本发明涉及农业和生物
技术领域：
，尤其涉及一种创制光温敏不育系的方法及其在植物育种中的应用。
背景技术：
：在农业生产中，由于传统去雄手段耗时费力，雄性不育系在杂交制种，提高农业产量中有巨大的优势。雄性不育往往被分为细胞质雄性不育(CMS)以及细胞核雄性不育(GMS)。三系杂交体系的建立依赖于细胞质雄性不育。然而，有几个缺点阻碍了三系配套杂交在实践中的广泛应用。首先，细胞质雄性不育植株普遍存在着品质较差的的问题；其次，三系杂交水稻的组合增产潜力越来越小。再次，由于野败类型的雄性不育细胞质单一，一旦胞质不育丧失或某种毁灭性病虫害发生，会造成巨大损失。随着细胞核雄性不育中光温敏条件性雄性不育的发现，两系法杂交水稻应运而生。相对于三系杂交法，光温敏不育系兼有不育系和保持系两种状态。与三系法相比，两系法具有不受恢保关系的限制，既核不育可以与大量常规品种杂交，配组自由，因而更容易获得优良性状的杂交优势，从根本上解决三系中雄性不育细胞质单一化的问题。近年来，两系杂交水稻在中国农业生产中的应用越来越广泛。早在1973年,石明松在中国湖北省从晚粳品种(Oryzasativassp.japonica)农垦58中选育出光敏感不育系并提出了一系两用的水稻杂种优势利用新途径。随后，以农垦58S(NK58S)为父本，与籼稻杂交获得的培矮64S(PA64S)也在两系杂交中得到广泛应用。但培矮64S的育性对于温度的变化更加敏感。在水稻中，光温敏不育系受到单基因隐性位点控制。最近的研究表明，农垦58S与培矮64S的不育性状受到同一个遗传位点的控制，而温度和光照都会对该位点产生影响，这些发现使人们对光温敏育性转换的分子机制更加难以理解。目前为止，水稻中共有十三个光温敏不育系被发现：pms1,pms2,pms3,rpms1,rpms2,tms1,tms2,tms3,tms4,tms5,tms6,rtms1以及Ms-h，分别定位在第7,3,12,8,9,8,7,6,2,2,5,10和9条染色体上。光温敏不育在番茄，玉米以及小麦中也有报道。最近的研究发现，一个突变的小RNA(smallRNA),osa-smR5864m,导致pms2以及p/tms2-1(农垦58S和培矮64S)突变体的不育表型。然而，光温敏不育的分子机理仍然不清楚，使得人们缺乏有效的理论支持和技术手段来解决两系育种中实际问题。鉴于拟南芥较小的基因组，快速的生长周期以及大量的突变体库等无可比拟的优势，使其在植物生物学研究领域成为模式植物。此外，拟南芥能够在严格控制温度，光照等条件的狭小空间中进行培养。前人的研究发现了一些拟南芥条件不育突变体，如PEAMT基因突变体t365以及GA/IAA生物合成受阻的ms33突变体都表现为温敏不育表型。然而，目前本领域中尚缺少调控方式简便的植物不育系用于植物育种过程中，因此迫切需要调控方式简单方便的植物不育系培育技术。技术实现要素：本发明的目的是提供一种培育植物光温敏不育系的方法，包括降低花粉发育相关的酰基辅酶A连接酶表达或活性来创制光温敏植物材料,从而解决目前核不育光温敏遗传位点少，制种纯度不高的问题。在本发明的第一方面，提供了一种培育植物不育系的方法，包括步骤：降低所述植物植株中花粉发育相关的酰基辅酶A连接酶的表达或活性。在另一优选例中，所述的酰基辅酶A连接酶参与所述植物的花粉发育过程的脂类代谢。在另一优选例中，所述的酰基辅酶A连接酶将脂肪酸与辅酶A(CoA)形成硫酯键(acyl－CoA)。在另一优选例中，所述的“降低”是指将所述植株中在花粉发育过程中酰基辅酶A连接酶的表达活性降低满足以下条件：A1/A0的比值≤80％，较佳地≤60％，更佳地≤40％，最佳地为0-30％；其中，A1为所述植株中花粉发育相关的酰基辅酶A连接酶活性；A0为野生型同种类型植物植株中相同酰基辅酶A连接酶的酶活性。在另一优选例中，所述酰基辅酶A连接酶为ACOS5或其同源蛋白。在另一优选例中，所述ACOS5的野生型氨基酸序列选自下组：SEQIDNO.:1、SEQIDNO.:2、SEQIDNO.:3、SEQIDNO.:4、SEQIDNO.:5和SEQIDNO.:6。在另一优选例中，所述酰基辅酶A连接酶是选自下组的细胞、组织或器官中特异性表达的：植物花序以及花药中。在另一优选例中，所述细胞或组织包括：绒毡层。在另一优选例中，所述酰基辅酶A连接酶在花药发育期特异性表达。在另一优选例中，所述的花药发育期包括前花药形成阶段(-3天～0天)、花药形成阶段、后花药形成阶段(花药形成后1-5天)。在另一优选例中，所述酰基辅酶A连接酶在花药发育第6期特异表达。在另一优选例中，所述酰基辅酶A连接酶在花粉减数分裂期达到表达最高峰。