专利名称：制备转tgev-s基因玉米的方法
技术领域：
本发明涉及制备转TGEV-S基因玉米的方法。
背景技术：
猪传染性胃肠炎(Transmissible Gastroenteritis,TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible Gastroenteritis Virus, TGEV)引起的，该病是以呕吐、严重腹 写、脱水和对2周龄以内仔猪高度致死性为特征的高度接触性传染病，不同品种和年龄的猪均易感。TGE主要危害新生仔猪，随着日龄的增大，该病的死亡率逐渐下降，16日龄以上仔猪的死亡率为10%左右。5周龄以上仔猪死亡率更低，成年猪几乎没有死亡，但往往会造成生产性能下降，饲料报酬率降·低，经济损失较大。猪传染性胃肠炎病毒S蛋白(TGEV S蛋白)形成病毒粒子表面的突起，携带主要的B淋巴细胞抗原决定族，是唯一能诱导产生中和抗体和提供免疫保护作用的结构蛋白。TGEV S抗原分为A，B，C和D共4个抗原位点，有研究成果证明这四个抗原位点均位于S蛋白N端的543个氨基酸残基之内。随着植物基因工程技术的发展，利用转基因植物作为生物反应器生产动物或人基因工程疫苗应用在疾病的预防及治疗方面已成为植物基因工程的一个新兴研究领域。和细菌、酵母及哺乳动物细胞等传统疫苗生产系统相比较而言，用转基因植物作为生物反应器生产基因工程疫苗具有以下几个方面的优势:①植物细胞具有全能性，能够再生植株且易于成活植物细胞完整的真核细胞表达系统使表达产物具有较好的免疫原性及生物活性；③植物细胞壁、细胞膜和细胞器的天然生物胶囊作用能避免抗原蛋白在消化道中被降解，有效地诱导肠胃黏膜免疫反应，同时又能起到一定的缓释作用，这使得植物疫苗口服给药比经注射给药效果更明显。④口服植物疫苗能诱导粘膜免疫反应。以上这些优点使转基因植物口服疫苗适合应用于通过提高体液免疫特别是肠道免疫水平来预防病原的感染。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种在植物中表达TGEV S蛋白的方法。本发明所提供的在植物中表达TGEV S蛋白的方法，包括如下步骤:将TGEV S蛋白的编码基因导入出发植物，得到表达所述TGEV S蛋白的转基因植物。上述方法中，所述出发植物为玉米。上述方法中，所述编码基因为如下I)或2)或3)或4)所示:I)其核苷酸序列是SEQ ID NO:2中自5'末端第1-2208位核苷酸所示DNA分子；2)其核苷酸序列是SEQ ID NO: 2所示DNA分子；3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；4)与I)或2)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。上述方法中，所述编码基因是通过如下所述的重组表达载体导入的。上述方法中，所述TGEV S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明的另一个目的是提供一种用于制备转基因玉米的重组表达载体。本发明所提供的重组表达载体，按照如下方法制备:用SacI和EcoRI双酶切载体PBI221，回收农杆菌胭脂碱合成酶基因N0S3'末端终止子片段，再将其插入载体pSP72的SacI和EcoRI位点间，得到重组载体，计作pBPC18 ；将E35S启动子插入pBPC18的HindIII和XbaI位点，得到中间重组载体I ;将Hsp70 intronl用BglII和BamHI酶切后插入所述中间重组载体I的BamHI位点,得到重组载体，计作PBAC154 ；将所述TGEV S蛋白的编码基因插入载体PBAC154的BamHI和SacI位点，得到重组载体，计作PBAC175 ；用HindIII和BamHI酶切质粒pBARGUS，回收含有CaMV 35S启动子和玉米Adhl内含子的目的片段，再将其插入到PSP72的HindIII和BamHI位点，得到中间重组载体2 ;将编码抗除草剂草甘膦的玉米EPSP基因插入中间重组载体2的BamHI和EcoRI位点，获得重组载体，计作PSHK49 ；将pSHK49用EcoRI酶切后补成平端，引入含HindII位点的适配子序列，计作PSHK49H3 ;所述适配子序列具体为CCCAAGCTTGGG ；用HindII酶切pSHK49H3，回收含有CaMV 35S启动子和玉米Adhl内含子和EPSP基因的片段，将其插入到PBAC175的HindIIII位点，得到目的重组表达载体。上述重组载体中，农杆菌胭脂碱合成酶基因N0S3'末端终止子(0.26kb)序列如Genbank ACCESSION AF502128，从 2778-3030 位；E35S 启动子(Enhanced CaMV 35S)序列如Seq ID:N0.3 ；Hsp70 intronl序列如Seq ID:N0.4 ;编码抗除草剂草甘膦的玉米EPSP基因的序列如GenBank Accession Number X63374.1自5’末端第I至1335核昔酸序列。
