本发明属于生物
技术领域：
，涉及一种能介导多个基因同时过表达或者敲低的piggyBac转座子系统及其制备和应用方法。本发明可用于细胞株改造、基因功能研究和基因治疗。
背景技术：
：多基因同时操作技术在细胞株改造、基因功能研究和基因治疗等领域有非常重要的应用。在细胞株改造领域，多基因同时操作在多重报告基因标记，提高抗体的活性和产量，诱导多能干细胞等分支领域被广泛应用。在基因功能研究过程中，特别是当要确立两个基因之间的相互作用(例如：基因间上下位效应)时，需要同时激活(过表达)这两个基因，或同时失活(敲低)这两个基因，或激活其中一个的同时失活另一个，随后通过表型分析确立基因之间的相互作用关系。这种遗传分析方法在研究各种细胞内生化代谢通路和细胞信号转导通路中发挥了重要作用。在基因治疗领域，多基因同时操作允许在导入对治疗有价值的基因的同时，导入自杀基因、激活或失活辅助靶点，从而使得基因治疗技术更为经济、安全、有效。现有对多个基因进行过表达或者敲低时大多采用的方法是，将单个基因过表达或敲低的构建装入不同的基因递送载体，然后同时或依次导入靶细胞。这种多个载体分开导入的方法存在以下两个缺点：1)不同载体在单个靶细胞中的导入比例不可控；2)在建立多载体稳定导入的细胞系时需要使用多个不同药物筛选标记。解决上述问题的有效途径是使用单一载体介导多个基因同时过表达或者敲低。piggyBac转座子系统是现有在哺乳动物细胞中效率最高的非病毒载体。piggyBac转座子早先于粉斑夜蛾(Trichoplusiani)的基因组中被发现，大小为2472bp，两端包含反向末端重复序列(ITR)，中间包含编码594个氨基酸的转座酶。piggyBac转座子类属于DNA转座子，通过剪切和粘贴机制可以由位于外源DNA或内源基因组的起始位点切离，并随机插入基因组中的另一位点。piggyBac转座子插入靶位点的序列为四核苷酸的TTAA。piggyBac转座子在切离TTAA时一般不会改变原位点及原位点的附近序列，即所谓无痕转座(Cary等，1989，Virology172：156-169；Fraser等，1995，Virology211：397-407；Fraser等，1996，InsectMolecularBiology5：141-151)。2005年，复旦大学研究人员发现，piggyBac转座子能在体外培养哺乳动物细胞及小鼠基因组中转座，并能携带至多10kb的外源基因而不 影响其转座效率(Ding等，2005，Cell122：473-483)。随后，又有研究发现，piggyBac转座子可以介导200kb的外源核酸片段导入细胞基因组(Li等，2013，Dis.Mod.Mech.Mar.)。基于piggyBac转座子能携带大片段外源基因以及能在哺乳动物细胞中介导高效转座的特点，其在介导多个基因同时过表达或者敲低中的潜在应用有待被进一步开发。技术实现要素：为了有效地使用单一载体进行多个基因同时操作，本发明提供了一种能介导多个基因同时过表达或者敲低的piggyBac转座子系统。本发明在同时过表达多个基因时所采取的技术方案是将多个基因串联在同一DNA分子内，并置于缺陷piggyBac转座子内，从而使得转录得到的单一信使RNA可以同时过表达多个蛋白质。在构建多基因过表达载体的一个优选例中，多个基因通过2A肽连接。本发明在同时敲低多个基因时所采取的技术方案是将多个基因敲低构建串联在同一DNA分子内，并置于缺陷piggyBac转座子内，从而使得转录得到的单一信使RNA可以形成靶向多个基因的短发夹RNA，敲低这些基因。