在另一优选例中，所述降低植物植株中花粉发育相关的酰基辅酶A连接酶活性的方法包括：使酰基辅酶A连接酶编码基因的表达水平下降、和/或使酰基辅酶A连接酶活性下降。在另一优选例中，所述的下降指与野生型酰基辅酶A连接酶的表达水平E0相比，所述植株中花粉发育相关的酰基辅酶A连接酶的表达水平E1为野生型的0-80％，较佳地0-60％，更佳地0-40％；和/或与野生型的花粉发育相关的酰基辅酶A连接酶的酶活性A0相比，所述植株中花粉发育相关的酰基辅酶A连接酶的酶活性A1为野生型的0-80％，较佳地0-60％，更佳地0-40％。在另一优选例中，所述的降低植株中酰基辅酶A连接酶活性通过选自下组的方式实现：基因突变、基因敲除、基因中断、RNA干扰技术、或其组合。在另一优选例中，所述酰基辅酶A连接酶编码基因为ACOS5基因。在另一优选例中，所述ACOS5基因能够编码SEQIDNO.:1、SEQIDNO.:2、SEQIDNO.:3、SEQIDNO.:4SEQIDNO.:5或SEQIDNO.:6所示氨基酸序列。在另一优选例中，所述方法包括步骤：降低所述植株中ACOS5基因的表达水平、缺失ACOS5基因和/或致ACOS5基因突变来实现降低植株中酰基辅酶A连接酶的表达或活性。在另一优选例中，所述的植物包括农作物、林业植物、花卉；优选地包括禾本科，豆科以及十字花科植物，更优选地包括水稻、玉米、高粱、小麦、大豆或拟南芥。在另一优选例中，所述的植物选自：十字花科(Brassicaceae)植物、鼠耳芥属(Arabidopsis)植物或拟南芥(A.thaliana)。本发明的第二方面，提供了一种花粉发育相关的酰基辅酶A连接酶或其编码基因的用途，用于培育植物不育系、或用于制备培育植物不育系的试剂或试剂盒。在另一优选例中，所述的编码基因为ACOS5基因。在另一优选例中，所述ACOS5基因能够编码SEQIDNO.:1、SEQIDNO.:2、SEQIDNO.:3、SEQIDNO.:4、SEQIDNO.:5或SEQIDNO.:6所示氨基酸序列。本发明的第三方面，提供了一种将植物从不育转为可育的方法，包括步骤：降低花粉壁所需脂类的合成速度、和/或延缓花粉发育速度。在另一优选例中，所述的植物是花粉发育相关的酰基辅酶A连接酶的表达或活性水平下降的植物。在另一优选例中，所述植物为根据权利要求上述任一项所述的方法培育的植物不育系。在另一优选例中，所述方法包括：延缓植株以及花粉的发育。在另一优选例中，所述方法包括：降低植株代谢水平，从而降低花粉壁合成速度。在另一优选例中，所述降低或延缓是通过以下方式实现：降低植株生长的环境温度、减少植株的光照时间、或组合。在另一优选例中，降低植株生长的环境温度包括将环境温度(平均温度)控制在17-22℃，更优选地为17-20℃，如17℃、18℃、19℃或20℃。在另一优选例中，降低植株生长的环境温度的时间包括花药形成阶段，花粉成熟阶段以及开花授粉阶段，或其前后2周。在另一优选例中，在植株抽薹或抽穗时开始降低植株的生长温度，低温培育3-10天后，恢复正常温度培育。本发明的第四方面，提供了一种植物育种方法，包括维持植株不育的步骤；将植株由不育转为可育的步骤；和，维持植株可育并育种的步骤；在所述维持植株不育的步骤中，包括，对根据本发明第一方面的方法培育的植物不育系进行维持；在将植株由不育转为可育的步骤中，包括，利用根据本发明第三方面的方法将植株由不育转为可育。本发明的第五方面，提供了一种植物细胞，所述植物细胞发育成的植株中花粉发育相关的酰基辅酶A连接酶的表达或活性降低。在另一优选例中，所述酰基辅酶A连接酶为ACOS5。本发明优点为：(a)提供了一种通过降低植物中花粉发育相关的酰基辅酶A连接酶的表达或活性来创制植物不育系的方法。(b)提供了一种通过延缓花粉发育速度来使不育植株的性状转化为可育的方法。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1为低温能够恢复雄性不育acos5突变体的育性的图片；A野生型植株的正常可育表型。在正常条件下(24℃)，acos5-2，acos5-3突变体的短小果荚不含种子。低温条件(17℃)下acos5-2,acos5-3突变体植株完全恢复育性。B.野生型和acos5突变体花药的亚历山大染色。野生型的花药在(24℃)及(17℃)条件下皆充满了紫色有活力的花粉。在acos5-2及acos5-3突变体中，(24℃)条件下，花药中只有绿色的残余物质，表明花粉败育。但在(18℃)条件下，突变体花粉恢复正常。图2本发明ACOS5编码一个酰基辅酶A连接酶的基因结构图；A.acos5突变体的图位克隆精细定位区间。