专利名称：青蒿鳖甲组合物的药物用途的制作方法
技术领域：
本发明属中药用途，涉及青蒿鳖甲组合物在制备防治非可控性炎症恶性转化过程药物中的应用。
背景技术：
近年来，多项流行病学及相关研究结果已证实，慢性炎症促进肿瘤演进，并能诱发不同种类的癌症，在人类由感染引起的炎症持续进行并发展为癌症的概率约15 20%，许多肿瘤的发生发展与炎症反应的持续进行使之处于非可控性炎症状态密切相关，如幽门螺杆菌持续感染所形成的慢性炎症与胃癌相关，乙肝病毒和丙肝病毒可致肝癌，人乳头瘤病毒可致宫颈癌。研究表明，非可控性炎症参与肿瘤启动、增殖、侵袭和转移、衰老和凋亡等各个阶段，靶向抑制炎症介质、炎症相关转录因子或炎性细胞，可以减少肿瘤发生和播散。减轻炎症反应的强度，可以降低炎症演变为癌症及癌症进一步恶化的发生率。 炎症的病理过程与花生四烯酸(arachidonic acid, AA)代谢、炎性细胞功能和自身免疫过程有关，这些过程相互关联、相互影响。通常认为花生四烯酸代谢在炎症细胞功能发挥过程中起主要作用。炎症细胞释放花生四烯酸经环氧化酶(C0X)、脂氧化酶(LOX)、细胞色素P450表氧化酶催化代谢生成具有生物活性的产物，包括前列腺素、白三烯、环氧花生四烯酸以及羟基花生四烯酸。有关研究表明，花生四烯酸的COX代谢途径和LOX代谢途径与肿瘤的发生和发展有着密切的联系，尤其是C0X-2和5-L0X在介导AA代谢与人类多种肿瘤发生之间有不可忽视的作用，早期研究主要集中在前者，在直肠癌、胃癌、前列腺癌、卵巢癌、结肠癌等多种恶性肿瘤中均过度表达C0X-2。有研究发现非留体类抗炎药(NAIDs)对结直肠癌、胃癌、食管癌、胰腺癌等多种消化道肿瘤具有一定的化学预防作用。近年来研究发现，5-脂氧合酶也与多种肿瘤的发生、发展和转移有关，在结肠癌、乳腺癌、肺癌以及前列腺癌的细胞株中均发现5-L0X表达增高。COX和LOX分别是花生四烯酸转化为前列腺素类(prostaglandins, PGs )、白三烯类(leukotrienes, LTs )代谢产物通路的一种关键酶，其中C0X-2、5-L0X为诱导型前炎性因子，通常在组织缺氧或损伤反应中由肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages, TAMs)活化产生,代谢产物PGE2和LTB4具有致炎、氧化及对肿瘤的发生、生长有促进作用，通过活化血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowth factor, VEGF)能直接刺激血管生成。VEGF是恶性肿瘤诱导血管生成的重要调控因子，促进血管内皮细胞增殖，并增加其通透性及提高黏附分子在细胞中的表达量，协助肿瘤细胞进入脉管系统而增加肿瘤发生发展的机率。因此减少炎症组织中肿瘤相关的巨噬细胞(TAMs)浸润，有效抑制C0X-2、5-L0X的生物学效应，阻断花生四烯酸代谢，减少炎性介质PGE2和LTB4的产生，干预非可控性炎症促进恶性转化，可能对肿瘤发生、发展具有重要影响。青蒿鳖甲方出自清代吴鞠通《温病条辨》。原方组成为青蒿6 g，鳖甲15 g，地黄12 g，知母6 g，牡丹皮9 g，是治疗热病后期“阴虚内热”的代表方。古人记载，方中鳖甲乃血肉有情之品，性善入阴分养阴液，且鳖为蠕动之物，入络剔邪；青蒿轻清芳香，清热透络，引邪外出。鳖甲先煎而青蒿后下，更有先入后出之妙，先入阴搜邪，后引邪出表。有配伍地黄滋阴凉血，牡丹皮、知母清泻阴分伏火，全方配伍严谨，共奏滋阴清热，透邪外出之功。现代药理学研究认为青蒿能调节免疫功能，并具有一定的降温、消炎、抑菌等作用；知母具有显著的解热、抗炎作用；丹皮也有一定的抗过敏、解热作用；生地则有明显的免疫增强作用。而鳖甲则被认为有抑制结缔组织增生，增加血浆蛋白的作用，并能提高机体的免疫力，延长抗体存在时间。我国学者在临床治疗观察中发现，青蒿鳖甲方汤剂对实体瘤和血液恶性肿瘤均有良好的退热作用和一定缓解作用。