本发明的另一个目的是提供一种预防猪传染性胃肠炎的产品。本发明所提供的预防猪传染性胃肠炎的产品，其活性成分为上述任一所述方法制备得到的转基因植物的组织或器官。所述组织或器官为叶片。上述任一所述方法制备得到的转基因植物的组织或器官在制备预防猪传染性胃肠炎的产品中的应用也属于本发明的保护范围。上述应用中，所述组织或器官为叶片。本发明实现了 TGEV S蛋白在植物中的表达。具体是通过构建表达载体PBAC176将猪传染性胃肠炎病毒保护性抗原基因(TGEV-S)导入玉米基因组中。从分子水平对转基因植株进行了分析，初步表明目的基因TGEV-S已导入转基因玉米的基因组中，并确认TGEV-S基因在7个Tl代转基因玉米中获得了稳定整合与表达。本发明将TGEV S蛋白编码基因导入玉米基因组中，在玉米中表达TGEV-S，为口服疫苗的研制和开发奠定基础。
图1为载体pBAC176的结构图。图2为转TGEV-S基因玉米植株的诱导、分化与田间移栽。A诱导，B筛选，C分化，D壮苗，E移栽。图3为转基因Ttl代玉米植株外源TGEV-S基因片段的PCR检测结果。M=Trans2Kplus marker ；0:空白对照；-:非转基因玉米对照；+:阳性质粒对照;1_30:T0代玉米植株。图4为转基因Ttl代玉米植株外源TGEV-S基因片段的PCR-Southern检测结果。+:阳性质粒pBAC176(PCR产物千倍稀释后);0:空白；-:阴性对照；其它为转基因玉米TO代植株。图5为转基因T1代玉米植株外源TGEV-S基因片段的PCR检测结果。M=Trans2Kplus marker ；0:空白对照；-:非转基因玉米对照；+:阳性质粒对照；1_30:T1代玉米植株。图6为转基因T1代玉米植株外源TGEV-S蛋白间接ELISA分析。检测阳性的样本用方框标出。图7为阻断ELISA检测小鼠血清TGEV特异性抗体检测OD值倒数柱状图。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。PCR反应试剂Ex Taq DNA聚合酶、dNTPsUOXPCR缓冲液、氨卞青霉素、卡那霉素和各种限制性内切酶等购自大连宝生物公司。pGEM-T Easy Vector Kit、大肠杆菌ToplO、MarkerII1、质粒小量提取试剂盒、高纯度质粒提取试剂盒和琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒等购自天根生化公司。地高辛(DIG)标记与检测试剂盒和化学发光检测试剂盒购自RocheDiagnostics GmbH公司； 其他普通生化试剂购自Sigma公司、Promega公司或国产。基因枪型号:PDS-1000/He (BioRad)，基因枪转化所用的金粉购自BioRad公司。质粒pBARGUS 在文献“Vasil，V.，et al, Bio/technology, 10(6):667_674，1992”中公开过。玉米自交系501在文献“杨东歌，杨凤萍，陈绪清，张立全，张晓东.外源脱水应答转录因子CBF4基因转化玉米的获得.作物学报，2009，35 (10):1759_1763”中公开过。实施例1、基因的制备及验证利用PCR方法，从TGEV-S重组质粒病毒克隆出TGEV-S基因。重组质粒TS (含TGEV的S基因N端2.2kb片段与pMD18_T质粒载体连接而得)由北京市农林科学院畜牧兽医研究所张莉老师提供；利用上游引物(TGEVS-F，5'-GGA TCCATG AM MA CTA TTT GTG G-3')和下游引物(TGEVS-R，5'-GAG CTC ATT ATA CAT CAC ATGGCG TTA CAG-3')，从重组质粒TS中利用PCR克隆出S基因，并上海英骏生物技术有限公司进行测序。反应体系:10XPCR Buffer 2.5 μ L，上下游引物各I μ L，dNTP (2.5mM) 2 μ L，模板 0.5 μ L，Ex Taq DNA 聚合酶 0.5 μ L，ddH20 17.5 μ L，总体积 25 μ L。反应程序如下:95°C预变性5min ;94°C变性Imin ;57°C退火1.5min ;72°C延伸1.5min，共30个循环；72°C最后延伸IOrnin0将获得的片段连接到pGEM-T，获得阳性重组质粒定名为pT_TGEVS，测序鉴定，结果:获得的突变基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQID NO:1 所示。