一种中药组合物的新用途的制作方法

专利名称：一种中药组合物的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种中药组合物的新用途，特别涉及在治疗感染性疾病的新用途。
背景技术：
炎症反应和免疫功能的紊乱在感染性疾病的发生、发展过程中起着关键的作用， 多重耐药菌感染亦不例外。其与非耐药菌感染在感染后出现的炎症反应和免疫功能的紊乱是一致的，只是因为针对多重耐药菌的治疗不如非耐药菌有效，不能及时有效地清除多重耐药菌这一感染因素，也就意味着不能在短时间内调整其引发的炎症反应和免疫功能的紊乱，从而导致多重耐药菌感染迁延难愈，预后较差。多肽阵列技术能用多肽模拟蛋白抗原与自身抗体结合，被认为是后基因组时代与基因芯片、蛋白芯片相媲美的新型蛋白位点检测技术。现已被广泛应用于抗体研究、基因表达分析、发现新基因、疾病诊断及药物筛选等领域，应用前景广阔。目前国内该技术较多用于癌症研究，如肿瘤患者自身抗体的早期监测，抗体识别抗原表位的研究等，如应用多肽芯片研究非小细胞肺癌患者血清中的EGFR自身抗体；另有应用抗体芯片来鉴定肾组织中的异常表达蛋白，进行慢性肾病的早期诊断和治疗监测等。目前在细菌感染的中医中药干预的基础研究中，尚未检索到相关应用。目前现有技术没有公开本发明组合物用于治疗多重耐药菌感染所致炎症反应和免疫功能紊乱。

发明内容
本发明的目的在于提供一种中药组合物在制备抗感染药、提高免疫功能药物中的应用。本发明的目的是通过如下技术方案实现的本发明提供一种中药组合物在制备抗感染药物中应用；本发明提供一种中药组合物在制备抗感染和/或治疗炎症和/或提高免疫药物中应用；所述中药组合物由如下原料药制成生黄芪30-120重量份当归5-20重量份金银花10-25重量份青蒿 10-30重量份虎杖 5-20重量份。上述中药组合物优选由如下原料药制成生黄芪40-110重量份当归6-19重量份金银花12-23重量份青蒿12- 重量份虎杖 5-20重量份。上述中药组合物优选由如下原料药制成生黄芪55-95重量份当归8-15重量份金银花12-22重量份青蒿13-25重量份
虎杖 5-20重量份。上述中药组合物优选由如下原料药制成生黄芪85重量份当归15重量份金银花18重量份青蒿22重量份虎杖 10重量份。上述中药组合物优选由如下原料药制成生黄芪55重量份当归19重量份金银花M重量份青蒿15重量份虎杖 6重量份。上述中药组合物优选由如下原料药制成生黄芪 110重量份当归8重量份金银花15重量份青蒿观重量份虎杖 18重量份。上述应用，其中的感染为铜绿假单胞菌所致；所述铜绿假单胞菌为CGMCC No. 5317。上述中药组合物加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床上可接受的水煎剂、胶囊剂、片剂、丸剂、口服液体制剂、注射剂、散剂等各种剂型。所述常规工艺方法包括水提取或醇提取或先水提取再醇提取或先醇提取后再水提取；经上述常规提取后还可以过大孔树脂柱进一步富集有效成分。为使上述剂型能够实现，需在制备这些剂型时加入药学可接受的辅料，例如填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂包括硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等；甜味剂包括糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括甜味剂及各种香精；防腐剂包括尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、 苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；基质包括PEG6000，PEG4000，虫蜡等。为使上述剂型能够实现中药药剂学，需在制备这些剂型时加入药学可接受的其它辅料(范碧亭《中药药剂学》，上海科学出版社1997年12月第1版中各剂型记载的辅料)。本发明组合物扶正透邪方能降低腹腔感染大鼠的死亡率、调节感染后大鼠炎症和免疫紊乱的作用。菌株保藏信息本发明所述多重耐药铜绿假单胞菌临床分离株1643号的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏日期2011年10月10日；编号CGMCC No. 5317 ；分类命名 铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa。
