一种快速创制转基因玉米双单倍体纯合后代的方法与流程

本发明涉及植物生物技术领域，尤其涉及一种快速创制转基因玉米双单倍体纯合后代的方法。

背景技术：

玉米(Zea mays)是重要的粮食和饲料作物，在我国玉米种植面积已升至为第一位、单产和总产保持第二位，仅次于水稻(李少昆，2010)。同时由于玉米也是进行遗传研究的良好材料随着世界经济的发展，物质生活水平的提高，人们对玉米的需求趋势呈刚性增长。利用杂种优势、选育优良玉米杂交种的基础和关键选育优良玉米自交系。传统选育优良自交系是根据育种目标选用优异种质资源组配基础材料后连续自交5～6代以上，性状稳定后进行配合力测定,再根据杂种优势模式组配杂交组合。玉米单倍体是指具有配子体染色体数目的植物体,采用玉米单倍体育种技术可在一定程度上克服传统育种方法存在的不足。利用单倍体研究进行育种可以缩短产生纯合品系的时间。

目前普遍使用的玉米单倍体诱导系Stock6是Ed Coe(1950)发现的,该系自交后代中可产生约2.52％的单倍体植株。后又经过两次回交和两次自交导入了控制子粒性状和植株性状(紫色叶片、茎秆、雄穗和花药)的显性标记基因，90％个体的显性色素基因已达纯合,基因型为ABPICR-njy,它具有两个标记性状：子粒有斑纹、成株叶片和叶鞘呈紫色，均是由互补基因控制。表现型是果穗子粒为白色硬粒型，子粒顶端有紫色斑块和紫色胚芽，植株具有深紫色的叶片、茎秆、雄穗和花药,具有三重性状标记。Stock6诱导产生单倍体的原理已经清楚，双授精过程中一个精子与极核结合，而另一个精子不能与卵结合形成授精卵。在育种实践中用作父本被诱导的育种试材作母本，大约有3％的单倍体胚。Stock6具有杂交诱导母本雌配子体形成高频率单倍体的能力,符合单倍体育种的基本要求,从而使玉米单倍体育种变为一种现实的育种方法。但是在实际应用中发现Stock6存在许多缺陷,如花粉量很少或者不散粉、自交结实性很差、穗粒腐病严重、子粒Navajo遗传标记表达较弱。

国外通过杂交改良的方法已经从Stock6中衍生出了一些新的诱导系,如法国的SW14、俄罗斯的Krasnodar Markers和摩尔多瓦的ZMS等。这些新的诱导系不但适应当地的生态环境,而且诱导率有了进一步的提高。因此利用价值已经大大超出Stock6。

我国利用单倍体诱导系选育自交系的研究开展较晚,单倍体育种体系都是以改良Stock6为主,选育的单倍体诱导系较少。中国农业大学刘志增(1998)用高油玉米群体BHO和Stock6杂交,经多代自交和测交选育出农大高诱1号单倍体诱导系,其诱导率可高达5.8％。2007年吉林省农业科学院的才卓等从Stodk6与M278的杂交后代中连续6代测交和选择,育成了高频率单倍体诱导系吉高诱系3号,对20个没基因型材料的单倍体诱导结果表明,其单倍体诱导率介于5.50％～15.94％,平均为10.40％。

在使用单倍体诱导系选系程序中,单倍体个体必须加倍成为二倍体才能产生可育后代。单倍体的加倍频率直接关系到单倍体育种的效率。人们对诱导单倍体进行了大量研究,并取得了一定成绩。据Chase报道,单倍体的自然加倍频率为10％左右；Zabirova等和Shatskaya的资料显示,许多材料的单倍体自然加倍率低于5％，有些材料不发生自然加倍。诱导产生的单倍体植株自然加倍率很低,需经过人工加倍才能得到更多的DH系,以满足育种需要。早在1952年Chase曾提出用秋水仙素溶液注射幼苗的盾片节进行加倍,Gayen在1994年使用浸种法,使加倍率达到了18％。尽管如此,到目前为止玉米单倍体的化学加倍率仍比较低。为此需要探索更为有效的加倍方法，提高加倍率，以期为玉米单倍体人工加倍提供一种有效方法。

