一种玉米耐盐基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种玉米耐盐基因ZmHKTl;lb及其应用。
【背景技术】
[0002] 盐胁迫是影响作物生长发育和产量的主要非生物胁迫因素之一。据统计，在全世 界范围内，大约有4. 5亿公顷的可耕作土地正在遭受着不同程度的盐渍化，而且由于全球 气候的不断变化以及不合理的施肥灌溉等原因，土壤盐渍化的范围也将不断扩大，这将严 重地制约我国的经济和社会的发展。因此，除了利用一些传统的手段和方法来改善土壤外， 培育耐盐农作物新品种已成为当务之急。由于植物耐盐性状自身的复杂性，使得采用传统 的育种方法很难获得具有耐盐特性的优良品种。随着生物技术的发展，通过导入外源基因 来提高农作物的耐盐性已成为现代作物育种的主要潮流。
[0003] 利用基因工程技术将具有优良性状的基因转入植物，以此来开发高效的转基因作 物新品种是一项具有广阔应用前景的技术。就目前的研宄情况而言，利用转基因技术在提 高作物耐盐性方面已经取得了较大的进展，已有的部分研宄表明，将耐盐基因过表达或者 转入其它生物中，其异源转录产物和翻译产物可以提高转基因植物的耐盐性。
[0004] HKT转运蛋白是一类非常重要的蛋白质，根据其第一个孔环结构（poredomain， PD)氨基酸组成的不同主要将其分成两大类，不同类型的HKT转运蛋白在功能上具有显著 的差异。近年来，有关小麦、水稻、拟南芥等植物的fflT转运蛋白在植物耐盐过程中发挥的 作用已经被先后报道，但是关于玉米中的HKT转运蛋白在植物耐盐过程中的作用的研宄尚 未见报道。
[0005] 因此，有必要对与玉米HKT转运蛋白的编码蛋白进行分离，从而为后期利用玉米 KHT转运蛋白对植物进行定向改造奠定基础。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种能够在植物中稳定高效表达玉米HKT转运蛋白的玉 米耐盐基因及重组载体和应用。
[0007] 为了实现本发明的目的，本发明首先提供一种编码玉米HKT转运蛋白的基因 ZmHKTl;lb，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO: 1所示。
[0008] 本发明的发明人在对玉米的耐盐机制进行研宄的过程中，对玉米进行盐胁迫处理 后提取玉米叶片总RNA后反转录得到了如SEQIDN0:1所示的DNA序列。
[0009] 具体的，所述基因ZmHKTl;lb是按照以下方式获得的：
[0010] 将生长10天的玉米B73幼苗从蛭石：营养土比例为1:1的花盆中取出，并洗掉玉 米根部的蛭石。然后将幼苗根部浸入浓度为250mmol/LNaCl溶液中通气培养，取盐胁迫处 理lh后的玉米叶片为材料，进行RNA的提取等后续试验。
[0011] 以盐胁迫处理后的玉米B73叶片为材料，提取叶片总RNA后反转录成cDNA，以 cDNA为模板，分别在其5'UTR和3'UTR设计In-fusion引物进行PCR反应，上游引物 为：ZmHKTl;lb-infusion-F(SEQIDNO:3)，下游引物为ZmHKTl;lb-infusion-R:(SEQ IDN0:4)。50yL反应体系：5XTransStartFastPfuBuffer10yL，TransStartFastPfu DNAPolymerase1yL，2. 5mMdNTPs5yL，ZmHKTl;lb-infusion-F1.5yL，ZmHKTl; lb-infusion-R1.5yL，cDNA2yL，ddH20 29yL。反应程序：95°C预变性 5min，然后 95°C解 链30sec，56°C退火30sec，72°C延伸45sec，反应32个循环，72°C延伸7min。将PCR产物切 胶回收后用凝胶回收试剂盒（AXYGEN)回收纯化获得SEQIDNO: 1所示的核苷酸序列。
[0012] 本发明还提供了一种玉米HKT转运蛋白，其特征在于：由SEQIDNO: 2所示的氨基 酸序列组成。
[0013] 应当理解的是，本领域技术人员可以根据SEQIDNO:2所示的氨基酸序列在不影 响其活性的条件下，对该序列进行取代、缺失或插入一个或几个氨基酸以获得具有同等活 性的蛋白质。
[0014]本发明还提供了所述基因的重组表达载体，其中，所述重组表达载体为pCAMBIA3301-ZmHKTl；lb〇
[0015] 本发明还提供了含有所述基因的工程菌，包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基 因，所述目的基因的核苷酸序列如SEQIDNO: 1所示。
[0016] 可选的，所述基因工程菌内含有重组载体pCAMBIA3301-ZmHKTl;lb的核苷酸片 段，
[0017] 本发明还提供了玉米HKT转运蛋白的编码基因ZmHKTl;lb在转化植物中的应用。
[0018] 进一步地，所述植物包括玉米、烟草、水稻、棉花、大豆、高粱。优选的，当所述植物 为烟草时，能够取得最好的提高耐盐能力的效果。
[0019] 进一步地，所述应用是在烟草内转化所述基因ZmHKTl;lb，从而使得玉米表达具 有SEQIDNO:2所不的氣基酸序列的蛋白，提尚烟草的耐盐能力。
[0020] 本发明所获得的有益效果在于：提供了一种能够在植物中稳定高效表达玉米HKT 转运蛋白的基因ZmHKTl;lb及重组载体，本发明所提供的基因ZmHKTl;lb可以应用于提高 转基因作物的耐盐能力。
【附图说明】
[0021] 图1为植物重组表达载体pCAMBIA3301-ZmHKTl;lb片段图谱
