一种通过引入聚-β-羟基丁酸酯代谢途径提高钝齿棒杆菌L-精氨酸产量的方法
【技术领域】
[0001] 通过聚-轻基丁酸酯（PHB)代谢途径引入提高钝齿棒杆菌（Corynebacterium crenatum)L-精氨酸产量，本发明属于基因工程和生物工程领域。具体地说涉及一种PHB 操纵子在钝齿棒杆菌中表达的基因工程菌株的构建及其利用该菌株进行5-L发酵罐高产 L-精氨酸的方法。 技术背景
[0002] L-精氨酸（L-arginine)是一种含有胍基的碱性氨基酸，在医药和食品工业有较 广泛的用途，是人体代谢的一种重要氨基酸，具有独特的生理和药理作用，在制药、保健品 及化妆品领域有着广泛的应用价值，目前国内外对其合成和生产都有着比较深入的研究。 近年来微生物发酵法生产L-精氨酸受到越来越多的关注，各国科学家相继开展这方面的 工作。
[0003] 聚羟基丁酸酯（PHB)是原核微生物在碳、氮营养失衡的情况下，作为碳源和 能源贮存而合成的一类热塑性聚酯。PHB具有良好的生物降解性，可替代传统的塑料制品 制成绿色包装材料与容器，减少白色污染。再加之PHB的生物相容性以及缺乏免疫反应， 使PHB成为一种理想的医药材料，可用作手术缝合线、补牙填料、外科的棉绷带。将PHB代 谢途径引入菌体，调节全细胞代谢网络，影响C流和能量水平，从而促进相关代谢产物的产 量，相关文献已有报道。
[0004] 本实验室保藏有一株钝齿状、无芽孢、革兰式阳性的钝齿棒杆菌C. crenatum SYPA，是本实验室筛选得到的高产精氨酸突变菌株，相关文献已经报道。本发明所用载体质 粒pDXW-10为江南大学王小元教授研究室惠赠，具有tac-M启动子，在棒杆菌中可中等水平 表达外源基因，更利于代谢水平的进行。
[0005] 本发明通过表达载体pDXW-10,首次实现了在C. crenatum SYPA中PHB合成关键 酶酮基硫解酶（PhbA)、乙酰乙酰CoA还原酶（PhbB)和PHB合成酶（PhbC)的高效表达。 通过5-L发酵罐发酵实验，实现同一批菌株胞外产L-精氨酸胞内积累PHB的联产效果，最 终实现高效生产L-精氨酸。
【发明内容】
[0006] 本发明所使用的原始菌种为C.crenatumSYPA，该菌株以葡萄糖为碳源，在5-L发 酵罐发酵至96h，L-精氨酸产量可达35g/l左右。
[0007] 本发明的主要研究内容：本发明利用分子技术将来源于RalstoniaeutrophaH16 的聚-0 -羟基丁酸（PHB)合成操纵子基因phbCAB从pBHR68质粒上酶切下来，连接到到穿 梭表达载体PDXW-10,构建成为重组表达质粒pDXW-10-phbCAB并转化至文献已报道的钝齿 棒杆菌C.crenatumSYPA中，成功构建了基因工程菌株C.crenatumSYPA/pDXW-10-phbCAB。 对构建的基因工程菌株进行酶活力测定及胞内PHB含量测定研究证明C.crenatumSYPA/ pDXW-10-phbCAB中phbCAB得到了表达，实现了同一批菌株胞外产L-精氨酸胞内积累PJB的联产效果。最终在PH7. 0，温度30°C，转速600rpm的条件下，C.crenatumSYPA/ pDXW-10-phbCAB以葡萄糖为碳源，5-L发酵罐发酵至96h，L-精氨酸产量可达43. 21g/l，提 高了L-精氨酸的产量。
[0008] 本发明的优点和积极效果是：
[0009] (1)本发明首次通过在钝齿棒杆菌中表达PHB合成关键酶4 -酮基硫解酶、乙酰 乙酰CoA还原酶和PHB合成酶，实现胞内积累PHB和胞外生产L-精氨酸，达到了L-精氨酸 和PHB联产的效果，提高了底物利用效率。
[0010] (2)本发明采用5-L发酵罐分批发酵策略，优化发酵条件，最终C.crenatumSYPA/ pDXW-10-phbCAB发酵至96h，L-精氨酸产量达到43. 21g/l，PHB在胞内的积累对L-精氨酸 产量具有促进效果。
【具体实施方式】
[0011] 实施例1 :重组钝齿棒杆菌的构建
[0012] 质粒pDXW-10-phbCAB构建示意图如图1所示，具体过程如下：