玉米的遗传转化效率较低，一般低于5％，且具有较强基因型依赖性，再生频率较高、宜于诱导II型胚性愈伤组织的是玉米杂交种HiII。公认的玉米遗传转化方法为农杆菌侵染HiII的幼胚，经过诱导愈伤组织、分化出再生植株。之后将转基因的HiII后代与普通玉米自交系杂交后回交6-8代，自交2-3代，将目标基因转入普通玉米自交系中，试验周期长，耗时费力。利用单倍体诱导技术，对转基因的HiII后代与普通玉米自交系杂交的F1代进行单倍体诱导进而加倍成纯合二倍体，可大大加速基因型纯合的速度。

技术实现要素：

本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种快速创制转基因玉米双单倍体纯合后代的方法。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

本发明包括：

试验材料：玉米单倍体诱导系东诱1号、L7和JY3，为东北农业大学农学院玉米课题组选育，具有R-nj标记；用于创建单倍体的F1杂交种，其母本为转玉米精氨酸酶ZmARG基因玉米HiII的T2代株系，父本为合344；上述常规玉米材料公众可从东北农业大学农学院玉米课题组获得；

试验方法：

材料的种植：采用随机区组设计，3次重复，双行区，行长5m，株距30cm，行宽70cm，每行17株；两地田间管理标准一致，同普通玉米生产田；5米行长，株距30cm，行距70cm；杂交种一次播种，时间为当年4月29日，诱导系分3期播种，时间分别为当年4月29日，5月7日和5月11日；

授粉：用诱导系给F1杂交种授粉，挂牌记录授粉时间，每个诱导系至少授10株；

组织培养的试验流程：

培养基：

(1)筛选培养基：MS液体培养基+100uM ABA；

(2)加倍培养基：MS液体培养基+2mg/L天冬酰胺+1mg/L BAP+0.05％的秋水仙素；

(3)生长培养基：MS固体培养基；

操作方法：

(A)幼穗的消毒

分别在授粉后18d，20d取幼穗，剥去苞叶，在75％乙醇中灭菌8min，0.1％HgCl₂消毒6min，无菌水冲洗3次；

(B)幼胚的剥取：

取幼胚，盾片朝下置于培养皿中用筛选培养基浸润的无菌滤纸上，28℃，16h光照/8小时黑暗，培养24h；

(C)单倍体幼胚的加倍：

挑选出盾片无色素沉着的单倍体幼胚，盾片朝上接种到培养皿中用加倍培养基浸润的无菌滤纸上，26℃黑暗培养24h；

(D)幼胚培养：

将幼胚转移至生长培养瓶中，盾片向下，26℃暗培养1周，之后26℃光培养2-3周直至根发育完全；每瓶接种15个左右；

(E)移栽：

将小苗移栽至土壤基质中，温室内培养，根据叶鞘颜色鉴别单倍体植株，直至成熟，严格自交，收获种子；

(F)双单倍体的PCR检测：

采用CTAB小量法提取玉米幼苗叶片的总DNA；由于ZmARG基因为玉米内源基因，根据启动子Ubi序列和目的基因序列设计引物，引物ARG-F位于启动子Ubi序列内部，引物ARG-R位于目的基因序列内部，产物大小为775bp；筛选标记基因为抗除草剂草甘膦基因，产物大小为522bp；引物序列如下：

ARG-F:5’-CGCCCTTCTTTGGTGAT-3’

ARG-R:5’-CCCTGCCTTCATACGCT-3’

PCR反应程序为，94℃5min，94℃30s，60℃30s，72℃1min，72℃8min，32个循环；1％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物；

数据统计方法:

单倍体的诱导率＝单倍体幼胚数/接种幼胚数*100％；加倍率＝结实株数/再生苗数*100％；采用Excel 2010对试验数据进行初步整理，使用统计分析软件SPSS Statistics 17.0中独立样本T检验和方差分析程序进一步分析。

进一步，所述步骤(E)中的叶鞘颜色鉴别单倍体植株的叶鞘颜色为绿色叶鞘。所述步骤(E)中自交时，如果散粉困难，需要用针挑破花药释放花粉。

本发明的有益效果在于：

本发明是一种快速创制转基因玉米双单倍体纯合后代的方法，与现有技术相比，本发明用玉米单倍体诱导系东诱1号为父本给转基因玉米杂交种授粉，挑取单倍体幼胚进行组织培养，利用秋水仙素给单倍体幼胚进行染色体组加倍，进而培养转基因双单倍体玉米植株，并收获转基因双单倍体种子。本发明可用于转基因玉米回交转育后代的快速纯合，也可用于玉米双单倍体群体的快速建立，进行玉米重要性状的遗传分析。