[0022] 其中ZmHKTl;lb代表玉米HKT转运蛋白的编码基因。
[0023] 图2为ZmHKTl;lb转基因烟草植株T2代的PCR鉴定
[0024]M，D2000Maker;1，H20;2,野生型烟草；3和4,分别为2-3、2-8转基因株系。扩增 产物大小为942bp。
[0025] 图3为ZmHKTl;lb转基因烟草植株T2代的RT-PCR分析
[0026]M，D2000Maker;1，H20;2,野生型烟草；3和4,分别为2-3、2-8转基因株系。目的 基因ZmHKTl;lb的扩增产物大小均为259bp，参照基因Actin的扩增产物大小为106bp。
[0027] 图4为T2代ZmHKTl;lb转基因烟草幼苗在不同浓度NaCl处理后的生长状况
[0028]I表示在OmMNaCl处理下转基因株系与野生型烟草的生长状况，II表示在200mM NaCl处理下转基因株系与野生型烟草的生长状况，III在300mMNaCl处理下转基因株系与 野生型烟草的生长状况。其中2-3和2-8是转基因株系。
[0029] 图5为盐胁迫对T2代ZmHKTl;lb转基因烟草幼苗鲜重的影响
[0030] 横坐标代表不同的烟草株系，纵坐标代表烟草幼苗的鲜重（FW)。200表示在200mM NaCl处理下转基因株系与野生型烟草幼苗的鲜重变化情况，300表示在300mMNaCl处理下 转基因株系与野生型烟草幼苗的鲜重变化情况。WT代表野生型烟草幼苗，2-3和2-8是转 基因幼苗。**表示有极显著差异（P〈〇. 01)。
[0031] 图6为盐胁迫对T2代ZmHKTl;lb转基因烟草幼苗主根长的影响
[0032] 横坐标代表不同的烟草株系，纵坐标代表烟草幼苗的主根长（MRL)。200表示在 200mMNaCl处理下转基因株系与野生型烟草幼苗的鲜重变化情况，300表示在300mMNaCl 处理下转基因株系与野生型烟草幼苗的鲜重变化情况。WT代表野生型烟草幼苗，2-3和2-8 是转基因幼苗。**表示有极显著差异（P〈〇. 01)。
【具体实施方式】
[0033] 下面将通过【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
[0034] 实施例1玉米HKT转运蛋白的编码基因ZmHKTl;lb的获得以及植物表达载体 pCAMBIA3301-ZmHKTl;lb的构建。
[0035] 将生长10天的玉米B73幼苗从蛭石：营养土为1:1的花盆中取出，并洗掉玉米根 部的蛭石。然后将幼苗根部浸入浓度为250mmol/LNaCl溶液中通气培养，取处理lh后的玉 米叶片为材料，进行RNA的提取等后续试验。
[0036] 以盐胁迫处理后的玉米B73叶片为材料，按照北京全式金生物技术有限公司 生产的RNA提取试剂盒EasyPure?PlantRNAKit的说明书提取叶片总RNA，按照北京 全式金生物技术有限公司提供的RNA反转录试剂盒TransScriptllFirst-StandcDNA SynthesisSuperMix的说明书，取1yg总RNA反转录成cDNA，以cDNA为模板，分别在其 5'UTR和 3'UTR设计In-fusion引物进行PCR反应，上游引物为：ZmHKTl;lb-infusion-F: (SEQIDN0:3)，下游引物为ZmHKTl;lb-infusion-R:(SEQIDN0:4)。50yL反应体 系：5XTransStartFastPfuBuffer10yL,TransStartFastPfuDNAPolymerase1yL， 2. 5mMdNTPs5yL，ZmHKTl;lb-infusion-F1. 5yL，ZmHKTl;lb-infusion-R1. 5yL，cDNA 2yL，ddH20 29yL〇
[0037] PCR反应程序：95°C预变性5min，然后95°C解链30sec，56°C退火30sec，72°C延伸 45sec，反应32个循环，72°C延伸7min。将PCR产物用凝胶回收试剂盒（AXYGEN)回收纯化。
[0038] 提取植物表达载体pCAMBIA3301质粒DNA并用Ncol和BstEII双酶切，20yL酶切 体系为：10父册811打6^.121^，叱〇111^，88七￡1111^，质粒0嫩41^，(1(11120 12 1^，37。〇 水浴酶切lh后，60°C水浴酶切lh。将pCAMBIA3301线性化质粒大片段用凝胶回收试剂盒 (AXYGEN)回收纯化。然后将上述PCR产物与pCAMBIA3301酶切纯化产物进行In-fusion HD 反应，5yL反应体系：5X In-fusion HD Enzyme premix lyL，PCR产物2 yL，pCAMBIA3301 酶切纯化产物2 y L，50°C水浴反应20min，然后取2. 5 y L反应产物转化Trans5 a感受态细 胞，提取阳性质粒，获得如图1所示结构的植物重组表达载体pCAMBIA3301-ZmHKTl ;lb，进 行酶切电泳检测和测序验证，获得如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。
[0039] 实施例2农杆菌EHA105介导叶盘法转化烟草
[0040]制备农杆菌感受态，并将含ZmHKTl ;lb基因的植物表达载体 pCAMBIA3301-ZmHKTl;lb转化农杆菌感受态，详细过程如下：从含有50yg/mL利福平的YEB平板上挑取EHA105单克隆，接种于50ml含50yg/mL利福平的YEB液体培养基中， 200rpm，28°C培养至OD值为0