具体实施方式
实验例1.材料与仪器1. 1干预药物1. 1. 1扶正透邪方提取物按照实施例1的方法制备。低浓度0. 5g/ml、中浓度 0.99g/ml、高浓度1.98g/ml。本实验所设大鼠扶正透邪方小剂量药量相当于70kg成人用量的2. 15倍，中剂量相当于70kg成人用量的6. 3倍，大剂量药量相当于70kg成人用量的 12. 6 倍。1. 1. 2注射用头孢他啶深圳致君制药有限公司产品批号E20100102。1. 1. 3注射用头孢哌酮舒巴坦钠辉瑞制药有限公司产品批号1039098。1. 1. 4注射用亚胺培南西司他丁钠Merck&Co.，Inc. USA产品批号100231。1.2实验动物SD大鼠，雌雄各半，清洁级，体重200 220g，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，合格证号SCXK-(军)2007-004。
类命名
司。

司。司。
司。
实验菌株多重耐药铜绿假单胞菌临床分离株1643号，编号CGMCC No. 5317 ；分 :111^11 Ifilii Pseudomonas aeruginosa,,
3主要试剂与仪器
3. IM-H琼脂平板XW01100301赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司。
3. 2RPMI-1640 培养基=Sigma0
3. 3刀豆蛋白A :Sigma。
3. 4 脂多糖Sigma。
3. 5MTT :Sigma。
3. 6小牛血清民海生物公司。
3. 7磷酸盐缓冲液(PBS)粉末鼎国生物技术有限公司。 3. 8Tris 上海化学试剂厂。 3. 9NH4C1 北京红星化工厂。 3. 10 0. 01NH4C1-10% SDS :GIBC0o
3. 11 Rat IL-I β ELISA试剂盒96t ZABFBZAA01上海依科赛生物制品有限公
3.12Rat IL-2ELISA试剂盒96t ZJBFBZAZ03上海依科赛生物制品有限公司。
3.13Rat IL-4ELISA试剂盒96t ZCAABZAA03上海依科赛生物制品有限公司。
3.14Rat IL-10ELISA试剂盒96t ZLBGBZAZ02上海依科赛生物制品有限公
1. 3. 15 Rat IFN- y ELISA试剂盒96t ZCCZBZAA02上海依科赛生物制品有限公 1. 3. 16 Rat TNF- α ELISA试剂盒96t ZDBZBZAA02上海依科赛生物制品有限公
1. 3. 17比浊管。
1. 3. 18 微量移液器:GILS0N P 0. 1-1. 0ml。
1. 3. 19电子称SC0UT SC6010梅特勒.托利多常州衡器有限公司,
1. 3. 20电子微量天平JA3003上海越平科学仪器有限公司。
5
1. 3. 21 体温计MC140 0MR0N。1. 3. 22立式自动电热压力蒸汽灭菌器AMA440N ATELL。1. 3. 23 电热恒温培养箱:DNP9162 JINGHONG。1. 3. 24 涡混合器V0RTEX_2 GENIE。1. 3. 25微量搅拌器75-2型上海医用分析仪厂。1. 3. 26 低温高速离心机Labofuge 400R Kendro。1. 3. 27超净工作台北京碧都。1. 3. 28 酶标分析仪DNM-9602 PROLONG。1. 3. 29全波长多功能酶标仪S印ctraMR MRff DYNEX1. 3. 30 全自动血细胞分析仪LH 750 ANALYZER BECKMANCOULTER。1.3.31 特种蛋白分析仪BN ProSpec SIEMENS。1. 3. 32 AutoSpot peptide synthesizer ；FX-7 ^ ψS^WMfi Χ,1. 