附图说明

图1玉米再生植株中目标基因ZmARG的PCR扩增结果图。

图中：M:Trans2K DNA Marker；P:阳性对照；W:空白对照；N:阴性对照；1-8:转基因植株。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步说明：

一、玉米单倍体诱导系东诱1号的生物学特性调查

试验材料：

玉米单倍体诱导系东农诱1号，对照材料为诱导系L7和JY3，均为东北农业大学农学院玉米课题组选育，具有R-nj标记。上述玉米材料公众可从东北农业大学农学院玉米课题组获得。

试验方法：

材料的种植：

试验材料种植于东北农业大学试验基地，采用随机区组设计，3次重复，3行区，行长5m，株距30cm，行宽70cm，每行17株。田间管理同普通玉米生产田。

田间调查项目和调查方法：

以全区80％达到标准作为各时期的日期，但对于田间出苗不正常植株要剔除不计。调查指标和调查标准如下。

抽雄期：植株雄穗尖端露出顶叶3～5cm；

开花期：植株雄穗开始散粉；

抽丝期：植株雌穗的花丝从苞叶中伸出2cm左右；

播种到抽丝期的天数：是播种到抽丝期的天数；

播种到散粉期的天数：是播种到开花期的天数；

散粉持续时间：是从出现花粉到散粉结束的天数；

花粉量：植株散粉的多少；

株高：乳熟期在每小区随机选5株分别测量植株顶端至地面高度；

穗位高：乳熟期在每小区随机选5株分别测量从玉米基部(露出地面部分)到玉米最上部第一穗穗部底端(不计玉米的穂柄长度)的距离；

雄穗分枝数：每小区随机选5株分别测量雄穗雄花序的所有分支的总数；

调查结果：

田间调查结果见表1。可见玉米单倍体诱导系东农高诱1号与其它两个诱导系相比，优势十分突出，具有早熟、花粉量大、植株高度适宜、花期长等特点。适于进行玉米单倍体群体的创制和玉米单倍体育种使用。

表1玉米单倍体诱导系东农高诱1号的生物学性状调查

二、玉米单倍体诱导系东诱1号的诱导效果分析

试验材料：

玉米单倍体诱导系东诱1号，对照材料为诱导系L7和JY3，均为东北农业大学农学院玉米课题组选育，具有R-nj标记。母本材料为玉米杂交种东农254。上述玉米材料公众可从东北农业大学农学院玉米课题组获得。

试验方法：

材料的种植：

试验材料种植于东北农业大学试验基地，采用随机区组设计，3次重复，双行区，行长5m，株距30cm，行宽70cm，每行17株。两地田间管理标准一致，同普通玉米生产田。5米行长，株距30cm，行距70cm。杂交种一次播种，时间为2015年4月29日，诱导系分3期播种，时间分别为2015年4月29日，5月7日和5月11日。

授粉：

用诱导系给杂交种授粉，挂牌记录授粉时间，每个诱导系至少授10株。

单倍体种子的获得和诱导率的计算：

玉米果穗充分成熟后根据杂交籽粒胚乳颜色和胚颜色两方面的表型进行鉴别，用以区分二倍体和单倍体和杂交二倍体籽粒。紫顶紫胚子粒，白顶紫胚子粒，是正常杂交的二倍体；白顶白胚，是受花粉污染或有缺陷的子粒；紫顶白胚粒，为拟单倍体。

试验结果：

试验结果见表2。由表中可见，3个玉米诱导系共授粉了34株玉米植株，将收获的果穗单穗脱粒后，根据籽粒胚和胚乳的颜色，挑选其中紫顶白胚乳的籽粒为单倍体籽粒。其中东诱1号单倍体诱导率最高达到11.7％，显著高于其他两个诱导系。

