本发明涉及分子生物学与生物
技术领域：
，特别涉及一种利用生物酶催化技术制备3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的方法及其制备用7α-类固醇脱氢酶。
背景技术：
：3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸又名7-酮石胆酸，是制备熊去氧胆酸的重要中间体。而熊去氧胆酸是名贵中药熊胆的主要有效成分，具有增加胆汁酸分泌、并使胆汁成分改变、降低胆汁中胆固醇及胆固醇脂等功效，主要用于治疗胆石疾病。众所周知，熊胆是一种非常稀缺的资源，原因在于其获取的传统途径主要是依赖于人工养殖活熊取胆的方法。目前，这种周期长、收率低且不人道的传统途径逐渐被人工合成方法所取代，而现知的人工合成熊去氧胆酸的方法中，3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸都是极为重要的中间体。目前3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的工业化生产多采用化学法，但是存在操作条件苛刻、选择性低、污染环境、使用大量有机溶剂、存在有机溶剂残留、有毒有害等缺点。为了解决化学法存在的诸多缺点，人们另辟蹊径，寻找更好的生产途径。中国发明专利CN1912192B公开了一种采用电化学合成制备3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的方法，但是此种方法依然需要使用有机溶剂，并且成本较高。中国发明专利申请CN105368828A公开了一种采用全细胞催化制备3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的方法，但是此种方法需进行细胞发酵培养，存在反应时间长、操作繁琐、产物复杂等缺点。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的新的制备方法，以解决上述
背景技术：
中提到的现有制备方法所存在的有机溶剂残留、条件苛刻、反应时间长、操作繁琐、成本较高、污染环境等缺点，本发明同时提供了该新制备方法适用的生物酶。为实现上述目的，发明人经过长期大量的实验摸索，在经历上百次的失败尝试之后，终于筛选出适用于细胞外生物催化制备3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的生物酶，并在此序列基础上进行优化，获得了活性提高和去除底物抑制的突变体酶，从而开发出一种新的制备3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的方法，其特征在于：以鹅去氧胆酸为底物，在NAD、乳酸脱氢酶、丙酮酸钠以及缓冲溶液存在的条件下，用7α-类固醇脱氢酶催化鹅去氧胆酸制备3α-羟基-7氧代-5β胆烷酸，所述7α-类固醇脱氢酶来源于羊种布鲁氏菌Brucellamelitensis，所述乳酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，在整个催化反应体系中，所述底物的浓度为50～100mg/mL，所述NAD的浓度为0.01～0.25mg/mL，所述丙酮酸钠的浓度为10～30mg/mL。上述方法中所使用的两种酶的具体存在形式包括液态酶、固态酶以及各种固定化酶，可以是未经纯化的粗酶形式，也可以是经部分纯化或完全纯化的形式。优选地，控制所述催化过程在温度为25～35℃，pH值为7.5～8.5的条件下进行。优选地，所述缓冲溶液为50～100mM磷酸钾缓冲液。优选地，上述制备方法还包括如下提纯步骤：待所述催化过程反应结束后，调节pH值为1.0～2.0，搅拌20～30min，待冷却后再经过滤水洗干燥后即得3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸成品。更优选地，上述制备方法还包括如下精制步骤：将获得的3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸成品用8-15倍无水乙醇50-60℃水浴条件下搅拌回流0.5-1h，过滤，取滤液进行真空减压浓缩至1/4-1/5体积，再加入4-5倍纯水搅拌1h，过滤，将滤饼真空干燥过夜，即得3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸精制品。优选地，上述制备方法中所使用的7α-类固醇脱氢酶为如下（a）或（b）的蛋白质：（a）其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示的蛋白质，（b）在（a）限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸并且在NAD存在下以鹅去氧胆酸为底物具有比氨基酸序列如SEQIDNO：2所示的亲本高的7α-类固醇脱氢酶催化活性的由（a）衍生的蛋白质。更优选地，所述7α-类固醇脱氢酶与如SEQIDNO：2所示的氨基酸序列相比在选自至少一个下述位点处具有至少一个突变：第91位、第92位、第117位、第118位、第195位、第241位以及第243位。更优选地，所述7α-类固醇脱氢酶具有至少一个下述突变：D91K、L92R、N117I、V118R、S195A、I241R以及T243A。