3. 33 PEG 修饰纤维素膜，Fmoc-氨基酸，DCM，aminefreeDMF, 乙酉享，Acetic anhydride, Acetic anhydride, DIPEA(Diisopropylamine), DIC(Diisopropylcarbodiimide), BromophenolbIue, Piperidine 等。1. 4试剂配制1.5.1 10%水合氯醛溶液的配制水合氯醛 IOg加入蒸馏水 IOOml1. 5. 2 Tris-NH4Cl 溶液的配制Tris 溶液(0. 17mol/L) IOmlNH4Cl 溶液(0. 16mol/L) 90ml1. 6菌悬液的制备将实验菌株接种于M-H琼脂培养基活化，经37°C恒温培养18 24h后，用生理盐水洗脱菌落，离心，3000rpm，20min，弃去上清，加入生理盐水，混勻后吸出0. 5ml加入新的无菌试管中，加入适量生理盐水，与比浊计进行比浊，将菌液稀释成M X 108CFU/ml，用酶标仪检测OD值为0. 675 士0. 005，再将其稀释成0. 48X 108CFU/ml，作为实验菌悬液。2实验方法2. 1动物模型SD大鼠常规饲养一周，室温控制在18°C 22°C之间，自由获取食、水，采血前禁食过夜。按照杨钧，张淑文，阴赪宏，等.耐药菌腹腔感染兔动物模型的建立[J].中华医院感染学杂志，2008，18 (9) :1129-1222报道的方法建立多重耐药铜绿假单胞菌腹腔感染大鼠模型。具体方法如下常规饲养，将多重耐药铜绿假单胞菌菌液(以下简称菌液)同 2.0%西黄芪胶1 1混合后，腹腔注射。注射后自由进食、饮水。对照组腹腔注射等体积的2.0%西黄芪胶。2. 2动物分组与处理2. 2. 1死亡率保护实验SD大鼠88只，雌雄各半，随机分对照组、模型组、扶正透邪方小剂量组、扶正透邪方中剂量组、扶正透邪方大剂量组(即B0、Bi、B2、B3、B4)，共5组，BO组8只，其余4组每组各20只。BO组腹腔注射西黄芪胶后(8ml/kg)，即给予0. 9%生理盐水灌胃^il,每日一次。Bl组腹腔注射菌液后(8ml/kg)，即给予0.9%生理盐水灌胃anl，每日一次。B2、B3、B4 组腹腔注射菌液后(8ml/kg)，分别给予扶正透邪方提取物0. 5g/ml、0. 99g/ml、l. 98g/ml灌胃，每次anl，每日一次。以上各组分别于腹腔注射后6小时统计一次死亡率，其后每M小时统计一次死亡率，第5天为终末观察点。筛选出扶正透邪方最佳给药量为9. 9g/kg/天。SD大鼠96只，雌雄各半，随机分模型组、西药对照组、扶正透邪方最佳剂量组、中西医结合治疗组(即(1、02、03、(4)，共4组，每组各对只。Cl组腹腔注射菌液后(8ml/ kg)，即给予0.9%生理盐水灌胃anl，每日一次。C2组腹腔注射菌液后(8ml/kg)，即给予头孢他啶，肌肉注射，0.45g/kg/次，每日两次。C3组腹腔注射菌液后(8ml/kg)，即给予扶正透邪方提取物(0.99g/ml)灌胃，每次anl，每日一次。C4组腹腔注射菌液后(8ml/kg)，即给予扶正透邪方提取物(0.99g/ml)灌胃，每次anl，每日一次，同时予头孢他啶，肌肉注射， 0. 45g/kg/次，每日两次。以上各组分别于腹腔注射后6小时统计一次死亡率，其后每M小时统计一次死亡率，第5天为终末观察点。2. 2. 2指标检测实验SD大鼠200只，雌雄各半，随机分为空白组、模型组、西药对照组、扶正透邪方最佳剂量组、中西医结合治疗组(即D1、D2、D3、D4)，共5组，每组各40只。对照组腹腔注射等体积的2.0%西黄芪胶后(5ml/kg)，即给予0.9%生理盐水灌胃，每次anl，每日一次。D1、 D2、D3、D4组腹腔注射菌液均为5ml/kg，其余处理方法与死亡率观察实验相同。以上各组按时间点又分为腹腔注射后:3h、8h、ld、3d和5d组，每组各8只，各组按分组所示相应时间点， 留取血及组织标本。ld、3d和5d组于留取血及组织标本前测量肛温。雄性SD大鼠36只，随机分为空白组、模型组、扶正透邪方最佳剂量组，共3组，每组各12只。模型组腹腔注射腹腔注射菌液后(5ml/kg)，即给予0.9%生理盐水灌胃，每次 anl，每日一次。