本发明涉及牡丹组培技术领域，具体为一种牡丹离体再生组培方法。
背景技术：
芍药科芍药属植物牡丹，作为我国的传统名花，集观赏、药用于一身，近年来又发现‘凤丹白’等牡丹品种种子含油量高，且品质优，被定位为高端食用油，在洛阳、河南、乃至全国，如西藏等地大量种植。牡丹的大面积种植不仅带动一方的旅游事业，同时也带动了地方经济的快速发展。因此，对其进行品质育种的研究，提高其质量，发展我们的优势产业就显得尤为重要。
但是，牡丹因童期长、遗传背景复杂等原因，使得传统育种耗时长、目的性差、选择效率低、更新慢，造成牡丹育种现状不能满足人民群众对牡丹特色市场的日益增长的需求。因此，在继续重视传统育种的同时，创新并应用迅速发展的组织培养技术和转基因技术进行其品质改良已经迫在眉睫。目前国内牡丹快繁的研究，多采用的是鳞芽，也有采用子叶和下胚轴及叶片快繁的，这些研究往往经过愈伤组织再生植株，而牡丹组培中，诱导产生愈伤组织比较容易，而由愈伤组织分化不定芽却比较困难，不定芽分化率一般比较低。李玉龙等人诱导牡丹嫩叶和叶柄产生愈伤组织，并分化成不定芽，实现了少量的植株再生；他得出叶柄的愈伤诱导率及愈伤分化率都显著高于嫩叶。李艳敏诱导紫瑶台叶片愈伤组织的不定芽分化率最高仅为10.0%。可见，牡丹组织培养中，由愈伤组织再生植株的途径还需要深入研究。2009年贾文庆曾采用牡丹胚早熟萌发的方式再生丛生芽，植株再生效果也一般。
技术实现要素：
为了解决上述牡丹离体再生速度慢、效果一般的问题，本发明通过成熟胚再生形成下胚轴，并使下胚轴在植物生长调节剂6-BA和IBA刺激及PEG6000渗透胁迫突然解除的情况下，不经过愈伤组织直接产生不定芽，且生根时改良MS培养基还额外附加了脯氨酸、核黄素，实现牡丹快繁，生根率达到了70%，为牡丹快速繁殖和遗传育种、转基因等遗传操作诱导新品种奠定基础。
本发明为了解决上述问题所采取的技术方案为：一种牡丹离体再生组培方法，包括以下步骤：
步骤一、将牡丹种子灭菌后取其成熟胚，接种在1/2MS培养基上培养；
步骤二、待成熟胚萌发后取其幼嫩的下胚轴，剪切成0.4-0.6cm长，接种在含有4%(W/V)的PEG6000并附加了1.5 - 2.5 mg/L 6-BA、0.2 - 0.5 mg/L IBA和3%(W/V)蔗糖的改良MS培养基上培养15-25天，至下胚轴切口处膨大；
步骤三、将切口处膨大的下胚轴继代在附加了1.5 - 2.5 mg/L 6-BA和0.2 - 0.5 mg/L IBA的改良MS培养基上接种14-30天，至下胚轴膨大的切口处直接分化出牡丹不定芽；
步骤四、待牡丹不定芽长至3-4cm时，将牡丹不定芽从根部切下，并接种在附加了0.2 mg/LNAA、0.2 mg/L IBA、50-100mg/L脯氨酸和0.1-3mg/L核黄素的改良MS培养基上生根，即完成牡丹离体再生。
作为一种优选方案，其中，步骤四中的改良MS培养基替换为1/2改良MS培养基。
作为一种优选方案，步骤二、步骤三和步骤四中采用的改良MS培养基的配方为：Ca2+浓度是MS培养基中Ca2+浓度的两倍， Mn2+、Zn2+、Mo6+和Cu 2+的浓度分别为MS培养基中Mn2+、Zn2+、Mo6+和Cu 2+浓度的1-12倍。
作为一种优选方案，步骤三中改良MS培养基的培养温度为22±2℃，牡丹不定芽的分化频率为35%。
作为一种优选方案，步骤四培养过程采用16小时光照和8小时黑暗处理，光照强度为2000lx，生根培养温度为25±2℃。
作为一种优选方案，步骤四所述改良MS培养基中总蔗糖为2.5%(W/V)。
研究表明，随着PEG浓度的增加，胁迫时间的延长，下胚轴相对含水量降低，细胞膜相对透性增大,脯氨酸和丙二醛（MDA）积累增加，可溶性糖先升后降，可溶性蛋白含量先降后升，高浓度的PEG引起各项指标变幅大于低浓度PEG。因此适宜的PEG浓度能促进胚根和胚芽的生长，较高PEG浓度显著抑制其胚根和胚芽生长。