[0013] 文献报道过的质粒pBHR68含有来自于RalstoniaeutrophaH16的聚-P-轻基 丁酸（PHB)合成操纵子基因phbCAB，通过限制性内切酶BamHI和EcoRI处理pBHR68,得到 PHB合成操纵子基因phbCAB，与经过Bglll和EcoRI处理的表达载体pDXW-10在T4DNA连 接酶的作用下16°C过夜连接，将连接液转化至大肠杆菌感受态E.coliJM109中，挑取阳性 转化子，提取转化子中的质粒，经酶切验证并确认重组质粒pDXW-10-phbCAB构建成功。
[0014] 将重组质粒pDXW-10-phbCAB以电转的方法转化至原始菌钝齿棒杆菌C.crenatum SYPA中，于karf抗性平板上挑取阳性转化子，经显微镜检测和提取重组质粒验证，即得到重 组钝齿棒杆菌C.crenatumSYPA/pDXW-10-phbCAB。
[0015] 实施例2 :重组菌株酶活力测定
[0016] (1)酶活测定缓冲体系
[0017] @ -酮基硫解酶：0? 106M Tris-HCl (pH7. 3)，0? 67mM DIT，0. 806mM乙酰CoA， 1. 88Mm P -NADH，2. 5U P-羟酰CoA脱氢酶；
[0018] 乙酰乙酰CoA还原酶：25mMTris-HCl (pH7.5)，0?25mMMgCl2*6H20,12. 5mMDTT， 6.OmMNADPH，1. 25mM乙酰乙酰CoA ;
[0019]PHB合成酶：50iiM3HB-CoA，25mMTris-HCl (pH7.5)，ImMDTNB;
[0020] (2)酶活测定
[0021] 将实施例1构建的重组菌C.crenatumSYPA/pDXW-10-phbCAB与出发菌株 C.crenatumSYPA分别接种于10mL含卡那霉素的LBG培养基中，30°C振荡培养24h，按4% 的接种量转接于LBG培养基中，30°C培养24h，取发酵液于4°C，10000r/min离心10min， pH7. 0的磷酸钠缓冲液清洗3次，悬浮在pH7. 0的磷酸钠缓冲液中，超声波破碎处理制备粗 酶液。将30yl粗酶液加入到酶活力测定缓冲体系中立即检测相应波长下吸光值的变化。 经计算比较比酶活，结果表明，相比于出发菌C.crenatumSYPA，重组菌C.crenatumSYPA/ pDXW-10-phbCAB中0 -酮基硫解酶的比酶活提高了 26倍，乙酰乙酰CoA还原酶和PHB合成 酶分别提高了 30和13倍。
[0022]实施例3:重组菌株C. crenatum SYPA/pDXW-10-phbCAB发酵罐实验 [0023] (1)种子培养
[0024] 从活化平板上挑取单菌落接种于10mL含卡那霉素的LBG培养基中，30°C振荡培 养24h，然后全部转接于150ml种子培养基中，30°C培养24h，种子培养基组成：葡萄糖50g/ L，硫酸铵20g/L，酵母提取物12g/l，七水合硫酸镁0. 5g/l，磷酸二氢钾1. 5g/l，去离子水配 置，pH7.0。
[0025] (2)发酵培养
[0026] 初始发酵培养体积为2. 5L，采用的发酵培养基成分如下：
[0027] 发酵培养基成分：葡萄糖200g/l，硫酸铵20g/l，酵母提取物12g/l，七水合硫酸镁 〇? 5g/l，氯化钾lg/1，磷酸二氢钾1. 5g/l，七水合硫酸亚铁0? 02g/l，一水合硫酸猛0? 02g/ 1，去离子水配置，pH7.0。将上述发酵培养基用50%的氨水调节其pH至7.0,在121°C下 高温灭菌30min。
[0028] 发酵条件：将上述培养好的种子液按6%接种量接种于发酵培养基中进行发酵培 养，发酵温度为30°C，pH为7. 0,搅拌转速为600r/min。培养96h。
[0029] 实施例4 :发酵产物及相关参数测定
[0030] 发酵过程中，温度与搅拌转速由发酵罐自动控制，pH通过补加50%氨水维持稳 定。从第24h起，每12h取样一次，采用分光光度仪在A562下测定细胞0D值，葡萄糖用生物 传感分析仪测定（SBA-50,山东省科学院生物研究所）。