扶正透邪方最佳剂量组腹腔注射菌液后(5ml/kg)，即给予扶正透邪方提取物(0.99g/ml)灌胃，每次anl，每日一次。7d后留取以上各组大鼠血清标本，_20°C保存，供多肽阵列检测使用。2. 3标本的采集与处理2. 3. 1 血标本予腹腔注射10%水合氯醛溶液，4g/kg，麻醉后，常规消毒大鼠腹部皮肤，打开腹腔，分离腹主动脉，予一次性无菌采血针分别接anl EDTA-K3采血管和5ml空白采血管，进行取血。采血完毕后，EDTA-K3采血管送检血常规，空白采血管室温放置Ih后，再4°C放置 Ih,离心，2500rpm, 20min,分离血清，分装后_70°C保存。2. 3. 2组织标本无菌留取肺、小肠组织放入4%甲醛固定液，进行切片、组织形态学观察。2. 4检测指标与方法2. 4. 1大鼠血清IL-I β的ELISA检测1.准备工作
(1)提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温。( 将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1 20)。C3)标准品加入试剂稀释液0.5ml至冻干标准品中，静置15分钟，待其充分溶解后，轻轻混勻(浓度为2000pg/ml)。然后根据2000、1000、500、250、125、62.5、 31.25、0pg/ml浓度进行稀释。(4)生物素化抗体工作液使用前30分钟用试剂稀释液稀释浓缩生物素化抗体(1 100)配置成生物素化抗体工作液。( 酶结合物工作液使用前 30分钟用试剂稀释液稀释浓缩酶结合物(1 100)配置成酶结合物工作液，室温避光放置。2.洗涤方法用自动洗板机，注入350μ 1洗涤液，注入与吸出间隔20-30秒。洗板4次。3.操作步骤(1)从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条。(2)留空白孔。(3)先按标准品稀释方法加好标准品(100 μ 1/孔)，0pg/ml孔加试剂稀释液(Assay Diluent) 100 μ 1 ； 在每个样本孔中加入50 μ 1试剂稀释液(Assay Diluent)和50 μ 1样本(此时样本已做了 1 2倍稀释，计算结果时样本含量要乘以2)；随后在样本和标准孔中加入50 μ 1生物素化抗体工作液，用封板胶纸封住反应孔。(4)室温O0-25°C )，使用微量振荡仪(最低频率， IOOrpm)，孵育120分钟。(5)洗板5次。(6)除空白孔外，加入酶结合物工作液(100 μ 1/ 孔)，用封板胶封住反应孔。(7)室温Q0-25°C )，使用微量振荡仪(最低频率，IOOrpm)，孵育60分钟。(8)洗板5次。⑶加入显色底物(包括空白孔)100μ1/孔，室温Q2-25°C)， 避光孵育10分钟。(10)加入终止液(包括空白孔)100μ 1/孔，混勻后即刻测量0D450值 (10分钟内)。4.结果判断(1)每个标准品和标本的OD值减去零孔的OD值。(2)手工绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值在标准曲线上查出其浓度。C3)若标本OD值高于标准曲线上限，应当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。2. 4. 2大鼠血清IL-10的ELISA检测1.准备工作(1)提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温。(2)将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1 20)。C3)标准品加入试剂稀释液0.5ml至冻干标准品中，静置15分钟，待其充分溶解后，轻轻混勻(浓度为4000pg/ml)。然后根据4000、2000、1000、500、250、125、62. 5、 Opg/ml浓度进行稀释。(4)生物素化抗体工作液使用前30分钟用试剂稀释液稀释浓缩生物素化抗体(1 100)配置成生物素化抗体工作液。