一种菜豆高效离体再生体系的建立方法与流程

本发明属于作物培育领域，具体涉及一种菜豆高效离体再生体系的建立方法。

背景技术：

菜豆(Phaseolus vulgaris Linn.)，又称芸豆(俗称二季豆或四季豆)，豆科菜豆属，一年生、缠绕或近直立草本。以食用嫩荚为主，是我国大量种植的豆科作物之一。芸豆原产美洲的墨西哥和阿根廷，我国在16世纪末才开始引种栽培。其色泽嫩绿、肉荚肥厚、味道鲜美、营养丰富，蛋白质含量高，每100克菜豆含蛋白质3～6克，是一种重要的植物蛋白质来源。

传统菜豆栽培种的产量很低，病虫害严重，由于菜豆各种病害的生理小种变异丰富，使得育种工作十分艰难。长期以来，菜豆品种改良大多采用常规育种技术。由于菜豆常规育种存在生长周期长、选育难度大、表现性状后代遗传不稳定等问题。因此在菜豆遗传育种过程中，采用各种生物技术手段进行种质创新，选育出高品质、高产量的抗逆抗病新品种已成为各方菜豆育种研究的焦点。自第一个转基因植物问世以来，植物基因工程技术迅速发展，一些天然的抗虫基因被成功的转入一些作物中。因此，提高菜豆产量、增强抗病性和耐储性最有效的途径就是通过基因工程将抗性基因从其它材料中转入菜豆栽培品种，对其进行遗传改良。

建立高效的再生体系，对于菜豆的育种而言至关重要。不过，高效的再生体系的建立却十分困难，原因之一在于不同基因型的菜豆所适用的再生体系差异较大，且没有确切的规律可循。如研究“Regeneration in Phaseolus vulgaris L.:Promotive role of N6-benzylaminopurine in cultures from juvenile leaves”发现，对于kinghorn菜豆，利用其幼叶叶柄作为外植体，并以加入5μmol/L BAP的MSB5培养基的作为诱导培养基可以诱导愈伤组织；而对于Xan-159菜豆，利用MS+TDZ 0.1mg/L+0.05mg/L IAA和MS+TDZ 0.5mg/L+0.25mg/L IAA对子叶进行诱导才能获得较好的诱导效果(“Plantregeneration from embryo-derived callus in Phaseolus vulgaris L.(common bean)and P.acutifolius A.Gray(tepary bean)”)；而对于双青35号菜豆，利用茎段为外植体，利用MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 2.0mg/L进行诱导才获得较好效果(《菜豆(双青35号)再生体系的建立》)；对于哈菜豆1号而言，0.75mg/L IBA和0.02mg/L BA的1/2MS培养基进行生根诱导，可获得84.3％的效率；中国专利CN 104472352 A公布了一种适合于双丰3号的再生体系，其体系也显著的区别于其它基因型菜豆的再生体系。

从上述内容不难发现，对于不同基因型菜豆而言，适合的再生体系的获得没有特定的规律可循，其受基因型、外植体选择和各个阶段培养方式的选择(包括培养基)等因素的影响。这使得菜豆的再生体系的建立面临着不小困难。

技术实现要素：

针对现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种适合于“超级九粒白”菜豆的高效离体再生体系的建立方法，该方法包括如下步骤：

(1)切取菜豆子叶节置于诱导培养基中培养，培养时间为5-9天；所述诱导培养基为添加了浓度为1.5～2.0mg/L 6BA的MS培养基；

(2)切除主腋芽后，用与步骤(1)相同的培养基进行继代培养，培养时间为18-23天；

(3)将步骤(2)所得物置于伸长培养基中，培养时间为5-9天；所述伸长培养基为添加了浓度为0.3mg/L KT的B5培养基；

(4)将步骤(3)所得外植体芽置于生根培养基中，培养时间为12-16天；所述生根培养基为添加了浓度为1.0mg/L IBA的MSB5培养基。

如本发明的实施例和对比实施例所示，基因型、外植体、激素以及培养基的选择对于菜豆的再生体系的建立而言，影响重大，且没有十分明确的规律可循，这与此前的相关报道结论一致。经过大量的实验，本发明找到了适于超级九粒白菜豆的高效离体再生体系，可为后续的科研和生产提供可靠的支撑。