而经过若干次实验，得出在PEG6000浓度为4%(W/V)时最适宜促进牡丹下胚轴的生长。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
第一，本发明先将下胚轴在含有4%(W/V)的PEG6000的改良MS培养基上培养，PEG6000的添加可使下胚轴发生渗透胁迫，极大的促进了下胚轴的生长，在渗透胁迫的作用下培养15-25天后，转换培养基，取消PEG6000的添加，将其继代在不含PEG6000的改良MS培养基上接种14-30天，在PEG6000渗透胁迫突然解除的情况下，下胚轴可不经过愈伤组织而直接产生不定芽，略过了愈伤组织这一过程，解决了愈伤组织分化不定芽却比较困难、不定芽分化率一般比较低的问题；
第二，本发明将分化出的不定芽在含有IBA及脯氨酸、核黄素的改良MS培养基上生根，改良MS培养基中Ca2+以及微量元素Mn2+、Zn2+、Mo6+和Cu 2+的含量显著提高，在脯氨酸、核黄素的作用下实现高效快速生根，生根率达到了69.8%，实现了牡丹离体组织的快速繁殖，为牡丹快速繁殖和遗传育种、转基因等遗传操作诱导新品种奠定基础。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作详细说明，本实施例以本发明技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程。
一种牡丹离体再生组培方法，包括以下步骤：
步骤一、将牡丹种子灭菌后取其成熟胚，接种在1/2MS培养基上培养；本发明所述MS培养基为现有技术，在此不做赘述；
步骤二、待成熟胚萌发后取其幼嫩的下胚轴，剪切成0.4-0.6cm长，接种在含有4%(W/V)的PEG6000并附加了1.5 - 2.5 mg/L 6-BA、0.2 - 0.5 mg/L IBA和3%(W/V)蔗糖的改良MS培养基上培养15-25天，至下胚轴切口处膨大；
步骤三、将切口处膨大的下胚轴继代在附加了1.5 - 2.5 mg/L 6-BA和0.2 - 0.5 mg/L IBA的改良MS培养基上接种14-30天，至下胚轴膨大的切口处直接分化出牡丹不定芽；
步骤四、待牡丹不定芽长至3-4cm时，将牡丹不定芽从根部切下，并接种在附加了0.2 mg/LNAA、0.2 mg/L IBA、50-100mg/L脯氨酸和0.1-3mg/L核黄素的改良MS培养基上生根，即完成牡丹离体再生。
作为一种优选方案，其中，步骤四中的改良MS培养基替换为1/2改良MS培养基。
作为一种优选方案，步骤二、步骤三和步骤四中采用的改良MS培养基的配方为：Ca2+浓度是MS培养基中Ca2+浓度的两倍， Mn2+、Zn2+、Mo6+和Cu 2+的浓度分别为MS培养基中Mn2+、Zn2+、Mo6+和Cu 2+浓度的1-12倍。
作为一种优选方案，步骤三中改良MS培养基的培养温度为22±2℃，牡丹不定芽的分化频率为35%。
作为一种优选方案，步骤四培养过程采用16小时光照和8小时黑暗处理，光照强度为2000lx，生根培养温度为25±2℃。
作为一种优选方案，步骤四所述改良MS培养基中总蔗糖为2.5%(W/V)。
实施例1
步骤一、将牡丹种子灭菌后取其成熟胚，接种在1/2MS培养基上培养；
步骤二、待成熟胚萌发后取其幼嫩的下胚轴，剪切成0.4cm长，接种在含有4%(W/V)的PEG6000并附加了1.5 mg/L 6-BA、0.2mg/L IBA和3%(W/V)蔗糖的改良MS培养基上培养15天，至下胚轴切口处膨大；
步骤三、将切口处膨大的下胚轴继代在附加了1.5 mg/L 6-BA和0.2 mg/L IBA的改良MS培养基上接种14天，至下胚轴膨大的切口处直接分化出牡丹不定芽；
