共转化基因Anti-Dxr和Anti-Fpps培育高青篙素含量青蒿的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及利用基因工程培养植物领域，具体是一种利用转基因技术培育高青蒿 素含量的青蒿的方法。
【背景技术】
[0002] 青蒿（ArtemisiaeannieL.)，菊科，艾属。学名黄花蒿，另lj名臭蒿、香蒿、苦蒿。生 长于山坡、林缘及荒地，为一年生草本。老百姓用于消暑、头痛、退热和感冒等的治疗.提 取青蒿素则是利用青蒿地上部分叶片和未开放的花蕾，提取生产的有效生理活性成分如青 蒿素等产品，是低毒、高效、速效的抗疟新药（中国药典，2005;钟国跃，等，2007)。青蒿野 生资源丰富，但青蒿素含量不高，加大了制药厂提取青蒿素的制药成本，除利用传统育种方 法，近年来研宄利用基因工程方法提高青蒿的青蒿素含量，培育高青蒿素含量的转基因品 种成为热点。
[0003] 研宄表明，每年世界上有超过100万人死于疟疾。疟原虫耐药性，使得抗疟药物 氯喹的药物效果受限，而青蒿素对疟疾具有低毒和速效的特点。目前青蒿素是公认有效的 治疗疟疾首选药物，这使得提取青蒿素的原材料青蒿需求量非常大。随着目前生物工程合 成途径研宄的深入，利用转基因工程提高青蒿中青蒿素含量成为研宄热点。转基因技术成 为提高青蒿素含量的可行途径之一。Chen等利用在青蒿中能够过量表达PEP基因，转化 的青蒿植株中青蒿素含量比对照高3-5倍。Teoh等认为cyp71avl基因在青蒿素生物合成 途径中是关键的限速基因，并从特异cDNA中克隆到cyp71avl基因。Ro等也克隆cyp71avl 基因及其氧还伴侣基因cpr，并将cyp71avl基因和cpr基因导入酵母并成功地提高了青蒿 素含量。文献中有利用A0C基因（唐克轩，等）以及ADS，CYP71AV1，CPR(唐克轩，等）三个 基因通过根瘤农杆菌介导获得转基因青蒿的报道，均是利用目的基因提高青蒿素含量的方 法。
[0004] 从中药材青蒿花蕾中提取的青蒿素（ArtemisiaannuaL.)用于抗疱疾，原材料 青蒿需求量大，但野生青蒿得青蒿素含量很低，只占青蒿植株干重〇. 01-0. 1%，如何提高 青蒿素含量，成为热点课题，通过转基因办法改造提高青蒿素含量是一种有效途径.植物 猫类化合物的合成主要通过MVA和DXP两个途径，S卩甲轻戊酸（mevalonatepathway，MVA) 途径和 1-脱氧木酮糖 5_ 磷酸合酶（l-deoxy-D-xylulose-5-phosphatesynthase，DXS)或 甲基赤藓醇 4_ 磷酸（methylerythritol4-phosphatepathway，MEP)DXP途径。脱氧木酮 糖磷酸盐还原异构酶（l_deoxy-D-lxylulose-5-phosphatereductoisomerase，DXR)催化 1-脱氧-木酮糖-5-磷酸〇)XP)生成2C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸（MEP)，是DXP途径的 限速酶。DXR是潜在的抗生素、抗疟药物和除草剂的更有效率的靶标位点。由于在细菌、藻 类、植物和原生动物中发现DXR，而人体未找到，因此用DXR这一靶标位点研制抗菌和抗疟 药物成为可能。法呢基二磷酸合酶（farnesyldiphosphatesynthase，FPPS)是异戊稀基 转移酶，FPPS催化2个IPP分子和1个DMAPP分子头尾相连缩合形成中间物GPP和终产物 FPP。当用植物黄萎病原菌接种到棉花悬浮培养的细胞时，FPPS可大量诱导表达，这与植物 在受到侵害时释放萜类化合物的现象相吻合，FPPS是合成倍半萜烯的重要酶。增强Dxr和 Fpps基因活性，可以提高植株青蒿素的含量，本发明将关键酶基因Dxr和Fpps基因双转化 青高，提尚青高中的青高素合成，获得尚青高素含量的基因工程青高品种，为培育尚青高素 含量的青蒿提供一种新的方法。本发明旨在构建Dxr基因和Fpps基因的植物表达载体， 并获得重组工程植株，利用转基因技术培育高青蒿素含量的青蒿奠定基础.