( 酶结合物工作液使用前30分钟用试剂稀释液稀释浓缩酶结合物(1 100)配置成酶结合物工作液，室温避光放置。2.洗涤方法用自动洗板机，注入350 μ 1洗涤液，注入与吸出间隔20-30秒。洗板4次。3.操作步骤(1)从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条。(2)留空白孔。(3)分别将标本或不同浓度标准品(Opg/ml孔加试剂稀释液)加入相应孔中(100 μ 1/孔)，用封板胶封住反应孔，37°C孵箱孵育90分钟。(4)洗板5次。( 除空白孔外，加入生物素化抗体工作液(100 μ 1/孔)。用封板胶封住反应孔，37°C孵箱孵育60分钟。(6)洗板5次。(7)除空白孔外，加入酶结合物工作液(ΙΟΟμΙ/孔)。用封板胶封住反应孔，37°C孵箱，避光孵育 30分钟。(8)洗板5次。(9)加入显色底物(包括空白孔)100μ1/孔，37°C孵箱，避光孵育 15分钟。(10)加入终止液(包括空白孔)100 μ 1/孔，混勻后即刻测量0D450值(10分钟内)。4.结果判断同大鼠血清IL-I β的ELISA检测。2. 4. 3ConA诱导的脾脏T细胞增殖能力测定采用MH法。无菌摘取大鼠脾脏(操作在冰浴中进行)，常规制备脾细胞悬液，计数脾细胞，再用含10%小牛血清的RPMI1640培养基调整细胞浓度至5X 106/mL，加至96板中，100 μ L/ 孔。分别加入含ConA完全RPMI1640溶液100 μ L/孔(ConA终浓度为5 μ g/mL)，每组设5 个复孔，并设无ConA细胞对照。将96孔板置37°C ,5%C02培养箱孵育68h，取出，每孔弃上清 100 μ L，加入 5mg/mL 的 MTTlO μ L (终浓度 0. 5mg/mL)，继续孵育 4h，加入 0. OlN HC1-10% SDS 100 μ L/孔，振荡摇勻，37°C过夜，酶标仪570nm下测定各孔A值。2. 4. 4LPS诱导的脾脏B淋巴细胞增殖能力的测定采用MTT法。无菌摘取大鼠脾脏(操作在冰浴中进行)，常规制备脾细胞悬液，计数脾细胞，再用含10%小牛血清的RPMI1640培养基调整细胞浓度至5 X 106/mL，加至96板中，100 μ L/ 孔。分别加入含LPS完全RPMI1640溶液100 μ L/孔(LPS终浓度为5 μ g/mL)，每组设5个复孔，并设无LPS细胞对照。将96孔板置37°C ,5%C02培养箱孵育68h，取出，每孔弃上清 100 μ L，加入 5mg/mL 的 MTTlO μ L(终浓度 0. 5mg/mL)，继续孵育 4h，加入 0. OlN HC1-10% SDS100 μ L/孔，振荡摇勻，37°C过夜，酶标仪570nm下测定各孔A值。2. 4. 5大鼠血清IFN- γ的ELISA检测1.准备工作(1)提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温。( 将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1 20)。C3)标准品加入试剂稀释液1.0ml至冻干标准品中，静置15分钟，待其充分溶解后，轻轻混勻(浓度为2000pg/ml)。然后根据2000、1000、500、250、125、62.5、 31.25、0pg/ml浓度进行稀释。(4)生物素化抗体工作液使用前30分钟用试剂稀释液稀释浓缩生物素化抗体(1 100)配置成生物素化抗体工作液。( 酶结合物工作液使用前 30分钟用试剂稀释液稀释浓缩酶结合物(1 100)配置成酶结合物工作液，室温避光放置。2.洗涤方法用自动洗板机，注入350 μ 1洗涤液，注入与吸出间隔20-30秒。洗板4次。3.操作步骤(1)从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条。(2)留空白孔。(3)先按标准品稀释方法加好标准品(100 μ 1/孔)，0pg/ml孔加试剂稀释液(Assay Diluent) 100 μ 1 ； 在每个样本孔中加入50 μ 1试剂稀释液(Assay Diluent)和50 μ 1样本(此时样本已做了 1 2倍稀释，计算结果时样本含量要乘以2)；随后在样本和标准孔中加入50 μ 1生物素化抗体工作液，用封板胶纸封住反应孔。