所述菜豆的获取方法为：将灭菌后的种子置于MS培养基中培养，诱发形成无菌苗。

步骤(1)-步骤(4)所述培养条件为：22-28℃、65-75％湿度、1800-2200lx光照强度及14-18小时/天的光照周期。

本领域技术人员应当理解，一般的培养温度、湿度、光照情况和培养时间均适合本发明，本发明的主要贡献在于找到了适合“超级九粒白”再生体系的激素种类、用量及培养基类型。

优选的，步骤(1)-步骤(4)所述培养条件为：25℃、70％湿度、2000lx光照强度及16小时/天的光照周期。

优选的，步骤(1)中，6BA的浓度为2.0mg/L。优选的，步骤(1)中的培养时间为7天。

优选的，步骤(2)中的培养时间为21天。优选的，步骤(3)中的培养时间为7天。

优选的，步骤(4)中的培养时间为14天。

本发明的有益效果：

本发明对于“超级九粒白”菜豆具有较高的诱导率、伸长率和诱导根数，可实现其高效再生体系的建立。

附图说明

图1为本发明所用的无菌苗；

图2为本发明所用的子叶节；

图3为本发明不定芽诱导结果图；

图4为本发明不定芽伸长结果图；

图5为本发明不定根诱导结果图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

1.1实验材料

选取饱满新鲜的种子，用75％酒精中消毒1min，然后用无菌水冲洗3次后备用。用0.1％HgCl₂灭菌5min，完成后用无菌水冲洗5次，取出置于无菌滤纸上吸干种子表面水分，接种于含MS培养基中，诱发形成无菌苗。切取菜豆子叶节部分，接种于诱导培养基中。

1.2实验方法

把子叶节外植体分别接种芽诱导培养基，培养一周后切去主腋芽，再转瓶到含有相同成分的培养基内继代培养，共培养3周，每隔1周观察外植体芽的诱导情况，并记录各处理外植体的芽诱导率及芽的数量。继而将诱导出的芽接种于芽的伸长培养基中，培养1周后，测定各外植体芽的长度；将伸长后的外植体芽接种于生根培养基中培养2周后，记录芽根的诱导率、不定根数量与长度。

1.3培养条件

培养温度25℃，相对湿度保持在70％左右，光照强度2000lx，光周期16h/d。

2.结果与分析

2.1不定芽诱导

将子叶节分别接种在MS、MSB5、B5+6-BA(0 0.3 0.5 0.7 1.0 1.3 1.5 1.7 2.0 2.3 2.5)和MS、MSB5、B5+6-BA/IBA(0/0.2 0.3/0.2 0.5/0.2 0.7/0.2 1.0/0.2 1.3/0.2 1.5/0.2 1.7/0.2 2.0/0.2 2.3/0.2 2.5/0.2)以及MS+TDZ(0 0.3 0.5 0.7 1.0 1.3 1.5)和MS+TDZ/IBA(0/0.2 0.3/0.2 0.5/0.2 0.7/0.2 1.0/0.2 1.3/0.2 1.5/0.2)两类培养基上各60块，进行诱导培养。结果发现：即使在不添加任何激素的培养基上也能诱导出不定芽，随着激素浓度的升高不定芽诱导率随之增加，MS和MSB5培养基6-BA浓度超过2.0mg/L、B5培养基超过0.7mg/L时诱导率降低；当TDZ浓度超过0.7mg/L时，褐化严重，且6-BA诱导不定芽效果好于TDZ；MS培养基最适激素浓度为MS+6BA1.5mg/L～2.0mg/L.不定芽诱导率为100％，平均芽数3.94；MSB5培养基最适激素浓度为MSB5+6-BA/IBA(1.5/0.2～2.0/0.2)，诱导率为94％，平均芽数为3.66；B5培养基最适激素浓度为B5+6-BA(0.5～0.7mg/L)，诱导率为59％，平均芽数为2.88.综合三种培养基以及两种激素配比，不定芽诱导最佳培养基为MS+6-BA1.5～2.0mg/L。