本发明还提供了一种7α-类固醇脱氢酶，所述7α-类固醇脱氢酶来源于羊种布鲁氏菌Brucellamelitensis，用于催化鹅去氧胆酸制备3α-羟基-7氧代-5β胆烷酸，所述7α-类固醇脱氢酶为如下（a）或（b）的蛋白质：（a）其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示的蛋白质，（b）在（a）限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸并且在NAD存在下以鹅去氧胆酸为底物具有比氨基酸序列如SEQIDNO：2所示的亲本高的7α-类固醇脱氢酶催化活性的由（a）衍生的蛋白质。优选地，所述7α-类固醇脱氢酶与如SEQIDNO：2所示的氨基酸序列相比在选自至少一个下述位点处具有至少一个突变：第91位、第92位、第117位、第118位、第195位、第241位以及第243位。优选地，所述7α-类固醇脱氢酶具有至少一个下述突变：D91K、L92R、N117I、V118R、S195A、I241R以及T243A。有益效果：1、与现有的3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的制备方法相比，本发明提供的方法具有操作简单、反应条件温和易控、反应时间短、不使用有机溶剂、无毒无污染且成本低廉的优点，经实践证明，本发明提供的方法的反应时长仅需4～12小时，其对底物的转化率高达99.8%以上，所获得的产品的含量在96.8%以上。2、本发明筛选出了适用于细胞外生物催化制备3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的7α-类固醇脱氢酶基因，并在此序列基础上进行优化，获得了活性提高和去除底物抑制的突变体酶，这些突变体酶表现出高的选择性使得该方法不会形成副产物，这些突变体酶的高催化活性和高专一性使得3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸酶法大规模生产的成本更低，具有较高的工业应用价值。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释，本发明并不局限于以下实施例，实施例中未注明具体条件者，按常规条件或者制造商建议的条件进行。本发明提供的3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的制备方法的具体实施过程如下：将鹅去氧胆酸悬浮于50～100mM磷酸钾缓冲液（pH8.0）中，用10M的NaOH调节pH到8.0，再加入终浓度为10～30mg/mL的丙酮酸钠并用10M的NaOH调节pH到8.0，加入7α-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶，最后加入终浓度为0.01～0.25mg/mL的NAD，底物终浓度为50～100mg/mL，反应在温度25～35℃、200～400rpm和pH7.5～8.5进行，反应时间为4h～12h。每隔一定时间取反应液用流动相稀释50～100倍，微孔过滤后进样进行液相分析。液相检测使用PhenomenxGemini5μmNX-C18110A250×4.6mm为分析柱，流动相为乙腈:缓冲溶液（取磷酸二氢钠0.78g,溶解1L水中，用磷酸调pH值为3，即可）:甲醇=30:37:40，用0.45um滤膜过滤后备用。柱温为40℃，示差检测器（RID），流速为0.8mL/min。待催化过程反应结束后，在快速搅拌的情况下加入盐酸至pH为1.0～2.0，继续搅拌20～30min，待冷却后过滤、经水洗三次后真空干燥后即得3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸成品。成品再用8-15倍无水乙醇50-60℃水浴条件下搅拌回流0.5-1h，过滤，取滤液进行真空减压浓缩至1/4-1/5体积，再加入4-5倍纯水搅拌1h，过滤，将滤饼真空干燥过夜，即得3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸精制品。上述方法中所使用的两种酶的具体存在形式包括液态酶、固态酶以及各种固定化酶，可以是未经纯化的粗酶形式，也可以是经部分纯化或完全纯化的形式。实施例1含有亲本基因的共表达重组质粒pET22b-AH2-LDH的制备将来源于羊种布鲁氏菌（Brucellamelitensis）的7α-类固醇脱氢酶基因AH2和来源于魏斯氏菌（Weissellasp）的乳酸脱氢酶基因LDH分别利用引物对5'CGCCATATGATGGGCGCCGACCCGGTTTA3'和5'CCGGAATTCTCAGTCGAGTTCCTGCACGCC3'以及引物对5'CCGGAATTCAAGGAGATATACATATGAAGATCTTCGCGTACGGTA3'和5'CCGCTCGAGTTAATATTCCACCGCAATGC3'通过PCR扩增技术获得PCR产物后经过酶切处理，同时插入到表达载体pET22b（+）的NdeI和EcoRI位点以及EcoRI位点和XhoI位点，得到共表达重组质粒pET22b-AH2-LDH。经DNA测序，确定该被克隆的亲本7α-类固醇脱氢酶的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示；确定该被克隆的亲本乳酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，其氨基酸序列如SEQIDNO：4所示。