发明内容
本发明的目的是提供青蒿鳖甲组合物在制备抗非可控性炎症预防恶性转化药物中的应用。所述青蒿鳘甲组合物由青蒿80g鳘甲胶13. 4g地黄160g知母80g牡丹皮120g组成。即作为一种减少炎症组织中肿瘤相关巨噬细胞浸润，能双重干预COX-2 / 5-L0X 生物学效应的中药复方制剂在制备抗非可控性炎症预防恶性转化药物中的应用。本发明提供的青蒿鳖甲组合物制备的药物是片剂。本发明具有以下优点
(I)本发明结合中西医理论，以炎症演变癌症及癌症进一步恶化过程为研究背景，首次发现青蒿鳖甲组合物能减少癌症组织中肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)浸润，具有双重干预COX-2 / 5-L0X生物学效应的活性。这种神奇功能明显降低炎症演变为癌症及癌症进一步恶化的发生率，将会使该古方在癌症防治中得到重要应用。(2)C0X-2 / 5-L0X及其代谢产物被视为非可控性炎症恶性转化中的一个复杂事件，涉及众多细胞因子，炎症介质及各种酶，靶点繁多，迄今尚未有合适的药物问世。本发明为青蒿鳖甲组合物应用于癌症防治，具有将中药名优方剂二次开发的重要价值。(3)本发明以古人记载为线索，以非可控性炎症恶性转化中关键节点C0X-2 /5-L0X生物学效应为理论依据，研究并阐明中药古方剂的科学内涵，是发展中医药理论新的重要方向，为发展中医药新的理论和药物作用新的靶点提供重要依据。
图1为⑶68蛋白在DMBA诱发大鼠卵巢腺癌组织中的表达(免疫组化，400X )。图2为C0X-2蛋白在DMBA诱发大鼠卵巢腺癌组织中的表达(免疫组化，400X )。图3为5-L0X蛋白在DMBA诱发大鼠卵巢腺癌组织中的表达(免疫组化，400X )。图4为VEGF蛋白在DMBA诱发大鼠卵巢腺癌组织中的表达(免疫组化，400X )。图5为Western blot检测DMBA诱发大鼠卵巢腺癌组织中C0X-2、5_L0X、VEGF蛋白表达。图6为C0X-2、VEGF蛋白在小鼠S18tl荷瘤组织中的表达(免疫组化，200X )。图7为Western blot检测小鼠S18tl荷瘤组织中C0X-2、VEGF蛋白的表达。图8为二甲基苯蒽(DMBA)致大鼠卵巢炎症演变为癌症实体图。图9为青蒿鳖甲片抑制DMBA致大鼠卵巢炎症演变为卵巢腺癌光学显微镜观察(HE 染色，200X)。
具体实施例方式本发明结合具体实施例和附图作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。就作用机制而言，青蒿鳖甲片适用于所有恶性表型的实体瘤(如肺癌、结直肠癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、)以及血液肿瘤(白血病、多发性骨髓瘤等)的防治。实施例1 :青蒿鳖甲片在非可控性炎症模型动物中应用
一.在卵巢炎症演变癌症大鼠中应用1.药品