表1子叶节在不同培养基上最适浓度诱导情况

注：不定芽诱导率(％)＝诱导出芽的外植体数/接种的外植体总数×100％；

不定芽平均诱导芽数(％)＝诱导的不定芽总数/诱导出芽的外植体数×100％

2.2不定芽的伸长培养

将诱导出的不定芽转入MS、MSB5、B5+KT(0 0.1 0.3 0.5 0.7 1.0 1.3 1.5)三类培养基各60块，进行不定芽的伸长培养。结果表明：在不添加任何激素的培养基上不定芽均能伸长；随着KT的增高诱导效果越好，但高浓度的KT(1.0mg/L)反而会抑制不定芽的伸长；三种培养基不定芽伸长最适激素浓度均为加0.3mg/LKT.其不定芽平均伸长分别为4.24、3.9、4.35cm；其中诱导效果最好的为B5+KT0.3mg/L。

表2不定芽在不同培养基上最适伸长浓度诱导情况

注：不定芽伸长率(％)＝伸长的不定芽数/接种的不定芽总数×100％；

2.3生根诱导

将伸长后的不定芽转入MS、MSB5、B5+KT(0 0.1 0.3 0.5 0.7 1.0 1.3 1.5)三类培养基各60块，进行根的诱导。每个不定芽不定根的数量在1～8条之间不等，长度在1.76～7.43cm，且各处理不定根的诱导率均为100％，但当IBA为1.0mg/L时效果最佳；三种培养基添加IBA最佳激素浓度分别为1.0、1.0、0.7～1.0mg/L。综合三种培养基最佳培养基和激素浓度为MSB5+IBA1.0mg/L。平均诱导根数为11.51，平均根长为7.43。

表3不定芽在不同培养基上最适伸长浓度诱导情况

注：平均根数＝诱导出的总根数/总接种芽数。

对比实施例1

取超级九粒白、超宽赛冠王、美国加州王四季豆3个不同基因型菜豆5d龄幼苗子叶节为外植体，分别接种在MS+6-BA2.0mg/L培养基内，每个处理接种10瓶，每瓶6个外植体.每隔7d继代培养一次，继代培养2～3次后统计各基因型菜豆诱导情况，研究不同基因型菜豆不定芽诱导率的差异。从表4可明显看出超级九粒白诱导率和平均芽数明显高于超宽赛冠王和美国加州王四季豆，且超级九粒白长势最为健壮。

表4不同基因型在最佳芽诱导培养基上诱导情况

对比实施例2

切取超级九粒白菜豆幼苗茎部、真叶以及子叶作为外植体置于MS+6-BA2.0mg/L培养基内，培养条件与实施例1以子叶节为外植体时一致，子叶和真叶切成0.5cm×0.5cm的方块，茎段切成0.5cm×0.8cm的小段；真叶、子叶及茎段外植体在各种培养基上均不能诱导出不定芽，仅能诱导出愈伤组织。真叶外植体在培养1周后即可发现大多数褐化死亡，仅有少数外植体在边缘有愈伤组织的死亡，愈伤组织为黄色，诱导的愈伤组织在继代培养中极易褐化死亡；茎段外植体在培养2～4d后，其接触培养基的基部开始膨大并开始愈伤组织的诱导，愈伤组织为绿色且结构疏松，但在进一步的继代中不能形成不定芽，3周后逐渐褐化死亡；子叶外植体在培养3～5d后，子叶由黄白色转为绿色，并在近轴端有少量的愈伤组织形成，3周后子叶褐化死亡。