本发明在同时过表达一些基因敲低另一些基因时所采取的技术方案是将敲低多个基因的构建串联在过表达多个基因的构建的3’端，并置于缺陷piggyBac转座子内，从而使得转录得到的单一信使RNA可以在过表达多个蛋白的同时形成多个短发夹RNA去敲低另一些基因。本发明的有益效果是，提供了一种能用于多基因同时操作的piggyBac转座子系统。该系统可有效地用于细胞株改造、基因功能研究和基因治疗。附图说明下面结合附图对本发明进一步说明。图1是本发明多基因同时操作piggyBac转座子系统中缺陷piggyBac转座子的设计图。图A为同时过表达两个基因(基因A和基因B)的缺陷piggyBac转座子构建，该构建所包含的元件从5’端到3’端依次是：PBL：piggyBac转座子左臂；Blast：blasticidine抗药筛选标记；CAG：鸡β-肌动蛋白复合启动子；GeneA：基因A的编码序列；2A：2A肽；GeneB：基因B的编码序列；PA：兔β-球蛋白polyA；PBR：piggyBac转座子右臂。图B为同时敲低两个基因(基因1和基因2)的缺陷piggyBac转座子构建，该构建所包含的元件从5’端到3’端依次是：PBL；Blast；CMV：巨细胞病毒早期启动子；shRNA1：基于miR30骨架敲低基因1的构建；shRNA2：基于miR30骨架敲低基因2的构建；PA，牛生长激素polyA；PBR。图C为过表达一个基因(基因A)同时敲低另一个基因(基因1)的缺 陷piggyBac转座子构建，该构建所包含的元件从5’端到3’端依次是：PBL；Blast；CMV；GeneA；shRNA1；PA；PBR。图2是本发明多基因同时操作piggyBac转座子系统用于同时过表达多个基因的一个实施例。图A为同时过表达两个基因(荧光素酶基因Luc和绿荧光蛋白基因EGFP)的缺陷piggyBac转座子的示意图。稳定携带该转座子的H1人类胚胎干细胞能同时表达绿荧光蛋白(图B)和荧光素酶(图C)。图3是本发明多基因同时操作piggyBac转座子系统用于同时敲低多个基因的一个实施例。图A为同时敲低两个基因(P53基因和PTEN基因)的缺陷piggyBac转座子的示意图。图B：稳定携带该转座子的H1人类胚胎干细胞，其内源P53和PTEN基因的表达量被同时敲低。图B中的western印迹实验选用β-微管蛋白作为内参。图4是本发明多基因同时操作piggyBac转座子系统用于过表达一个基因同时敲低另一个基因的一个实施例。图A为过表达一个基因(红荧光蛋白DsRed2)同时敲低另一个基因(GAPDH基因)的缺陷piggyBac转座子的示意图。图B：稳定携带该转座子的H1人类胚胎干细胞表达DsRed2红荧光蛋白(图B)的同时其内源GAPDH基因的表达量被敲低(图C)。图C中的western印迹实验选用β-微管蛋白作为内参。具体实施方式本发明提供了一种能介导多基因同时过表达或者敲低的piggyBac转座子系统。本发明使用单一载体对多基因进行同时操作。本发明多基因同时操作piggyBac转座子系统可用于细胞株改造、基因功能研究和基因治疗。下面结合具体实施例，进一步阐明创造和应用本发明的关键步骤。1.多基因同时过表达。本发明应用于多基因同时过表达的一个实施例中，多基因同时操作piggyBac转座子系统被用于同时过表达荧光素酶基因Luc和绿荧光蛋白基因EGFP。在制备本实施例中携带荧光素酶基因Luc和绿荧光蛋白基因EGFP的缺陷piggyBac转座子的过程中，所涉及的质粒抽提，质粒转化，大肠杆菌培养，PCR，酶切，Klenow酶末端补平，连接为本领域人员所熟知的实验。常规实验条件可参照M.R.格林和J.萨姆布鲁克编著的《分子克隆实验指南》第四版。