【发明内容】
[0005] 针对现有生产中对高青蒿素含量青蒿的需求，本发明所要解决的技术问题是在青 蒿基因组中导入能增加青蒿素合成的基因，并增强其原有基因的表达，获得转基因青蒿新 品系，以提高其青蒿素合成能力，使其花蕾中能超量蓄积青蒿素，使这种转基因青蒿品系成 为工业化大规模生产的原材料。
[0006] L-脱氧木酮糖磷酸盐还原异构酶（L一phenylalaninammonia_lyase，Dxr)和法 呢基二磷酸合酶tyrosinase，Fpps)，均是青蒿植株合成青蒿素的关键酶。增强Dxr和Fpps 活性，可以提高植株青蒿素的含量，本发明将关键酶基因Dxr和Fpps基因双转化青蒿，提高 青蒿中的青蒿素合成，获得高青蒿素含量的基因工程青蒿品种，为培育高青蒿素含量的青 蒿提供一种新的方法。
[0007] 为实现本发明目的而采用的技术方案是这样的，共转化基因Anti-Dxr和 Anti-Fpps培育高青篙素含量青蒿的方法，包括如下步骤：
[0008] 1)克隆脱氧木酮糖磷酸盐还原异构酶的基因片段，记为Dxr基因片段，并将Dxr基 因片段构建成Anti-Dxr基因植物表达载体；
[0009] 2)克隆法呢基二磷酸合酶的基因片段，记为Fpps基因片段，并将Fpps基因片段构 建成Anti-Fpps基因植物表达载体；
[0010] 3)利用转基因技术将Anti-Dxr和Anti-Fpps导入青蒿，获得包含Dxr基因和Fpps 基因的青蒿植株。该步骤中可以采用如下两种方式进行培育获得包含Dxr基因和Fpps基 因的青蒿植株：将Anti-Dxr和Anti-Fpps分别导入不同的青蒿，分别获得Dxr转基因青蒿 与Fpps转基因青蒿，然后将Dxr转基因青蒿与Fpps转基因青蒿进行杂交，获得包含Dxr基 因和Fpps基因的F1代青蒿植株；采用电击法将Anti-Dxr和Anti-Fpps导入同一根癌农杆 菌EHA101，然后采用农杆菌介导法将所述癌农杆菌EHA101导入青蒿，构成包含Dxr基因和 Fpps基因的青蒿植株。
[0011] 本发明可以对所述的F1代植株进行人工筛选，以获得稳定表达Anti-Dxr基因和 Anti-Fpps基因的高青蒿素含量的青蒿植株。在青蒿基因组中导入Anti-Dxr和Anti-Fpps 基因，使青蒿合成青蒿素过程中产生调控性，具有比原先更高效地合成青蒿素的特性并获 得青蒿素含量高的青蒿。
[0012] 通过对青蒿基因组进行的上述改造，可大幅度提高青蒿花蕾中青蒿素的含量，使 之成为工业化大规模生产青蒿素的原材料。
[0013] 本发明用于作为Anti-Dxr基因和Anti-Fpps基因受体亲本的青蒿素含量相对高 的青蒿是同一品种。在青蒿中导入Dxr基因和Fpps基因可以提高青蒿中青蒿素的含量，在 普通植株青蒿素含量为6.20mg/g干重时，本发明得到的转基因青篙植株中花蕾青篙素含 量最高17. 40mg/g干重，其含量是非转化对照青篙含量的2. 81倍。本发明获得的稳定青 蒿植株可以广泛种植，对于以青篙为原料的药厂可以节约其提取青蒿素的成本。
【附图说明】
[0014] 图1植物双元表达载体载体结构图。
[0015] 图中为pCAMBIA2301_DxrorFpps载体构建不意图。
[0016]图2为候选转基因植株的PCR特异性扩增结果示意图，
[0017] 图中M标示Marker,V为仅转染Vector，三泳道为3株不同对照植株。P为候选阳 性植株（PositivePlants),即转染Dxr和Fpps基因