[0031] L-精氨酸和其他各种氨基酸采用HPLC测定（安捷伦1100,美国）。PHB含量用气 相色谱测定（GC-1690J气相色谱仪，杭州科晓化工仪器公司）。色谱条件如下：毛细管柱， 30mX0. 32mm色谱柱中固定液为AT.SE-30,，检测器为FID，柱温160°C，汽化室与检测器的 温度均为250°C，载气为N2，流速0.IMpa，进样量2iiL，采用外标法定量。结果表明，相比于 出发菌，重组菌生长的更好，糖耗更快，胞内PHB积累量提高了 3倍左右，发酵至96h，重组菌 的L-精氨酸产量达到43.21g/l，较出发菌株C.crenatumSYPA提高了 17. 8%，实现了胞内 积累PHB胞外产生L-精氨酸的效果。
【主权项】
1. 一种高产L-精氨酸的重组钝齿棒杆菌（Corynebacterium crenatum)，其特征在于： 将SEQ ID N0:1所示的Ralstonia eutropha H16的聚-0-轻基丁酸（PHB)合成操纵子 基因phbCAB从pBHR68上酶切下来，连接到穿梭表达载体pDXW-10,构建成为重组表达质粒 pDXW-10-phbCAB并转化至钝齿棒杆菌C. crenatum SYPA中，经发酵罐实验验证，重组钝齿 棒杆菌提高了生产L-精氨酸的能力。
2.利用权利要求1构建的重组钝齿棒杆菌C. crenatum SYPA/pDXW-10-phbCAB，优化 其5-L发酵罐发酵生产L-精氨酸的条件，其发酵条件为：pH为7. 0,温度为30°C，转速为 600rpm ;培养基配方为：葡萄糖200g/l，硫酸铵20g/l，酵母提取物12g/l，七水合硫酸镁 〇? 5g/l，氯化钾lg/1，磷酸二氢钾1. 5g/l，七水合硫酸亚铁0? 02g/l，一水合硫酸猛0? 02g/ 1〇
3. 利用权利要求1构建的重组枯钝齿棒杆菌C. crenatum SYPA/pDXW-10-phbCAB， 在权利要求2发酵条件下进行发酵生产L-精氨酸，其特征是：菌株C. crenatum SYPA/ pDXW-10-phbCAB接种于含卡那霉素10mL LBG培养基中，30°C振荡培养24h后，全部转接于 总体积为150ml的种子培养基中（该种子培养基的配方为：葡萄糖50g/L，硫酸铵20g/L，酵 母提取物12g/l，七水合硫酸镁0.5g/l，磷酸二氢钾1.5g/l，去离子水配置，pH 7.0)，30°C 振荡培养24h后，转接于5-L反应器中，培养至96h，L-精氨酸的产量达到43. 21g/L，相比 于对照菌株 C. crenatum SYPA(36. 68g/l)，产量提高了 17.8%。
【专利摘要】通过引入PHB代谢途径到Corynebacterium crenatum SYPA中，从而高产L-精氨酸，属于基因工程和生物工程领域。该发明酶切质粒pBHR68获得合成PHB的操纵子，与棒杆菌表达载体pDXW-10连接，并将其在C.crenatum SYPA中表达，为国内外首次通过引入PHB代谢途径在野生型钝齿棒杆菌中高产L-精氨酸。对构建的基因工程菌株进行酶活力测定及胞内辅酶水平研究证明C.crenatum SYPA/pDXW-10-phbCAB合成L-精氨酸的能力得到加强。最终在30℃，pH 7.0及600rpm条件下，C.crenatum SYPA/pDXW-10-phbCAB在5-L发酵罐发酵96h可产得43.21 g/L的L-精氨酸，为国内外首次通过引入PHB代谢途径到菌体内，调节胞内代谢网络，最终实现高产L-精氨酸的目的，为微生物工业化生产L-精氨酸提供了基础。
【IPC分类】C12R1-15, C12N1-21, C12N15-66, C12N15-77, C12P13-10
【公开号】CN104531747
【申请号】CN201410748914
【发明人】饶志明, 秦敬儒, 徐美娟, 张显, 杨套伟
【申请人】江南大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月9日