实施例2含有7α-类固醇脱氢酶突变体的共表达重组质粒的制备通过反向PCR技术对7α-类固醇脱氢酶亲本进行定点突变，在突变位置通过设计反向引物，利用上下游突变引物扩增目的片段，并在引物上引入相应突变，以重组质粒pET22b-AH2-LDH作为模板进行反向PCR，PCR产物经DpnI酶消化模板处理后转化到大肠杆菌Rosetta(de3)，经过Amp的筛选后挑取菌落送测序。突变位点及引物设计如表1所示。PCR体系为：TaKaRaEXTaqHS0.25ul；10×ExTaqBuffer5ul；模板质粒1ul；dNTP（2.5mMeach）4ul；上游引物1ul;下游引物1ul；无菌水upto50ul。PCR程序为：首先98℃2min；然后98℃10s，55-56℃30s，72℃7min，30个循环；最后72℃10min。表1引物名称引物序列（5′至3′）D91K+L92R上游GTCGTAACCAAGAGGAAAAGCGAAD91K+L92R下游TTCGCTTTTTCCTCTTGGTTACGACN117I+V118R上游CTTGAATGCATCAGAACCGACGAGN117I+V118R下游CTCGTCGGTTCTGATGCATTCAAGS195A上游AATATTTCGGCCATGGCCGGAS195A下游TCCGGCCATGGCCGAAATATTI241R+T243A上游GGCGCGAGAAAGGCCGATGCGI241R+T243A下游CGCATCGGCCTTTCTCGCGCC实施例3酶液的制备将实施例1和实施例2制备的亲本和突变体共表达重组质粒分别转入大肠杆菌Rosetta(de3)，再将获得的重组大肠杆菌接种在小体积的LB培养基（含有100μg/mL的Amp），30～37℃过夜培养后，以1～5%的接种量转接到一定体积的LB培养基中（含有100μg/mL的Amp），在30～37℃继续培养OD600达到0.6～1.0加入终浓度为0.1mM～1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，在20～37℃诱导表达10～20h后离心收集菌体。发酵菌体悬浮于一定体积的50～100mM的磷酸钾缓冲液（pH8.0）中并超声波破胞，离心即得含有乳酸脱氢酶与7α-类固醇脱氢酶亲本或者与7α-类固醇脱氢酶突变体的粗酶液，可用于酶活力的测定以及3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的生物催化制备。实施例4酶活力的测定7α-类固醇脱氢酶的酶活测定方法：以鹅去氧胆酸为底物，在一个3mL的反应体系中加入10uL的150mM鹅去氧胆酸，100uL的稀释酶液，NAD+终浓度为0.2mM，在pH8.0和25℃反应一定时间，在340nm处测定吸光值增加。乳酸脱氢酶的酶活测定方法：以丙酮酸钠为底物，在一个3mL的反应体系中加入100uL的50mM丙酮酸钠，100uL的稀释酶液，NADH终浓度为0.2mM，在pH8.0和25℃反应一定时间，在340nm处测定吸光值减少。酶活力的测定结果如表2所示，其中LDH为乳酸脱氢酶，7α-HSDH为7α-类固醇脱氢酶。表2类型酶活力U/ml温度稳定性pH稳定性LDH1017.5±23.54-45℃6.0-9.07α-HSDH亲本787.4±14.44-50℃6.0-9.0D91K+L92R856.2±15.44-45℃6.0-9.5N117I+V118R986.5±19.34-45℃6.5-9.0S195A806.4±16.84-50℃6.0-9.0I241R+T243A795.3±13.84-50℃6.0-9.0实施例53α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的制备参照前述3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的制备方法的具体实施过程，使用实施例3制备的粗酶液，酶液的投入量以酶液的重量占整个反应体系的体积计，控制底物鹅去氧胆酸的终浓度为100mg/mL，其余各具体参数如表3所示。反应4h～12h后测得，底物转化率在99.8%以上，成品含量在96.8%以上，收率为85～95%。表3类型酶液投入量（W/V）丙酮酸钠投入量NAD+投入量反应温度反应pH亲本20%20mg/ml0.15mg/ml25℃8.0D91K+L92R20%20mg/ml0.1mg/ml25℃8.0N117I+V118R15%18mg/ml0.1mg/ml30℃8.5S195A20%20mg/ml0.15mg/ml20℃8.0I241R+T243A18%20mg/ml0.13mg/ml30℃8.0实施例63α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的制备总体系1L，取50g含量为99%的鹅去氧胆酸，悬浮于100mM的磷酸钾缓冲液（pH8.0），用10MNaOH的调节pH到8.0后加入终浓度20g/L的丙酮酸钠，并依次加入0.09g7α-类固醇脱氢酶冻干粉（S195A突变体酶）和0.07g乳酸脱氢酶冻干粉，最后加入终浓度为0.15g/L的NAD，底物终浓度为50g/L。在25℃、250rpm和pH8.0左右进行反应4h，转化率达99.8%。反应结束后，反应液滴加盐酸溶液至pH为1.2，继续搅拌30min后待冷却过滤、经水洗三次后真空干燥得到3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸成品67g。