体实际为一个单株的无性系，因此有可能利用未完成纯化的材料生产优质的一代杂种，扩大了白菜一代杂种亲本的利用范围，从而简化制种程序。
下面详细叙述
具体实施例方式(一)不育组培苗的生产取一粒雄性不育株种子，经表面消毒，在无菌条件下接种在选定的种子培养基中。在一定环境条件下培养5-15天，生长成幼苗，切其顶芽转入到另一选定的不定芽培养基上，诱导产生不定芽。以后每隔15天左右继代一次。不定芽可以每月平均为5倍的速率繁殖。
将不定芽移到已选定的生根成苗培养基上20天后，可形成具根、可移栽的正常植株。其植株分化速率每月平均为7倍。即1个芽培养5个月后可繁殖1.6万棵正常植株。
在我们选用的小白口两用系试材中，首次培养出15、29、57、174等株系。试管苗经春化后，每个系移栽40棵，开花后观察它们的育性。结果表明，15、29和57号的全部植株都是不育株，174号的植株都是可育株。在以后的培养过程中，除掉可育株系，保留不育株系。
种子培养基、不定芽培养基、生根培养基都是以88-13或88-52或C.C-1或C.C-1A为基本培养基。初代培养基还要另加6BA(或KT)3.0-5.0mg/L，NAA(或IAA)0.1-0.5mg/L，活性炭0.15-0.50%;不定芽培养基还要另加6BA(或KT)2.0-4.0mg/L，NAA(或IAA)0.1-1.0mg/L;生根培养基还要另加6BA(或KT)1.0-4.0mg/L，NAA(或IAA)0.5-1.0mg/L，活性炭0.15-0.50%。
1、消毒药剂和方法的选择通过对多种消毒药剂的试验，筛选出一种既可保证种子消毒接种后培养基不污染，又不影响种子发芽和幼苗生长的消毒药剂和方法。具体为用70%酒精浸泡种子表面5-30秒后用0.3%新洁尔浸泡种子5-6分钟，然后用0.2%氯化高汞浸泡种子8分钟。最后用无菌蒸馏水冲洗种子3-4次。
2、基本培养基筛选自我设计和选用了共9种培养基进行基本培养基的筛选。通过多次对比试验，选择出4种培养基为适宜的培养基。分别为88-13，88-52，C.C-1，C.C-1A。其培养基成分附后。
3、激素种类和浓度的选择激素是培养基的重要成分，以3种生长素，9种生长素浓度，2种激动素，6种激动素浓度进行激素种类和浓度的对比试验。试验结果表明6BA(6-卞基嘌呤)2.0-4.0mg/L，NAA(萘乙酸)0.1-1.0mg/L，为诱导芽最合适的激素种类和浓度。6BA(6-卞基嘌呤)3.0-5.0mg/L，NAA0.1-0.5mg/L为初代培养最合适的激素种类和浓度。6BA1.0-4.0mg/L，NAA0.5-1.0mg/L，为成苗最适宜的激素种类和浓度。对于上述两种激素，可用KT(激动素)代替6BA，可用IAA(吲哚乙酸)代替NAA，浓度相同。
4、种子萌发成苗芽分化成株2个阶段对活性炭的依赖性通过试验证明将种子播入培养基到萌发成苗这一阶段，培养基必须附加活性炭，否则影响种子萌发阶段的下胚轴伸长和顶芽的发生。
通过试验证明将不定芽转入到附加活性炭的培养基中，可使其发育成为具有根、茎、叶，可移栽的正常植株，不加活性炭的相应培养基，只能产生大量不发芽，不能发育成为正常植株。
5、培养条件的选择通过试验和观察，幼苗、顶芽、不定芽、试管苗的培养温度白天为18-24℃，夜间为10-15℃，光照为1000-2000勒克司，每天光照10小时为合适的培养条件。当温度超过25℃时，试管苗极易发生玻璃化。
(二)不育系组织培养苗的移植将试管苗移植到培养钵内，每钵一株，成活率可达85%以上。具体移栽技术如下1、培养基将试管苗分别移栽到装有土、土+蛭石和花卉营养土三种培养基的营养钵内。试验表明，以蛭石∶土＝1∶1为最佳培养基，既通风又保水，适合幼苗生长。在园土和土+蛭石培养基质中加入1公斤复合肥/立方米。
2、温度幼苗在10-30℃下都能生长，以日/夜＝25/10℃为宜。移植于温室或塑料大棚后，浇足水，上盖塑料薄膜1-3天，3-7天后即可移栽到阳畦中。在气温为＞-5℃的条件下，试管苗可直接移植到阳畦中。
3、密度适宜的父母本行比为1∶3-18，合理的密度为每亩定植密度3500-5000株。
4、适期移栽和定植保证苗期有20-40天的小于5℃天气，定植时气温要≥0℃。
(三)杂交组合父本苗的获得1、可利用常规小株采种技术获得父本群体2、可利用上述组培技术，获得父本单株无性系群体(四)杂交种生产技术制种技术主要采取安全隔离、适期移栽和定植、合理密植、适宜行比、适期收获。现以小白口XE9的制种技术为例叙述1、安全隔离杂种制种要求周围1公里以上的距离没有其它白菜、蔓菁、油菜等十字花科作物同时采种。
2、适期移栽和定植北京地区1月下旬到2月上旬移载不育试管苗，同时移栽或播种可育父本，3月下旬定值。
3、适期收获终花期提前铲除父本行，以利种子采收和田间通透。种株进入黄荚后期进行收获，后熟、脱粒。