携带荧光素酶基因Luc和绿荧光蛋白基因EGFP的缺陷piggyBac转座子的具体建立步骤是：抗药筛选标记Blast编码基因由pLKO.1-Blast质粒(购自Addgene)酶切获得，装入pcDNA3质粒(购自Addgene)的StuI和BstBI位点间。随后，抗药筛选标记Blast基因 表达盒再通过酶切装入缺陷piggyBac转座子中的NheI位点内，获得PB[Blast]质粒。使用引物EcoLucF(SEQIDNo：1)和2ALucR(SEQIDNo：2)，以pGL3-Basic质粒(购自Promega)为模板，PCR扩增荧光素酶Luc编码基因；使用引物2AGFPF(SEQIDNo：3)和EcoGFPR(SEQIDNo：4)，以pCAG-EGFP质粒(购自Addgene)为模板，PCR扩增绿荧光蛋白EGFP编码基因。使用引物EcoLucF(SEQIDNo：1)和EcoGFPR(SEQIDNo：4)，以Luc和EGFP片段为模板，重叠延伸PCR扩增获得Luc-2A-GFP编码基因。随后，酶切装入pCAG-EGFP质粒的两个EcoRI位点间。鸡β-肌动蛋白复合启动子CAG、Luc-2A-EGFP编码序列和兔β-球蛋白polyA由SalI和HindIII酶切，末端补平后，装入PB[Blast]质粒中的PmeI位点内。最终获得的用于同时过表达荧光素酶基因Luc和绿荧光蛋白基因EGFP的piggyBac转座子PB[Blast，Luc-2A-GFP]如图2所示。在应用PB[Blast，Luc-2A-GFP]转座子同时过表达荧光素酶基因Luc和绿荧光蛋白基因EGFP的一个具体实施例中，PB[Blast，Luc-2A-GFP]转座子在人胚胎干细胞中同时过表达Luc和EGFP。人胚胎干细胞培养于Matrigel(购自BDPharmingen)包被的培养皿上，培养基的成分为：DMEM/F12(购自Gibco)，1％非必需氨基酸，1％L型谷氨酰胺(购自Invitrogen)，50ng/mL成纤维细胞生长因子(购自Millipore)，1xN2添加物和1xB27添加物(购自Invitrogen)。培养箱条件设定为37℃，5％CO2，5％O2，90-95％湿度。将PB[Blast，Luc-2A-GFP]转座子的核酸和编码piggyBac转座酶的核酸各1ug与10uLLipofectamine2000脂质体(购自Invitrogen)混合于500uLOpti-MEM培养基中。收集106H1人类胚胎干细胞悬浮于核酸脂质体混合液，37℃转染孵育15分钟。随后，将被转染的H1人类胚胎干细胞置于含2mL培养基并由Matrigel包被的6孔板内培养，并在培养基中加入1μg/mlBlasticidine(购自Invitrogen)，药物筛选两周，得到携带转座子的H1人类胚胎干细胞。携带PB[Blast，Luc-2A-GFP]转座子的H1人类胚胎干细胞同时过表达荧光素酶基因Luc和绿荧光蛋白基因EGFP。其中绿荧光可使用Nikon荧光显微镜用蓝光照射观察，如图2所示。检测荧光素酶表达的具体方法是：在培养基中加入150ug/mL荧光素酶底物D-luciferin(购自Sigma)，随后使用XenogenIVISspectrum成像仪观察荧光信号，如图2所示。2.多基因同时敲低。本发明应用于多基因同时敲低的一个实施例中，多基因同时操作piggyBac转座子系 统被用于同时敲低内源P53基因和PTEN基因。携带P53基因和PTEN基因敲低构建的缺陷piggyBac转座子的具体建立步骤是：分别以含有靶向P53基因和PTEN基因的短发夹RNA编码序列的寡核苷酸shP53(SEQIDNo：5)和shPTEN(SEQIDNo：6)为模板，使用引物TRIPZF(SEQIDNo：7)和TRIPZR(SEQIDNo：8)，用VENT聚合酶(购自NewEnglandBiolabs)PCR扩增。