表2不同单倍体诱导系诱导效果的比较

注：*表示在0.05水平上差异显著

三、利用玉米单倍体诱导系创造转基因玉米纯合后代株系

1、包括

试验材料：玉米单倍体诱导系东诱1号、L7和JY3，为东北农业大学农学院玉米课题组选育，具有R-nj标记；用于创建单倍体的F1杂交种，其母本为转玉米精氨酸酶ZmARG基因玉米HiII的T2代株系，父本为合344；上述常规玉米材料公众可从东北农业大学农学院玉米课题组获得；

试验方法：

材料的种植：采用随机区组设计，3次重复，双行区，行长5m，株距30cm，行宽70cm，每行17株；两地田间管理标准一致，同普通玉米生产田；5米行长，株距30cm，行距70cm；杂交种一次播种，时间为当年4月29日，诱导系分3期播种，时间分别为当年4月29日，5月7日和5月11日；

授粉：用诱导系给F1杂交种授粉，挂牌记录授粉时间，每个诱导系至少授10株；

组织培养的试验流程：

培养基：

(1)筛选培养基：MS液体培养基+100uM ABA；

(2)加倍培养基：MS液体培养基+2mg/L天冬酰胺+1mg/L BAP+0.05％的秋水仙素；

(3)生长培养基：MS固体培养基；

操作方法：

(A)幼穗的消毒

分别在授粉后18d，20d取幼穗，剥去苞叶，在75％乙醇中灭菌8min，0.1％HgCl₂消毒6min，无菌水冲洗3次；

(B)幼胚的剥取：

取幼胚，盾片朝下置于培养皿中用筛选培养基浸润的无菌滤纸上，28℃，16h光照/8小时黑暗，培养24h；

(C)单倍体幼胚的加倍：

挑选出盾片无色素沉着的单倍体幼胚，盾片朝上接种到培养皿中用加倍培养基浸润的无菌滤纸上，26℃黑暗培养24h；

(D)幼胚培养：

将幼胚转移至生长培养瓶中，盾片向下，26℃暗培养1周，之后26℃光培养2-3周直至根发育完全；每瓶接种15个左右；

(E)移栽：

将小苗移栽至土壤基质中，温室内培养，根据叶鞘颜色鉴别单倍体植株，直至成熟，严格自交，收获种子；

(F)双单倍体的PCR检测：

采用CTAB小量法提取玉米幼苗叶片的总DNA；由于ZmARG基因为玉米内源基因，根据启动子Ubi序列和目的基因序列设计引物，引物ARG-F位于启动子Ubi序列内部，引物ARG-R位于目的基因序列内部，产物大小为775bp；筛选标记基因为抗除草剂草甘膦基因，产物大小为522bp；引物序列如下：

ARG-F:5’-CGCCCTTCTTTGGTGAT-3’

ARG-R:5’-CCCTGCCTTCATACGCT-3’

PCR反应程序为，94℃5min，94℃30s，60℃30s，72℃1min，72℃8min，32个循环；1％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物；

数据统计方法:

单倍体的诱导率＝单倍体幼胚数/接种幼胚数*100％；加倍率＝结实株数/再生苗数*100％；采用Excel 2010对试验数据进行初步整理，使用统计分析软件SPSS Statistics 17.0中独立样本T检验和方差分析程序进一步分析。

具体的，所述步骤(E)中的叶鞘颜色鉴别单倍体植株的叶鞘颜色为绿色叶鞘。所述步骤(E)中自交时，如果散粉困难，需要用针挑破花药释放花粉。

试验结果：

双单倍体诱导结果：

挑取转基因F1代杂交种的幼胚，根据颜色挑选其中的单倍体幼胚加倍处理，通过组织培养方法获得再生二倍体植株。结果见表3。

表3组织培养法不同单倍体诱导系诱导的结果

目标基因PCR检测结果：

以上述获得的转ZmARG基因玉米后代再生苗为材料，用CTAB小量法提取叶片总DNA。以质粒DNA为阳性对照，以ddH₂O为空白对照，以非转基因玉米种子DNA为阴性对照，对目的基因ZmARG进行PCR检测。PCR结果显示，191株再生苗中有160株扩增出775bp的ZmARG基因特异片段，其扩增条带位置与质粒DNA阳性对照相符，阴性对照和空白对照未扩增出条带，见图1，初步采用组织培养辅助单倍体诱导方法获得转ZmARG基因回交转育后代。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。