附录88-13培养基成分化合物毫克/升NH4NO31650Mg/LCaCl2·2H2O 440Mg/LMgSO4·7H2O 370Mg/LKNO31900Mg/LKH2PO4170Mg/LZnSO4·7H2O 10Mg/LH3BO310Mg/LMnSO4·4H2O 25Mg/LCuSO4·5H2O 0.025Mg/LNa2MoO4·2H2O 0.25Mg/L
盐酸噻胺0.5mg/L盐酸吡哆素0.5mg/L叶酸0.5mg/L肌醇100mg/L烟酸5mg/L甘氨酸2mg/L生物素0.05mg/L蔗糖3%琼脂0.8%PH5.8
88-52培养基成分化合物毫克/升NH4NO31650Mg/LCaCl2·2H2O 440Mg/LMgSO4·7H2O 370Mg/LKNO31900Mg/LKH2PO4170Mg/LZnSO4·7H2O 8.6Mg/LH3BO36.2Mg/LMnSO4·4H2O 22.3Mg/LKI0.83mg/LCoCl2·6H2O 0.025mg/LCuSO4·5H2O 0.025Mg/LNa2MoO4·2H2O 0.25Mg/L
盐酸硫胺素0.4mg/L盐酸吡哆素0.5mg/L烟酸0.5mg/L肌醇100mg/L甘氨酸2mg/L蔗糖3%琼脂0.8%PH5.8C.C-1培养基成分化合物毫克/升NH4NO3450Mg/LCaCl2·2H2O 600Mg/L
MgSO4·7H2O 250Mg/LKNO3300Mg/LKH2PO4300Mg/LZnSO4·7H2O 10Mg/LH3BO310Mg/LMnSO4·4H2O 25Mg/LCuSO4·5H2O 0.025Mg/LNa2MoO4·2H2O 0.25Mg/L
盐酸噻胺0.5mg/L盐酸吡哆素0.5mg/L叶酸0.5mg/L肌醇100mg/L烟酸5mg/L甘氨酸2mg/L生物素0.05mg/L蔗糖3%琼脂0.8%PH5.8C.C-1A培养基化合物毫克/升NH4NO31500-1800Mg/L (或NH4SO4) 120-500mg/LCaCl2·2H2O 150-650Mg/LMgSO4·7H2O 250-450Mg/LKNO3300-2500Mg/LKH2PO4150-400Mg/L (或Na2PO4) 120-175mg/LZnSO4·7H2O 4-15Mg/LH3BO33.8-15Mg/L
MnSO4·4H2O 10-35Mg/LCuSO4·5H2O 0.01-0.04Mg/LNa2MoO4·2H2O 0.1-0.35Mg/LKI0.5-0.9mg/LCoCl0.01-0.04mg/L
盐酸噻胺0.2-0.7mg/L盐酸吡哆素0.2-0.75mg/L叶酸0.25-0.80mg/L肌醇80-120mg/L烟酸2.0-7.0mg/L甘氨酸0.50-4.00mg/L生物素0.02-0.09mg/L蔗糖(或葡萄糖)3%琼脂0.4-0.8%PH5.8
权利要求
1.一种利用组织培养获得白菜100%不育群体生产一代杂种种子的方法，其特征是取雄性不育的白菜种子，或不育株的其他器官和组织，经过组织培养快速繁殖，形成试管苗，将试管苗移栽形成100%不育群体，用该不育群体生产杂种一代种子；(1)取雄性不育株的白菜种子，或不育株的其他器官和组织，经表面消毒，在无菌条件下接种在88-13或88-52或C.C-1或C.C-1A基本培养基中，该培养基另加6BA(或KT)3.0-5.0mg/L，NAA(或IAA)0.1-0.5mg/L，活性炭0.15-0.50%，培养5-15天后生长成幼苗；(2)在无菌条件下，将幼苗顶芽切下，接种在88-13或88-52或C.C-1或C.C-1A基本培养基中，该培养基另加6BA(或KT)2.0-4.0mg/L，NAA(或IAA)0.1-1.0mg/L，诱导产生不定芽，以后每隔10-20天继代一次；(3)在无菌条件下，将不定芽转移到88-13或88-52或C.C-1A或C.C-1基本培养基中，该培养基另加6BA(或KT)1.0-4.0mg/L，NAA(或IAA)0.5-1.0mg/L，活性炭0.15-0.50%。培养20天后，形成具根可移栽的试管苗；(4)将试管苗移栽到装有营养土的培养钵内，经过栽培管理，形成正常开花的不育群体。制种技术采取适期移植和定植、合理密植、适宜行比，从而提高种子产量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是消毒药剂用70%酒精浸泡种子表面5-30秒后用0.3%新洁尔浸泡种子5-6分钟，然后用0.2%氯化高汞浸泡种子8分钟，最后用无菌蒸馏水冲洗种子3-4次。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是试管苗培养条件为温度白天为18-24℃，夜间为10-15℃，光照为1000-2000勒克司，每天光照10小时为合适的培养条件。