成品用900ml无水乙醇60℃水浴条件下搅拌回流1h，过滤取滤液进行真空减压浓缩至200ml体积，再加入1L纯水搅拌1h，过滤，将滤饼真空干燥过夜即得3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸精制品53g。SEQUENCELISTING<110>眉山市新功生物科技有限公司、邦泰生物工程（深圳）有限公司<120>一种3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的制备方法及其制备用酶4<160>4<170>PatentInversion3.5<210>1<211>915<212>DNA<213>羊种布鲁氏菌（Brucellamelitensis）<400>1atgggcgccgacccggtttacggattacccggatttggcgaccatgaagggcgaacgccc60tttaagcgccttcaggtctcagatatagttgccatccgcacgccggtccgcatcacgccg120gatcgcaaagccttctggagaaaatatatgtcctatgagagcccgttccacctgaatgat180gctgttgcaatcgtcaccggagcggcggcaggtatcggacgggccatcgccggaaccttc240gccaaggctggtgcttcggttgtcgtaaccgaccttaaaagcgaaggcgctgaagccgtt300gcagccgcaataaggcaagctggcggcaaggccatcgggcttgaatgcaacgtaaccgac360gagcagcatcgcgaagccgtcatcaaagcggccctcgatcagttcggcaaaatcactgtt420ctggtcaacaatgcgggtggaggcggccccaagcccttcgatatgccgatgagcgacttt480gaatgggccttcaagctcaatctcttttccctgtttcgcctgtcgcaattggctgcccca540cacatgcagaaggctggcggcggcgcaattctcaatatttcgtccatggccggagaaaat600accaatgtccggatggcctcctatggttcgtccaaggcggcggtcaatcacctcacccgc660aacattgccttcgatgtcggcccaatgggcattcgcgtgaatgccatcgcacccggcgcg720atcaagaccgatgcgctcgcaaccgttctgacgcctgaaatcgaacgcgccatactcaag780cacaagccgcttggccgcctcggcgaagcgcaggatatcgccaatgcggcgctgttcctc840tgttcgcccgccgcagcatggatcagcggtcaggttctcacggtttccggcggcggcgtg900caggaactcgactga915<210>2<211>304<212>PRT<213>羊种布鲁氏菌（Brucellamelitensis）<400>2MetGlyAlaAspProValTyrGlyLeuProGlyPheGlyAspHisGlu151015GlyArgThrProPheLysArgLeuGlnValSerAspIleValAlaIle202530ArgThrProValArgIleThrProAspArgLysAlaPheTrpArgLys354045TyrMetSerTyrGluSerProPheHisLeuAsnAspAlaValAlaIle505560ValThrGlyAlaAlaAlaGlyIleGlyArgAlaIleAlaGlyThrPhe65707580AlaLysAlaGlyAlaSerValValValThrAspLeuLysSerGluGly859095AlaGluAlaValAlaAlaAlaIleArgGlnAlaGlyGlyLysAlaIle100105110GlyLeuGluCysAsnValThrAspGluGlnHisArgGluAlaValIle115120125LysAlaAlaLeuAspGlnPheGlyLysIleThrValLeuValAsnAsn130135140AlaGlyGlyGlyGlyProLysProPheAspMetProMetSerAspPhe145150155160GluTrpAlaPheLysLeuAsnLeuPheSerLeuPheArgLeuSerGln165170175LeuAlaAlaProHisMetGlnLysAlaGlyGlyGlyAlaIleLeuAsn180185190IleSerSerMetAlaGlyGluAsnThrAsnValArgMetAlaSerTyr195200205GlySerSerLysAlaAlaValAsnHisLeuThrArgAsnIleAlaPhe210215220AspValGlyProMetGlyIleArgValAsnAlaIleAlaProGlyAla225230235240IleLysThrAspAlaLeuAlaThrValLeuThrProGluIleGluArg245250255AlaIleLeuLysHisLysProLeuGlyArgLeuGlyGluAlaGlnAsp260265270IleAlaAsnAlaAlaLeuPheLeuCysSerProAlaAlaAlaTrpIle275280285SerGlyGlnValLeuThrValSerGlyGlyGlyValGlnGluLeuAsp290295300