上述PCR反应的反应体系和反应条件如表1和表2所示。PCR扩增后的产物酶切装入pTRIPZ(购自Openbiosystems)的XhoI和EcoRI位点间。表1：PCR扩增短发夹RNA编码序列的反应体系。10xThermoPol缓冲液(购自NEB)5uLDMSO2.5uL10mMdNTP1uL10uMTRIPZF引物2.5uL10uMTRIPZR引物2.5uL100ng/uLshP53或shPTEN模板DNA1uL100mMMg2SO41uL2U/uLVENT聚合酶1uL水33.5uL总体积50uL表2：PCR扩增短发夹RNA编码序列的反应条件。将P53基因和PTEN基因敲低构建从pTRIPZ质粒骨架上通过ClaI和MluI酶切，末端补平，先后装入pcDNA3(购自Addgene)质粒的HindIII位点和BamHI位点。随后通过酶切将巨细胞病毒早期启动子CMV、P53基因和PTEN基因敲低构建shP53和shPTEN，以及牛生长激素polyA装入PB[Blast]质粒的PmeI位点内。最终获得的用于同时敲低内源P53基因和PTEN基因的piggyBac转座子PB[Blast，shP53，shPTEN]如图3所示。在应用PB[Blast，shP53，shPTEN]转座子同时敲低内源P53基因和PTEN基因的一个具体实施例中，PB[Blast，shP53，shPTEN]转座子在H1人类胚胎干细胞中同时敲低内源P53基因和PTEN基因。将PB[Blast，shP53，shPTEN]转座子的核酸和编码piggyBac转座酶的核酸各1ug与10uLLipofectamine2000脂质体(购自Invitrogen)混合于500uLOpti-MEM培养基中。收集106H1人类胚胎干细胞悬浮于核酸脂质体混合液，37℃转染孵育15分钟。随后，将被转染的H1人类胚胎干细胞置于含2mL培养基并由Matrigel包被的6孔板内培养，并在培养基中加入1μg/mlBlasticidine(购自Invitrogen)，药物筛选两周，得到携带转座子的H1人类胚胎干细胞。携带PB[Blast，shP53，shPTEN]转座子的H1人类胚胎干细胞其内源P53基因和PTEN基因的表达量被降低。检测内源基因表达量的方法是Western印迹实验，其中涉及的SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，免疫杂交，和显色为本领域人员所熟知的实验。常规实验条件可参照Abeam公司提供的Western印迹实验说明书。检测内源P53基因和PTEN基因的表达量时，使用的P53和PTEN抗体(购自CellSignaling)的稀释比例皆为1∶1000。内参β-微管蛋白抗体(购自Abcam)的稀释比例为1∶5000。3.同时过表达一些基因敲低另一些基因。本发明应用于同时过表达一些基因敲低另一些基因的一个实施例中，多基因同时操作piggyBac转座子系统被用于同时过表达DsRed2红色荧光蛋白并敲低GAPDH基因。携带DsRed2红荧光蛋白表达盒和GAPDH基因敲低构建的缺陷piggyBac转座子的具体建立步骤是：DsRed2红荧光蛋白由pDsRed2-N1质粒通过AgeI和NotI酶切，末端补平后装入pcDNA3质粒(购自Addgene)的HindIII位点。以靶向GAPDH基因的短发夹RNA编码序列的寡核苷酸shGAPDH(SEQIDNo：9)为模板，使用引物TRIPZF(SEQIDNo：7)和TRIPZR(SEQIDNo：8)，用VENT聚合酶(购自NewEnglandBiolabs)PCR扩增。