步骤四、待牡丹不定芽长至3cm时，将牡丹不定芽从根部切下，并接种在附加了0.2 mg/LNAA、0.2 mg/L IBA、50mg/L脯氨酸和0.1mg/L核黄素的改良MS培养基上生根，即完成牡丹离体再生。
作为一种优选方案，步骤二、步骤三和步骤四中采用的改良MS培养基的配方为：Ca2+浓度是MS培养基中Ca2+浓度的两倍， Mn2+浓度增加为原来的3倍，Zn2+、Mo6+和Cu 2+的浓度分别为MS培养基中Zn2+、Mo6+和Cu 2+浓度的1.2倍。
作为一种优选方案，步骤三中改良MS培养基的培养温度为20℃，牡丹不定芽的分化频率为35%。
作为一种优选方案，步骤四培养过程采用16小时光照和8小时黑暗处理，光照强度为2000lx，生根培养温度为23℃。
实施例2
步骤一、将牡丹种子灭菌后取其成熟胚，接种在1/2MS培养基上培养；
步骤二、待成熟胚萌发后取其幼嫩的下胚轴，剪切成0.6cm长，接种在含有4%(W/V)的PEG6000并附加了2.5 mg/L 6-BA、0.5 mg/L IBA和3%(W/V)蔗糖的改良MS培养基上培养25天，至下胚轴切口处膨大；
步骤三、将切口处膨大的下胚轴继代在附加了2.5 mg/L 6-BA和0.5 mg/L IBA的改良MS培养基上接种30天，至下胚轴膨大的切口处直接分化出牡丹不定芽；
步骤四、待牡丹不定芽长至4cm时，将牡丹不定芽从根部切下，并接种在附加了0.2 mg/LNAA、0.2 mg/L IBA、100mg/L脯氨酸和3mg/L核黄素的1/2改良MS培养基上生根，即完成牡丹离体再生。
作为一种优选方案，步骤二、步骤三和步骤四中采用的改良MS培养基的配方为：Ca2+浓度是MS培养基中Ca2+浓度的两倍， Mn2+、Zn2+和Cu 2+的浓度分别为MS培养基中Mn2+、Zn2+和Cu 2+浓度的1.5倍， Mo6+浓度为MS培养基中Mo6+浓度的8倍。
作为一种优选方案，步骤三中改良MS培养基的培养温度为24℃，牡丹不定芽的分化频率为35%。
作为一种优选方案，步骤四培养过程采用16小时光照和8小时黑暗处理，光照强度为2000lx，生根培养温度为27℃。
实施例3
步骤一、将牡丹种子灭菌后取其成熟胚，接种在1/2MS培养基上培养；
步骤二、待成熟胚萌发后取其幼嫩的下胚轴，剪切成0.5cm长，接种在含有4%(W/V)的PEG6000并附加了2 mg/L 6-BA、0.35mg/L IBA和3%(W/V)蔗糖的改良MS培养基上培养20天，至下胚轴切口处膨大；
步骤三、将切口处膨大的下胚轴继代在附加了2 mg/L 6-BA和0.35 mg/L IBA的改良MS培养基上接种22天，至下胚轴膨大的切口处直接分化出牡丹不定芽；
步骤四、待牡丹不定芽长至3.5cm时，将牡丹不定芽从根部切下，并接种在附加了0.2 mg/LNAA、0.2 mg/L IBA、75mg/L脯氨酸和1.4mg/L核黄素的改良MS培养基上生根，即完成牡丹离体再生。
作为一种优选方案，步骤二、步骤三和步骤四中采用的改良MS培养基的配方为：Ca2+浓度是MS培养基中Ca2+浓度的两倍，Zn2+和Cu 2+的浓度分别为MS培养基中Zn2+和Cu 2+浓度的2.5倍，Mn2+和Mo6+的浓度分别为MS培养基中Mn2+和Mo6+浓度的6倍。
作为一种优选方案，步骤三中改良MS培养基的培养温度为22℃，牡丹不定芽的分化频率为35%。
作为一种优选方案，步骤四培养过程采用16小时光照和8小时黑暗处理，光照强度为2000lx，生根培养温度为25℃。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例描述如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述所述技术内容作出的些许更动或修饰均为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。