(4)室温O0-25°C )，使用微量振荡仪(最低频率， IOOrpm)，孵育120分钟。(5)洗板5次。(6)除空白孔外，加入酶结合物工作液(100 μ 1/ 孔)，用封板胶封住反应孔。(7)室温Q0-25°C )，使用微量振荡仪(最低频率，IOOrpm)，孵育60分钟。(8)洗板5次。⑶加入显色底物(包括空白孔)100μ1/孔，室温Q2-25°C)， 避光孵育10分钟。(10)加入终止液(包括空白孔)100μ1/孔，混勻后即刻测量0D450值(10分钟内)。4.结果判断同大鼠血清IL-I β的ELISA检测。2. 4. 6大鼠血清IL-4的ELISA检测1.准备工作(1)提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温。( 将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1 20)。C3)标准品加入试剂稀释液1.0ml至冻干标准品中，静置15分钟，待其充分溶解后，轻轻混勻(浓度为2000pg/ml)。然后根据2000、1000、500、250、125、62.5、 31.25、0pg/ml浓度进行稀释。(4)生物素化抗体工作液使用前30分钟用试剂稀释液稀释浓缩生物素化抗体(1 100)配置成生物素化抗体工作液。( 酶结合物工作液使用前 30分钟用试剂稀释液稀释浓缩酶结合物(1 100)配置成酶结合物工作液，室温避光放置。2.洗涤方法用自动洗板机，注入350 μ 1洗涤液，注入与吸出间隔20-30秒。洗板4次。3.操作步骤(1)从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条。(2)留空白孔。(3)分别将标本或不同浓度标准品(Opg/ml孔加试剂稀释液)加入相应孔中(100 μ 1/孔)，用封板胶封住反应孔，37°C孵箱孵育90分钟。(4)洗板5次。( 除空白孔外，加入生物素化抗体工作液(100 μ 1/孔)。用封板胶封住反应孔，37°C孵箱孵育60分钟。(6)洗板5次。(7)除空白孔外，加入酶结合物工作液(ΙΟΟμΙ/孔)。用封板胶封住反应孔，37°C孵箱，避光孵育 30分钟。(8)洗板5次。(9)加入显色底物(包括空白孔)100μ1/孔，37°C孵箱，避光孵育 15分钟。(10)加入终止液(包括空白孔)100μ1/孔，混勻后即刻测量0D450值(10分钟内)。4.结果判断同大鼠血清IL-I β的ELISA检测。2. 4. 7多肽阵列检测耐药蛋白抗体1.根据铜绿假单胞菌耐药蛋白序列，选择超广谱内酰胺酶(TEMs/ESBLs) TEM(ABB76656)，用多肽阵列技术制作了 9张多肽阵列。每种蛋白有3张重复多肽阵列每张TEM(ABB76656)蛋白多肽阵列上排列93条多肽，配置0. 3M Fmoc-氨基酸溶液，封闭液 I 2% (v/v)aceticanhydride in DMF，封闭液 II :2% (v/v)acetic anhydride+2% (v/v) DIPEAin DMF，去保护溶液(20% (v/v) piperidine in DMF)。把活化的PEG-纤维素膜放置在Autospotter上，根据程序自动移液30 μ 1的Fmoc-氨基酸溶液到活化的PEG-纤维素膜上的特定位置与膜进行反应&20分钟，然后把PEG-纤维素膜按序浸入封闭液I中(反应 5分钟)和封闭液II中(反应20分钟)，进行侧链封闭，然后用DMF清洗4次，每次30秒。 然后加入去保护溶液中O次，每次5分钟)，用于移除氨基端的Fmoc保护基团；去保护之后，用DMF清洗3次，每次30秒钟，而后再用乙醇干燥。如果用于下一次的氨基酸合成，重复以上步骤，直至各个多肽全部合成。全部合成后，先用TFAcocktail去除侧链保护基团， 再用CH2C12清洗4次，而后用乙醇干燥，-20°C保存用于下一步免疫反应实验。根据实验设计，多肽自动合成仪合成多肽阵列，每张多肽阵列横向为12个多肽点，纵向为8个多肽点。 (见附