B.ACOS5基因结构信息以及突变体的突变位点。图3为本发明恢复突变体花粉发育阶段的半薄切片分析图；野生型,acos5(24℃)以及acos5(17℃)花药的半薄切片。A-D,M-O为野生型药室，E-H,P-R为在24℃条件下的acos5突变体药室，I-L,S-U为在17℃条件下的acos5突变体药室。在第6-7期花药中，野生型和acos5(24℃或17℃)突变体花药没有可观察到的区别。在第8期，野生型和acos5(24℃或17℃)突变体药室中，小孢子成功的从四分体中释放。在第9期，在acos5(24℃)中有些小孢子开始降解，然而在acos5(17℃)中的小孢子与野生型的一致。在第10期，大多数acos5(24℃)的小孢子空泡化并且降解。然而，acos5(17℃)中大部分恢复的小孢子较为正常。在第11期，acos5(24℃)的小孢子在药室中完全降解，但在17℃条件下，除了个别败育的小孢子，acos5药室中存在大量正常的花粉粒。在第12期，acos5(17℃)中出现成熟花粉粒，但是在acos5(24℃)仅有降解的细胞残余紧贴于药室内壁。Ep,表皮层；En,药室内壁；ML,中间层；Msp,小孢子；PG,花粉粒；T,绒毡层；Tds,四分体。Bar＝20um。图4为本发明acos5突变体及恢复植株的花粉扫描电镜分析图；野生型和acos5(24℃或17℃)突变体花粉发育的扫描电镜观察。野生型的花药中含有许多正常的花粉,外壁结构正常。而acos5(24℃)突变体中则没有花粉。恢复植株acos5(17℃)也有许多成熟花粉,但花粉外壁结构仍有部分异常。图5为本发明显示野生型，突变体及恢复植株花粉发育的透射电镜分析图；野生型(A-C)和acos5(24℃)(D-F)以及acos5(17℃)(G-I)花粉发育的超显微结构。在第7期野生型和acos5(24℃或17℃)突变体的四分体发育正常,突变体中的初生外壁沉积与野生型一致。在第8期，野生型中释放的小孢子形成外壁外层，而acos5(24℃)中小孢子则开始出现空泡化现象，在恢复植株acos5(17℃)中，能形成稍有缺陷的外壁外层。在第9期(即空泡期)，acos5(24℃)完全缺失花粉外壁结构，小孢子破碎并伴随细胞质泄漏。相反，acos5(17℃)的小孢子则具有较完好的花粉外壁结构，能够正常发育。Ba,柱状结构；I,内壁；Msp,小孢子；Ne,外壁内层；PC,花粉包被；PG,花粉粒；RM,残余；Tc,顶盖结构。Bars＝5um。图6显示原核表达的野生型ACOS5以及突变体mACOS5的重组蛋白；A.ACOS5及mACOS5在大肠杆菌诱导表达的电泳图。1-3泳道分别为野生型ACOS5的未加IPTG诱导，加入IPTG诱导以及纯化后的重组蛋白；4-6泳道分别为突变体mACOS5的未加IPTG诱导，加入IPTG诱导以及纯化后的重组蛋白；7号泳道为分子量标记。B.利用载体His重组蛋白进行的westernblot检测。图7为ACOS5蛋白具有酰基辅酶A连接酶活性图；利用Luciferase-BasedAssay方法来检测酰基辅酶A连接酶，活性空白对照(BLANK)体系中，酶活反应后体系中剩余的ATP的含量为100％，野生型蛋白ACOS5的ATP剩余量为60％，突变体蛋白mACOS5的ATP剩余量为90％，显示其酶活性明显降低。图8为ACOS5的表达并不受到温度的诱导对比图.；A.野生型(24℃/17℃)和acos5-2及acos5-3突变体(24℃/17℃)花序RNA中ACOS5基因表达的半定量RT-PCR。B.野生型(24℃/17℃)和acos5-2及acos5-3突变体(24℃/17℃)花序RNAACOS5基因表达的定量RT-PCR。图9为低温延缓了花粉膨胀期的生长速度对比图；A.花粉发育可分为四个时期(小孢子释放期，单核细胞期，双核细胞期和三核细胞期)。左图展示了不同时期花苞的大小。在不同时期小孢子发育的大小则位于右图上方。这些小孢子的DAPI染色揭示了它们的发育阶段并在右图下方加以展示。B.在不同发育时期野生型小孢子大小的统计分析,表明小孢子发育阶段其表面积快速增长。C.在不同外界温度下野生型小孢子的平均生长速率，表明在低温条件能够显著减缓小孢子的发育进程。图10为通过减缓花粉发育的时间能够恢复acos5突变体的育性的对比图；A.常温下不同时间段的拟南芥野生型与chlm-4突变体的花粉直径统计，表明其突变体花粉的发育比野生型缓慢。B.chlm-4与acos5的双突变体在常温下能够部分恢复育性。