<210>3<211>996<212>DNA<213>魏斯氏菌（Weissellasp）<400>3atgaagatcttcgcgtacggtattcgtgaagacgagcagccggcgctgaaagcgtggatc60gcggcgcacccggaagtgaccgttgaattcaccgaccaactgctggatccggagaccgcg120aagctggcggaaggctttgacgcggtgaacgtttaccagcaactggattatacccgtgag180accctgaccgcgctgcacgaactgggtatcaacaaaatgagcctgcgtaacgttggcacc240gacaacattgactttgatgcggcgcgtgagttcgattttagcatcagcaacgtgccggtt300tatagcccgaacgcgattgcggaacacagcatcattcagatgagccgtctgctgcgtcgt360accaaggcgatggacgcgaaggtggcgaaacacgatctgcgttgggcgccgaccatcggt420cgtgagatgcgtatgcaaaccgtgggtgttatcggtaccggcaacattggccgtgttgcg480atgaagatcctgaaaggtttcggcgcgaaagtgattgcgtacgacctgtatcacaacgcg540gaagttgaggcggaaggtctgtacgtggacaccctggaggaactgtatgcgcaggcggat600gttattaccctgtacgtgccgggcgttccggcgaatcaccacatgatcaacgcggacagc660attgcgaagatgaaagatggtgtggttatcgttaactgcagccgtggcaacctgatggac720atcgacgatgtgattgcgggtctggatagcggcaagattagcgactttgcgatggatgtg780tatgaggaagaggttggtctgttcaacgtggattggagcaacaaggagtttccggacgcg840aaaatcgcggatctgattgcgcgtgaaaacgtgctggttaccccgcacaccgcgttctac900accaccaaggcggtgctggaaatggttacccaaagcatgaacgcgagcctggcgtttatc960aacggcgagaaaccgagcattgcggtggaatattaa996<210>4<211>331<212>PRT<213>魏斯氏菌（Weissellasp）<400>4MetLysIlePheAlaTyrGlyIleArgGluAspGluGlnProAlaLeu151015LysAlaTrpIleAlaAlaHisProGluValThrValGluPheThrAsp202530GlnLeuLeuAspProGluThrAlaLysLeuAlaGluGlyPheAspAla354045ValAsnValTyrGlnGlnLeuAspTyrThrArgGluThrLeuThrAla505560LeuHisGluLeuGlyIleAsnLysMetSerLeuArgAsnValGlyThr65707580AspAsnIleAspPheAspAlaAlaArgGluPheAspPheSerIleSer859095AsnValProValTyrSerProAsnAlaIleAlaGluHisSerIleIle100105110GlnMetSerArgLeuLeuArgArgThrLysAlaMetAspAlaLysVal115120125AlaLysHisAspLeuArgTrpAlaProThrIleGlyArgGluMetArg130135140MetGlnThrValGlyValIleGlyThrGlyAsnIleGlyArgValAla145150155160MetLysIleLeuLysGlyPheGlyAlaLysValIleAlaTyrAspLeu165170175TyrHisAsnAlaGluValGluAlaGluGlyLeuTyrValAspThrLeu180185190GluGluLeuTyrAlaGlnAlaAspValIleThrLeuTyrValProGly195200205ValProAlaAsnHisHisMetIleAsnAlaAspSerIleAlaLysMet210215220LysAspGlyValValIleValAsnCysSerArgGlyAsnLeuMetAsp225230235240IleAspAspValIleAlaGlyLeuAspSerGlyLysIleSerAspPhe245250255AlaMetAspValTyrGluGluGluValGlyLeuPheAsnValAspTrp260265270SerAsnLysGluPheProAspAlaLysIleAlaAspLeuIleAlaArg275280285GluAsnValLeuValThrProHisThrAlaPheTyrThrThrLysAla290295300ValLeuGluMetValThrGlnSerMetAsnAlaSerLeuAlaPheIle305310315320AsnGlyGluLysProSerIleAlaValGluTyr325330当前第1页1 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