图1)2.封闭4% skim milk+5% sucrose in TBST buffer，室温 4 小时。3. 一抗孵育大鼠血清1 200稀释；与多肽阵列反应，4°C下过夜。
下 2/J、
4.洗膜用TBSTbuffer漂洗，10分钟X 3次。
5.二抗孵育二抗(羊抗鼠)IgG-HRP，用封闭液1
1000或1 2000稀释，室
时c
6.洗膜用TBSTbuffer漂洗，10分钟X 3次。
7.显色加入ECL发光试剂，数字成像。 3统计学处理方法
采用SPSS 17. 0统计软件包，参数计量资料进行t检验、方差分析，计数资料使用 χ 2检验进行统计学处理。各计量资料用平均数士标准差(x±s )来表示，检验水准为α =0. 05。4 结果4. 1不同剂量扶正透邪方治疗对腹腔感染大鼠死亡率保护的影响腹腔注射菌液后，Mi统计一次死亡率，其后每24h统计一次死亡率。对照组5天内全部存活，模型组与扶正透邪方各剂量组大鼠在后开始出现死亡，随着时间的延长，死亡率逐渐升高。他后各时间点扶正透邪方各剂量组大鼠的死亡率较模型组均有不同程度的降低。χ 2检验显示，各剂量组相应时间点组间比较，无显著差异(见表1)。表1不同剂量扶正透邪方治疗对腹腔感染大鼠死亡率保护的影响
组别
η
死亡率
6h
24h
48h
72h
96h 120h
对照组8000000模型组20065%75%80%80%85%扶正透邪方小剂量组20055%60%65%70%70%扶正透邪方中剂量组20045%50%55%55%60%扶正透邪方大剂量组20045%45%60%60%65%注与相同时间点模型组比较，*P < 0. 05，**P < 0. 014. 2不同治疗方法对腹腔感染大鼠死亡率保护的影响腹腔注射菌液后，Mi统计一次死亡率，其后每24h统计一次死亡率。各组大鼠在 6h后开始出现死亡，随着时间的延长，死亡率逐渐升高。他后各时间点各治疗组大鼠的死亡率较模型组均有不同程度的降低。X2检验显示，4a!、7a!、120h，中西医结合治疗组大鼠的死亡率较模型组降低，差异显著(P < 0. 05)，各治疗组间比较，无显著差异(见表2)。表2不同治疗方法对腹腔感染大鼠死亡率保护的影响(n = 24)
权利要求
1.一种中药组合物在制备抗感染和/或治疗炎症和/或提高免疫药物中应用，所述中药组合物由如下原料药制成生黄芪 30-120重量份当归 5-20重量份金银花 10-25重量份青蒿 10-30重量份虎杖 5-20重量份。
2.如权利要求1所述的应用，所述中药组合物由如下原料药制成 生黄芪 40-110重量份当归 6-19重量份金银花 12-23重量份青蒿 12- 重量份虎杖 5-20重量份。
3.如权利要求1所述的应用，所述中药组合物由如下原料药制成 生黄芪 55-95重量份当归 8-15重量份金银花 12-22重量份青蒿 13-25重量份虎杖 5-20重量份。
4.如权利要求1所述的应用，所述中药组合物由如下原料药制成 生黄芪 85重量份当归 15重量份金银花 18重量份青蒿 22重量份虎杖 10重量份。
5.如权利要求1所述的应用，所述中药组合物由如下原料药制成 生黄芪 55重量份当归 19重量份金银花 M重量份青蒿 15重量份虎杖 6重量份。
6.如权利要求1所述的应用，所述中药组合物由如下原料药制成 生黄芪 Iio重量份当归 8重量份金银花 15重量份青蒿 28重量份虎杖 18重量份。
7.如权利要求1所述的应用，其中的感染为铜绿假单胞菌所致。
8.如权利要求7所述的应用，其中所述铜绿假单胞菌为CGMCCNo. 5317。
9.如权利要求1所述的应用，其中该中药组合物加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床上可接受的剂型。
全文摘要
本发明公开一种中药组合物在制备抗感染和/或治疗炎症和/或提高免疫药物中应用，所述中药组合物由生黄芪、当归、金银花、青蒿、虎杖等原料药制成；本发明组合物具有明显的抗感染、炎症和调节免疫紊乱的作用。
文档编号A61K36/704GK102379931SQ20111036510
公开日2012年3月21日 申请日期2011年11月17日 优先权日2011年11月17日
发明者刘清泉, 江其敏, 马群 申请人:刘清泉