青蒿鳖甲片(QHBJP)，由太极集团重庆桐君阁股份有限公司技术指导，按中药成方制剂标准WS-B-1355-93制备。青蒿80 g，鳖甲胶13. 4 g，地黄160 g，知母80 g，牡丹皮120 g。牡丹皮粉碎成细粉，取104 g，余作粗头留用；青蒿蒸馏提取挥发油，药渣、粗头与知母、地黄加水煎煮3次，合并煎液，滤过，滤液浓缩成清膏,加入鳖甲胶使溶化,浓缩成稠膏，与牡丹 皮细粉混匀，干燥，研细，制成颗粒，干燥，加入上述挥发油，混匀，压制成片(每片含0.45g生药材)，即得。C0X-2通路抑制剂美洛昔康片(Meloxicam，批号784187)，上海勃林格殷格翰药业有限公司。5-L0X通路抑制剂孟鲁司特钠片(Montelukast sodium，批号100054)，杭州默沙东制药有限公司。2.动物SD大鼠，雌性，1(Γ12周龄，160± 15g，浙江省医学科学院动物实验中心[实验动物许可证号SYXK (浙)2007-0099 ]。3.致癌剂二甲基苯蒽(7，12-dimethylbenzanthracene, DMBA), Sigma 公司。用苯溶剂溶解二甲基苯蒽后，将棉线浸入药液内，置于通风厨内待苯挥发后，计算棉线的含药量为 O. 5mg/cm。4.卵巢炎症致癌方法雌性未孕SD大鼠，用20%乌拉坦(Smg^kg—1)腹腔注射麻醉后，将其仰卧固定，常规消毒，无菌条件下于下腹正中、耻骨联合上Icm纵行切开腹壁约1. 5cm,充分暴露卵巢，用5号可吸收缝线将I根含药棉线缝入大鼠左侧卵巢(以下统称为造模卵巢)，逐层关腹。右侧卵巢不作任何处理，作为阴性对照。待大鼠苏醒后分笼清洁级饲养，每只大鼠腹腔注射庆大霉素O.1ml X 7d以预防术后感染。5.给药方案造模2周后，所有大鼠随机分成6组，模型对照组，青蒿鳖甲片低、中、高剂量组，美洛昔康组，孟鲁司特钠组，每组16只。灌胃给药，按生药量计，青蒿鳖甲片(QHBJP)低、中、高剂量组分别给予750、1500、3000mg · kg-1 · cf1，美洛昔康(Mel)组4mg · kg-1 · (Γ1,孟鲁司特钠(Mon)组5 mg · kg-1 · cf1,模型对照组给予同体积生理盐水(ml · kg—1 · cf1)，连续给药16周。停药次日尾静脉采取血清，-80 °C保存待测。停药后继续观察18周
二.在移植S18tl肉瘤小鼠中应用1.药品
青蒿粉末，青蒿6 g在60 1干燥至恒定质量，碾碎，过100目筛，备用。青蒿鳖甲粉末青蒿粉末制备同上。鳖甲15 g水浸I h，煎煮2次，每次浓缩至100 mL，滤过，合并2次滤液，继续加热浓缩至3 4 mL，呈黄色胶状。将青蒿与鳖甲胶混合均匀，置于60 °C烘箱干燥至恒定质量，碾碎，备用。
青蒿鳖甲片(QHBJP)，由太极集团重庆桐君阁股份有限公司技术指导，按中药成方制剂标准WS-B-1355-93制备。制备方法同“在卵巢炎症演变癌症大鼠中应用”。2.动物和瘤株清洁级ICR系小鼠，雄性，6周龄，18 22 g，浙江省医学科学院动物实验中心提供，实验动物许可证号SX (浙)2003-0001。小鼠S18tl瘤株，中国科学院上海细胞生物学研究所提供。3. S180肉瘤移植方法与给药方案S18tl肿瘤细胞于RPMI 1640培养液(含10%小牛血清、青霉素100 U mL'链霉素100 μ g mL—1)中5% CO2, 37 °C培养。取对数生长期细胞(5父103/!^)，无菌条件下给10 小鼠腹腔注射0.2 mL。取接种后第8天的小鼠腹水，用生理盐水稀释成I X IOVmL细胞悬液，给每鼠左前肢腋窝皮下接种O. 2 mL。将接种成功的小鼠随机分为6组(每组10只)模型对照 组(给予同体积生理盐水)，青蒿(1. 5 gkg-1)组，青蒿鳖甲(1.5 gkg—1)组，青蒿鳖甲片低、中、高剂量(0.75、1.5、3.0 g_ kg—1)，于接种次日每天灌胃给药I次，连续给药10 d。停药次日断头处死小鼠，剥取肿瘤称质量，计算抑瘤率。抑瘤率=(I 一给药组平均瘤质量/模型组平均瘤质量)。留取血清，-80 °C保存待测。实施例2 :青蒿鳖甲片对非可控性炎症模型动物血清中炎症介质干预