也可人工合成SEQ ID NO:2所示DNA，再利用本领域常规手段将人工合成后的DNA连入 pGEM-T，获得 pT-TGEVS。实施例2、转基因植物的制备1、重组表达载体pBAC176基础载体pSP72购自Promega，产品目录号P2191。农杆菌胭脂碱合成酶基因N0S3 ^末端终止子(0.26kb)序列由pBI221 (GenbankACCESSION AF502128,从 2778-3030 位)用 SacI 和EcoRI 双酶切回收，插入pSP72 (Promega)的SacI和EcoRI位点，用蓝白斑筛选法获得质粒pBPC18(2.7kb)。E35S 启动子(Enhanced CaMV 35S)(Seq ID:N0.3)和 Hsp70 intronl (SeqID:N0.4)均为人工合成序列，由上海生工公司合成。E35S启动子用Hindlll/Xbal酶切插入pBPC18的HindII I/Xbal位点，得到中间重组载体；Hsp70 intronl用BglII/BamHI酶切插入中间重组载体的BamHI位点，所得筛选插入分析正确的重组质粒，定名为pBAC154(4237bp)。重组质粒pT-TGEVS用BamHI和SacI双酶切，回收2.2kb的TGEV-S基因，插入中间载体PBAC154 (4.2kb片段)的BamHI和SacI位点，获得的重组表达载体定名为pBAC175。该重组表达载体PBAC175中含有E35S-HSP70 intronl-TGEVS_N0S3’的表达序列区段。将质粒pBARGUS用HindIII和BamHI酶切，回收1.0kb片段，该片段含CaMV 35S启动子(0.45kb) +玉米Adhl内含子(0.55kb)序列，插入到pSP72的HindIII和BamHI位点，得到中间重组载体；然后将编码抗除草剂草甘膦的玉米EPSP基因插入到中间重组载体的 BamHI 和 EcoRI 位点获得重组质粒 pSHK49。EPSP 基因含有 GenBank Accession NumberX63374.1自5’末端第I至1335核苷酸序列。pSHK49用EcoRI位点酶切后补成平端，引入含HindIII位点的适配子(adaptor)CCCAAGCTTGGG 序列，命名为 pSHK49H3。用HindIII 酶切 pSHK49H3，回收 2.3kb 的 35S+intron+EPSP 序列片段，插入到pBAC175的HindIIII位点，选择正向插入的阳性质粒。获得最终的TGEV-S表达载体PBAC176。其结构图见图1。图1中，组成型启动子:35S和E35S;内含子:Adhl Intron和HSP70 Intronl (即HSP70的第一个内含子)；草甘膦筛选标记基因:EPSP ；目的基因:TGEV-S ;终止子:N0S3’ ；氨苄基因:Amp。表达载体pBAC176以EPSP基因作为选择标记，其目的基因TGEV-S以增强型启动子E35S为驱动。2、转化取授粉后IOd左右的玉米优良自交系501的果穗，用75%乙醇表面消毒后挑取其幼胚接种到诱导培养基(N6基本培养基+1Omgr1AgNO3+1OOmgL—1肌醇+21^1^2，^D+SOgL—1蔗糖+TgL—1琼脂)上，25°C暗培养3 5d后诱导出胚性愈伤组织。将纯化好的PBAC176载体调整浓度为Iygy ΙΛ按文献“Zhang X-D(张晓东)，Li D-M(李冬梅)，Xu W_Y(徐文英)，Jiang Y-Y (蒋有择)，Hu D-F (胡道芬)，Han L-X (韩立新).Development of TransgenicWheat by biolistic Bomb ardment Transferring Basta Resistance Gene and NovelHMW Glutenin Subumit Genes.Acta Agriculturae Boreall-Sinica(华北农学报)，1997,12(1): 133-136 (in Chinese) ”中所述方法进行基因枪微弹的制备，PDS-1000/He型基因枪轰击胚性愈伤组织，5d后将愈伤组织转移到含有草甘膦的筛选培养基(诱导培养基中加入Smgr1草甘膦)上筛选20d左右。然后选取生长正常的愈伤组织转移到分化培养基(N6基本培养基 +0.Smgr1AgNO3+1OOmgr1 肌醇 +1.SmgL^KT+SOgr1 蔗糖 +TgL—1 琼脂 +lmgL—1 草甘膦)上分化，分化的幼苗在壮苗培养基(1/2MS基本培养基+Zmgr1多效唑+lOOmgL—1肌醇+0.SmgL^NAA+SOgL.1蔗糖+TgL—1琼脂)培养后移栽到实验田。