图11为不同物种中ACOS5基因的蛋白序列相似性以及进化分析图，蛋白序列比对表明ACOS5直系同源基因的氨基酸序列非常保守，大多在60％以上，进化分析表明，不同物种中的直系同源蛋白在双子叶植物和单子叶植物有清晰的分岔，有共同的起源。图12为水稻中OsACOS5的突变导致了雄性不育的表型图；A.水稻OsACOS5基因结构信息以及突变体的突变位点。B.野生型穗状花中有饱满黄色的正常花药。C.osacos5突变体的花药呈白色瘦小。D.亚历山大染色显示野生型花药中充满花粉粒。E.亚历山大染色显示突变体花药中不含花粉粒。具体实施方式本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，对于某些特定的植物不育系，通过调控花粉发育相关的酰基辅酶A连接酶的表达或活性，可以调控所述植株的育性，实现不育性与育性之间进行可控的转换。本发明人还开发了相应的培育植物不育系等多种在农业育种等方面有广泛应用价值的技术。在此基础上完成了本发明。在实验中，申请人发现拟南芥ACOS5基因(Acyl-CoASynthetase)编码了一个酰基辅酶A连接酶并参与到花粉发育中的脂类代谢过程中，该基因的缺失使得突变体在正常生长条件下(24℃，16小时光照/8小时黑暗)显示完全不育的表型。而低温和短日照减缓了花粉的生长速度和脂类代谢过程，使突变体克服了该基因的缺失造成的脂类代谢缺陷，使花粉安全度过快速膨胀期。ACOS5基因编码一个酰基辅酶A连接酶，这是一类在不同物种中都存在的保守蛋白，其主要功能为利用中长链的羟基化脂肪酸生成辅酶A的酯类(Kienowetal.,2008)。在拟南芥中，前期研究已经发现该基因在绒毡层中特异表达，其功能缺失导致雄性完全不育表型(acos5-1)。细胞学分析发现该突变体花粉外壁形成异常，缺乏孢粉素覆盖(deAzevedoSouzaetal.,2009)。但迄今为止，还没有ACOS5与光温敏不育相关的工作被报道。适用于本发明的花粉发育相关的酰基辅酶A连接酶没有特别限制，可以是来自任何植物品种，代表性的植物包括，但并不限于：水稻(基因号：Os04g24530与拟南芥直系同源ACOS5蛋白同源性为64％)、大麦(基因号：MLOC_6813与拟南芥直系同源ACOS5蛋白同源性为66％)、苜蓿(基因号：MTR_3g460770与拟南芥直系同源ACOS5蛋白同源性为73％)、番茄(基因号：Solyc02g088710与拟南芥直系同源ACOS5蛋白同源性为72％)、葡萄(基因号：VIT_01s0010g03720与拟南芥直系同源ACOS5蛋白同源性为76％)、小麦(基因号：TRIUR3_19356与拟南芥直系同源ACOS5蛋白同源性为66％)。如图11所示，不同物种中ACOS5基因的蛋白序列相似性以及进化分析中可以看出该基因在不同物种中的的保守性较强，拟南芥中该基因的突变会造成不育性状，因此，对该基因进行分子遗传操作将可以用于培育其它物种的不育系。拟南芥ACOS5蛋白序列如SEQIDNO.:1所示，编码拟南芥ACOS5蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.:8所示。水稻ACOS5蛋白序列如SEQIDNO.:2所示，编码水稻ACOS5蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.:9所示。大麦ACOS5蛋白序列SEQIDNO.:3所示，编码大麦ACOS5蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.:10所示。小麦ACOS5蛋白序列如SEQIDNO.:4所示，编码小麦ACOS5蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.:11所示。苜蓿ACOS5蛋白序列如SEQIDNO.:5所示，编码苜蓿ACOS5蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.:12所示。番茄ACOS5蛋白序列如SEQIDNO.:6所示，编码番茄ACOS5蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.:13所示。葡萄ACOS5蛋白序列如SEQIDNO.:7所示，编码葡萄ACOS5蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.:14所示。在一方面，本发明提供一种培育植物不育系的方法，包括步骤：降低所述植物植株中花粉发育相关的酰基辅酶A连接酶的表达或活性。