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是培养钵内营养土为蛭石∶土＝1∶1为最佳培养基，或园土或蛭石培养基质中加入1公斤复合肥/立方米。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征是栽培管理以日/夜＝25/10℃为宜。移植于温室或塑料大棚后，浇足水，上盖塑料薄膜1-3天，3-7天后，即可移栽到阳畦中，在气温为＞-5℃的条件下，试管苗可直接移植到阳畦中。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征是适宜的父母本行比为1∶3-18，合
7.根据权利要求1所述的方法，其特征是适期移载和定植，保证苗期有20-40天的小于5℃天气，定植时气温要≥0℃。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征是C.C-1A培养基成分为化合物毫克/升NH4NO31500-1800Mg/L(或NH4SO3) 120-500mg/LCaCl2·2H2O 150-650Mg/LMgSO4·7H2O 250-450Mg/LKNO3300-2500Mg/LKH2PO4150-400Mg/L (或Na2PO4) 120-175mg/LZnSO4·7H2O 4-15Mg/LH3BO33.8-15Mg/LMnSO4·4H2O 10-35Mg/LCuSO4·5H2O 0.01-0.04Mg/LNa3MoO4·2H2O 0.1-0.35Mg/LKI0.5-0.9mg/LCoCl0.01-0.04mg/L
盐酸噻胺 0.2-0.7mg/L盐酸吡哆素0.2-0.75mg/L叶酸0.25-0.80mg/L肌醇80-125mg/L烟酸2.0-7.0mg/L甘氨酸0.50-4.00mg/L生物素0.02-0.09mg/L蔗糖(或葡萄糖)3%琼脂0.4-0.8%PH5.8
9.根据权利要求1所述的方法，其特征是88-13培养基为:化合物毫克/升NH4NO31650Mg/LCaCl2·2H2O 440Mg/LMgSO4·7H2O 370Mg/LKNO31900Mg/LKH2PO4170Mg/LZnSO4·7H2O 10Mg/LH3BO310Mg/LMnSO4·4H2O 25Mg/LCuSO4·5H2O 0.025Mg/LNa2MoO4·2H2O 0.25Mg/L
盐酸噻胺 0.5mg/L盐酸吡哆素0.5mg/L叶酸0.5mg/L肌醇100mg/L烟酸5mg/L甘氨酸2mg/L生物素0.05mg/L蔗糖3%琼脂0.8%PH5.8
10.根据权利要求1所述的方法，其特征是88-52培养基成分化合物毫克/升NH4NO31650Mg/LCaCl2·2H2O 440Mg/LMgSO4·7H2O 370Mg/LKNO31900Mg/LKH2PO4170Mg/LZnSO4·7H2O 8.6Mg/LH3BO36.2Mg/LMnSO4·4H2O 22.3Mg/LKI0.83mg/LCoCl2·6H2O 0.025mg/LCuSO4·5H2O 0.025Mg/LNa2MoO4·2H2O 0.25Mg/L
盐酸硫胺素 0.4mg/L盐酸吡哆素0.5mg/L烟酸0.5mg/L肌醇100mg/L甘氨酸2mg/L蔗糖3%琼脂0.8%PH5.8
11.根据权利要求1所述的方法，其特征是C.C-1培养基成分为化合物毫克/升NH4NO3450Mg/LCaCl2·2H2O 600Mg/LMgSO4·7H2O 250Mg/LKNO3300Mg/LKH2PO4300Mg/LZnSO4·7H2O 10Mg/LH2BO310Mg/LMnSO4·4H2O 25Mg/LCuSO4·5H2O 0.025Mg/LNa3MoO4·2H2O 0.25Mg/L
盐酸噻胺0.5mg/L盐酸吡哆素0.5mg/L叶酸0.5mg/L肌醇100mg/L烟酸5mg/L甘氨酸2mg/L生物素0.05mg/L蔗糖3%琼脂0.8%PH5.8
全文摘要
一种白菜一代杂种制种新技术，取白菜不育株种子或植株任何部位，经表面消毒，在无菌条件下接种到培养基中，培养5—7天，切其顶芽转入另一培养基，诱导产生不定芽，再将不定芽转接到生根成苗培养基，形成根即可移栽。本发明可获得100％的不育系，使杂交率达到100％，且方法简单易行，亲本来源广泛，有利于工厂化生产，从而扩大了白菜一代杂种亲本的利用范围。
文档编号C12N5/04GK1045991SQ8910171
公开日1990年10月10日 申请日期1989年3月28日 优先权日1989年3月28日
发明者钮心恪, 李春玲, 蒋钟仁, 孙日飞 申请人:北京市海淀区植物组织培养技术实验室, 中国农业科学院蔬菜花卉研究所