一.对卵巢炎症演变癌症大鼠血清中前列腺素E2 (PGE2)、白三烯B4(LTB4)产生的干预采用美国R&D公司PGE2、LTB4的ELISA试剂盒，按试剂盒说明方法，对实施例1的卵巢炎症演变癌症大鼠于实验第18周(给药第16周结束后)检测各组大鼠血清中PGE2、LTB4含量。结果发现，大鼠血清中PGE2含量在青蒿鳖甲片高剂量组(180. 50±22. 75 pg/ml)、中剂量组(182. 44±26. 35 pg/ml)中有明显降低作用，与模型组(247. 59±25. 47 pg/ml)相比有显著性差异Ο°〈0. 05);青蒿鳖甲片低剂量组大鼠血清PGE2含量(216. 63 ±23. 51 pg/ml)与模型组相比无显著性差异。与C0X-2通路抑制剂美洛昔康组(171. 08±21. 93 pg/ml)相比，青蒿鳖甲片高、中剂量组大鼠血清中PGE2含量差异无显著性(产>0. 05)。对大鼠血清中LTB4含量，青蒿鳖甲片高剂量组(51. 22±1. 50 pg/ml)、中剂量组(52. 48±2. 70 pg/ml)都明显低于模型组(57. 55±6. 27pg/ml)，相比有显著性差异(/X0. 05);青蒿鳖甲片低剂量组(53.63±3.93 pg/ml)与模型组相比无显著性差异。与5-L0X通路抑制剂孟鲁司特钠组(50.07±1.84 pg/ml)相比，青蒿鳖甲片高、中剂量组大鼠血清中LTB4含量差异无显著性0°>0· 05)(表 I)。
权利要求
1.一种青蒿鳖甲组合物在制备抗非可控性炎症预防恶性转化药物中的应用，所述青蒿鳘甲组合物由青蒿80g,鳘甲胶13. 4g,地黄160g,知母80g,牡丹皮120g组成。
2.根据权利要求1所述的一种青蒿鳖甲组合物在抗非可控性炎症预防恶性转化药物中的应用，其特征在于，在制备减少炎症组织中肿瘤相关巨噬细胞浸润药物中的应用。
3.根据权利要求1所述的一种青蒿鳖甲组合物在抗非可控性炎症预防恶性转化药物中的应用，其特征在于，在制备双重干预COX-2 / 5-L0X生物学效应药物中的应用。
4.根据权利要求1-3任一所述的一种青蒿鳖甲组合物在抗非可控性炎症预防恶性转化药物中的应用，其特征在于，所述药物的制剂形式是片剂。
全文摘要
本发明提供一种青蒿鳖甲组合物在制备抗非可控性炎症预防恶性转化药物中的应用。所述组合物由青蒿，鳖甲胶，地黄，知母，牡丹皮组成。即作为一种减少炎症组织中肿瘤相关巨噬细胞浸润，双重干预COX-2/5-LOX生物学效应的中药复方制剂在制备抗非可控性炎症预防恶性转化药物中的应用。本发明以非可控性炎症恶性转化中关键节点COX-2/5-LOX生物学效应为理论依据，研究并阐明中药古方剂的科学内涵，是发展中医药理论新的重要方向，为发展中医药新的理论和药物作用新的靶点提供重要依据。本发明为青蒿鳖甲组合物应用于癌症防治，具有将中药名优方剂二次开发的重要价值。
文档编号A61K36/8964GK103007011SQ201310000019
公开日2013年4月3日 申请日期2013年1月3日 优先权日2013年1月3日
发明者周慧君, 钱晓丹, 张佳丽, 王增 申请人:浙江大学