术语“酰基辅酶A连接酶”、“酰基辅酶A连接酶多肽”、“酰基辅酶A连接酶蛋白”等可互换使用，指具有酰基辅酶A连接酶蛋白氨基酸序列(如SEQIDNO:1-7)的蛋白或多肽。在未特别指出时，术语“酰基辅酶A连接酶蛋白”包括野生型和突变型酰基辅酶A连接酶蛋白。本发明的酰基辅酶A连接酶可包含SEQIDNO:1-7所示氨基酸的序列。然而，不限于此，因为根据植物种类或品种，该蛋白的氨基酸序列可能有所不同。换言之，其可以是突变型蛋白或人工变体，所述突变型蛋白或人工变体的氨基酸序列在SEQIDNO:1-7所示氨基酸序列的一个或多个位置包含一个或几个氨基酸的取代、缺失、插入或添加，只要有助于通过弱化该蛋白的活性而培育植物不育系。本文的“几个”可根据蛋白中氨基酸残基的三维结构的位置或类型而有所不同，但尤其表示2-20，特别是2-10，更特别是2-5。此外，根据植物的个体或种类，氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒置包括人工变体或天然突变所致的那些。可通过以下方式降低(弱化)本发明酰基辅酶A连接酶的活性：1)编码该蛋白的多核苷酸的部分或完全缺失，2)修饰表达调控序列以降低该多核苷酸的表达，3)修饰染色体上的序列或4)它们的组合。在上文中，可利用染色体基因插入的载体，通过将编码内源性靶蛋白的多核苷酸替换为标记基因或部分核苷酸序列缺失的多核苷酸来实施编码蛋白的多核苷酸的部分或完全缺失。“部分”缺失的长度可根据多核苷酸的种类而有所不同，但尤其是2bp-300bp，更特别是2bp-100bp，更特别是1bp-5bp。还可通过以下方式修饰表达调控序列来降低多核苷酸表达：通过核苷酸序列的缺失、插入、保守或非保守性取代或它们的组合在表达调控序列中诱导突变以进一步弱化表达调控序列的活性，或将表达调控序列替换成活性更低的序列。表达调控序列包括编码启动子的序列、操纵子序列、核糖体结合位点和控制转录和翻译终止的序列。此外，可通过以下方式修饰染色体上的多核苷酸序列以弱化蛋白的活性：通过核苷酸序列的缺失、插入、保守或非保守性取代或它们的组合在序列中诱导突变以进一步弱化该序列的活性，或将多核苷酸序列替换成经修饰的序列以便获得更弱的蛋白活性。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。如本文所用，“分离的酰基辅酶A连接酶蛋白或多肽”是指酰基辅酶A连接酶蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化拟南芥水稻等植物中酰基辅酶A连接酶蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。本发明还包括酰基辅酶A连接酶蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然酰基辅酶A连接酶蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是：(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的；(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽；(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽；(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。在本发明的优选地实施方式中，“酰基辅酶A连接酶蛋白”或“酰基辅酶A连接酶多肽”序列如SEQIDNO:1-7所示。该术语还包括具有与酰基辅酶A连接酶蛋白相同功能的、SEQIDNO:1-7序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括酰基辅酶A连接酶蛋白或多肽的活性片段和活性衍生物。该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨度的条件下能与酰基辅酶A连接酶蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含酰基辅酶A连接酶蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了酰基辅酶A连接酶蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有酰基辅酶A连接酶蛋白序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。