得到的植物为Ttl代植株，如图2，A:玉米幼胚诱导培养基上诱导愈伤组织；B:愈伤在筛选培养基上筛选；C:分化；D:壮苗;E:移栽。3、Ttl代转基因植株验证(I) PCR 验证以Ttl代转基因植株的叶片基因组DNA为模板，用弓I物对TGEV651-F/TGEV1625-R进行PCR扩增。非转基因植株为阴性对照，PBAC176为阳性对照，水为空白对照。上游引物为TGEV651-F:5’ -CGCTGGCACGCTTGTAGACCTTTGG-3’ ；下游引物为TGEV1625-R:5’ -CCATAACCACTACGCTTCATAC-3’ ；反应体系为见表I。反应条件:95°C预变性5min ;94°C变性lmin，57°C复性40sec，72°C延伸lmin，共30个循环；最后72°C延伸lOmin。PCR产物加入适量的上样缓冲液在0.8%琼脂糖凝胶电泳中进行检测。表1、反应体系中各种成分及体积
权利要求
1.一种在植物中表达TGEV S蛋白的方法，包括如下步骤:将TGEV S蛋白的编码基因导入出发植物，得到表达所述TGEV S蛋白的转基因植物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述出发植物为玉米。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述编码基因为如下I)或2)或3)或4)所示: 1)其核苷酸序列是SEQID NO:2中自5'末端第1-2208位核苷酸所示DNA分子； 2)其核苷酸序列是 SEQID NO: 2所示DNA分子； 3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子； 4)与I)或2)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于:所述编码基因是通过权利要求5所述的重组表达载体导入的。
5.一种重组表达载体，按照如下方法制备: 用SacI和EcoRI双酶切载体pBI221，回收农杆菌胭脂碱合成酶基因N0S3'末端终止子片段，再将其插入载体PSP72的SacI和EcoRI位点间，得到重组载体，计作pBPC18 ； 将E35S启动子插入pBPC18的HindIII和XbaI位点，得到中间重组载体I ;将Hsp70intronl用BglII和BamHI酶切后插入所述中间重组载体I的BamHI位点,得到重组载体，计作 pBAC154 ； 将所述TGEV S蛋白的编码基因插入载体pBAC154的BamHI和SacI位点，得到重组载体，计作PBAC175 ； 用HindIII和BamHI酶切质粒pBARGUS，回收含有CaMV 35S启动子和玉米Adhl内含子的目的片段，再将其插入到PSP72的HindIII和BamHI位点，得到中间重组载体2 ;将编码抗除草剂草甘膦的玉米EPSP基因插入中间重组载体2的BamHI和EcoRI位点，获得重组载体，计作pSHK49 ； 将pSHK49用EcoRI酶切后补成平端，引入含HindIII位点的适配子序列，计作PSHK49H3 ； 用HindIII酶切pSHK49H3，回收含有CaMV 35S启动子和玉米Adhl内含子和EPSP基因的片段，将其插入到PBAC175的HindIIII位点，得到目的重组表达载体。
6.一种预防猪传染性胃肠炎的产品，其活性成分为权利要求1-4中任一所述方法制备得到的转基因植物的组织或器官。
7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于:所述组织或器官为叶片。
8.权利要求1-4中任一所述方法制备得到的转基因植物的组织或器官在制备预防猪传染性胃肠炎的产品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于:所述组织或器官为叶片。
全文摘要
本发明公开了制备转TGEV-S基因玉米的方法。本发明提供的在植物中表达TGEV S蛋白的方法，包括如下步骤将TGEV S蛋白的编码基因导入出发植物，得到表达所述TGEV S蛋白的转基因植物。本发明实现了TGEV S蛋白在植物中的表达。本发明将TGEVS蛋白编码基因导入玉米基因组中，在玉米中表达TGEV-S，为口服疫苗的研制和开发奠定基础。
文档编号A61P31/14GK103114105SQ20111036533
公开日2013年5月22日 申请日期2011年11月17日 优先权日2011年11月17日
发明者王金洛, 张晓东, 杨兵, 曾作财, 许承杨 申请人:北京市农林科学院