PCR扩增后的产物酶切装入pTRIPZ(购自Openbiosystems)的XhoI和EcoRI位点间。将GAPDH基因敲低构建从pTRIPZ质粒骨架上通过ClaI和MluI酶切，末端补平，装入pcDNA3(购自Addgene)质粒的BamHI位点。随后通过酶切将巨细胞病毒早期启动子CMV、DsRed2红荧光基因编码序列、GAPDH基因敲低构建shGAPDH，以及牛生长激素polyA装入PB[Blast]质粒的PmeI位点内。最终获得的用于同时过表达DsRed2红荧光蛋白并敲低内源GAPDH基因的piggyBac转座子PB[Blast，DsRed，shGAPDH]如图4所示。在应用PB[Blast，DsRed，shGAPDH]转座子同时过表达DsRed2红荧光蛋白并敲低内源GAPDH基因的一个具体实施例中，PB[Blast，DsRed，shGAPDH]转座子在H1人类胚胎干细胞中同时过表达DsRed2红荧光蛋白并敲低内源GAPDH基因。将PB[Blast，DsRed，shGAPDH]转座子的核酸和编码piggyBac转座酶的核酸各1ug与10uLLipofectamine2000脂质体(购自Invitrogen)混合于500uLOpti-MEM培养基中。收集106H1人类胚胎干细胞悬浮于核酸脂质体混合液，37℃转染孵育15分钟。随后，将被转染的H1人类胚胎干细胞置于含2mL培养基并由Matrigel包被的6孔板内培养，并在培养基中加入1μg/mlBlasticidine(购自Invitrogen)，药物筛选两周，得到携带转座子的H1人类胚胎干细胞。携带PB[Blast，DsRed，shGAPDH]转座子的H1人类胚胎干细胞过表达DsRed2红荧光蛋白的同时其内源GAPDH基因的表达量被降低。其中红色荧光可使用Nikon荧光显微镜用绿光照射观察，如图4所示。检测内源GAPDH基因表达量的方法是Western印迹实验，其中使用的GAPDH抗体(购自Abcam)的稀释比例为1∶1000。内参β-微管蛋白抗体(购自Abcam)的稀释比例为1∶5000。在本发明的另一些实施例中，多基因同时操作转座子系统可以通过磷酸钙转染、聚乙二醇-聚乙烯亚胺共聚物转染、或电穿孔转染导入体外培养的动物细胞。在本发明的另一些实施例中，多基因同时操作转座子系统可以被装入病毒载体。这里所述的病毒载体包括但不限于腺病毒、腺相关病毒，反转录病毒，慢病毒和单纯疱疹病毒。随后，对携带转座子系统的病毒进行包装，并感染导入靶细胞或哺乳动物体内。在本发明的另一些实施例中，多基因同时操作转座子系统可以通过纳米颗粒导入哺乳动物体内。在本发明的另一些实施方式中，多基因同时操作转座子系统可以通过上呼吸道，肌肉注射，静脉注射导入哺乳动物体内。在本发明的另一些实施方式中，多基因同时操作转座子系统可以先行导入离体的成纤维细胞、血液细胞(包括：造血干细胞或各祖细胞)、间质干细胞、诱导多能干细胞，随后将细胞植入哺乳动物体内。在本发明的另一些实施方式中，多基因同时操作转座子系统可以在导入对治疗有价值的基因(包括但不限于腺苷脱氨酶，凝血因子VIII，β-球蛋白，血红蛋白，抗肌萎缩蛋白，α-抗胰蛋白酶，低密度蛋白受体，囊性纤维化跨膜通道调节因子，嵌合抗原受体)的同时，过表达自杀基因(如：可诱导型Caspase-9)以提高基因治疗安全性。在本发明应用于基因治疗的一些更具体实施方式中，多基因同时操作转座子系统可以在T细胞中导入对嵌合抗原受体CAR的同时，过表达各类白介素、趋化因子，或敲低治疗辅助靶点(如：程序性死亡受体PD-1和T细胞受体TCR)，以提高CAR-T治疗经济性，有 效性和广谱性。当前第1页1 2 3