在本发明中，“酰基辅酶A连接酶保守性变异多肽”指与SEQIDNO:1-7所示的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。表1最初的残基代表性的取代优选的取代Ala(A)Val；Leu；IleValArg(R)Lys；Gln；AsnLysAsn(N)Gln；His；Lys；ArgGlnAsp(D)GluGluCys(C)SerSerGln(Q)AsnAsnGlu(E)AspAspGly(G)Pro；AlaAlaHis(H)Asn；Gln；Lys；ArgArgIle(I)Leu；Val；Met；Ala；PheLeuLeu(L)Ile；Val；Met；Ala；PheIleLys(K)Arg；Gln；AsnArgMet(M)Leu；Phe；IleLeuPhe(F)Leu；Val；Ile；Ala；TyrLeuPro(P)AlaAlaSer(S)ThrThrThr(T)SerSerTrp(W)Tyr；PheTyrTyr(Y)Trp；Phe；Thr；SerPheVal(V)Ile；Leu；Met；Phe；AlaLeu本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQIDNO:8-14所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQIDNO:1-7的蛋白质，但与SEQIDNO:8-14所示的编码区序列有差别的核酸序列。编码SEQIDNO:1-7的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。在一个优选地实施方式中，所述的酰基辅酶A连接酶多肽的编码序列选自下组：(1)编码如SEQIDNO:1-7所述多肽的多核苷酸序列；(2)如SEQIDNO:8-14所示的多核苷酸序列；(3)与(1)或(2)所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码该多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上,更好是95％以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQIDNO:1-7所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码酰基辅酶A连接酶蛋白的多聚核苷酸。本发明的酰基辅酶A连接酶蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或GDSL蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的水稻酰基辅酶A连接酶蛋白。一般来说有以下步骤：(1).用本发明的编码酰基辅酶A连接酶蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。本发明中，酰基辅酶A连接酶蛋白多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含酰基辅酶A连接酶蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得耐受性改变的植物。获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析。用酰基辅酶A连接酶蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测酰基辅酶A连接酶蛋白的转录产物。本发明的主要优点包括：(a)提供了一种通过降低植物中花粉发育相关的酰基辅酶A连接酶的表达或活性来创制植物不育系的方法。(b)提供了一种通过延缓花粉发育速度来使不育植株的性状转化为可育的方法。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)或植物分子生物学-实验手册(PlantMolecularBiology-ALaboratoryMannual,MelodyS.Clark编,Springer-verlagBerlinHeidelberg,1997)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。材料与方法植物材料与种植本发明中拟南芥材料为Lersbergerecta背景。EMS突变株的诱变和筛选参照Zhangetal.2007。4℃条件下，种子预萌发于0.1％琼脂糖培养基上72小时。植物材料培养于蛭石中，培养条件则为：室温24℃，光培养16小时/暗培养8小时(正常条件),直至抽苔。之后，抽苔株转移至光照培养箱中低温培养(17℃-22℃)。对于不同光周期，抽苔株在室温24℃下，分别于光培养12小时/暗培养12小时；光培养10小时/暗培养14小时或者是光培养8小时/暗培养16小时进行处理。细胞学分析用尼康数码相机(D-7000)拍摄植物材料。亚历山大染色与DAPI染色可参考Alex和er,1969；Rossetal.,1996。对于半薄切片，选取花苞不同发育阶段进行固定并包埋于Spurr环氧树脂中(具体方法可参考Zhangetal.,2007)。使用PowertomeXL(RMCProducts,Tucson,Arizona,USA)切片机进行每1μm切片并用甲苯胺蓝进行染色。使用OlympusDX51数码相机(Olympus,Japan)进行花药切片的拍摄。将8nm金颗粒包裹新鲜雄蕊和花粉粒材料进行扫描电镜实验，并利用JSM-840显微镜(JEOL,Japan)观察。对于透射电镜实验，将拟南芥花絮冰上固定于固定液中(配方是：含有2.5％戊二醛的0.1M磷酸缓冲液，pH7.2)。花苞材料则进一步依次包埋至树脂(‘HardPlus’EmbeddingResin,UniteKingdom)中(具体方法可参考Zhangetal.,2007)。超薄切片(50-70nm)则利用JEM-1230透射电子显微镜(JEOL,Japan)进行观察。RNA抽提和定量RT-PCR总RNA可利用Trizol试剂(Invitrogen,USA)由成熟土培拟南芥植物花组织进行提取。利用poly-dT(12–18)引物；MMLV反转录酶和相应试剂将5μg的RNA反转第一条cDNA链(60分钟，42℃)。合成好的cDNA链作为PCR的模板。定量RT-PCR则是利用SYBRGreenImastermix(Toyobo,Japan)通过ABIPRISM7300系统(AppliedBiosystems,USA)进行检测。定量RT-PCR的程序参数是：95℃5分钟，94℃10秒变性40个循环,60℃退货延伸1分钟。定量RT-PCR中所使用的引物列表于电子版的附件中。β-Tubulin则作为对照。WesternBlotting杂交将蛋白样品进行10％SDS-PAGE电泳，110V恒压电泳90min。电泳结束后用半干法电转膜，将电泳好的PAGE胶从电泳板上切下来，小心的转移到转膜板上的硝酸纤维素膜上。膜需要先用甲醇浸透。转膜板里从下至上依次按滤纸、膜、凝胶、滤纸的顺序放好，除去去除气泡。15mA恒流转膜过夜。将膜转移到装有含有5％的脱脂奶粉的TBST中封闭1h。加入一抗(按比例用TBST稀释)，4℃杂交1h。用TBST洗膜，15min每次，洗4次。加入二抗(按比例用TBST稀释)，室温杂交1h。TBST洗膜，15min/次，洗4次。加入显色液，用显影仪拍摄照片保存。蛋白表达与纯化取-70度保存的菌种2μl，接种到5ml相应抗性LB培养基中37度过夜培养。取100μl过夜培养复苏的菌种，接种到100ml相应抗性LB培养基中37度震荡培养4-5h，直至OD600＝0.4-0.5。加入100ul1M的IPTG，18度过夜诱导。4度12000g2min离心收集细菌。反复冻融(-70度冻，37度融)5-6次，破裂细菌，4度12000g20min，收集上清液，用0.45μm的滤膜过滤，-20度保存待用。准备纯化柱子，用3-5个柱床体积的ddH2O清洗柱子中的乙醇。平衡柱子，至少用5个柱床体积的BindingBuffer平衡柱子，流速为1ml/min样品过柱，将待纯化蛋白样品缓慢过柱，速度不宜过快，保持一滴一滴流过柱子。清洗，用10-15个柱床体积的WashBuffer清洗柱子，流速为1ml/min。洗脱，用5个柱床体积的ElutionBuffer洗脱蛋白，可以减少洗脱体积来浓缩蛋白，但不宜小于一个柱床体积，收集洗脱下来的蛋白，-20℃保存备用。酶活性测定利用Luciferase-BasedAssay方法来检测野生型ACOS55及mACOS5蛋白活性。酶催化的反应包括两步：Acid+ATP-----acyl-AMP+PPi；Acyl-AMP+CoA-----acyl-CoA+AMP；整个反应会消耗一个分子的ATP。Luciferase与Luciferin反应会发出荧光，并且由ATP来提供反应所需能量，Luciferase的荧光反应发出荧光的强弱与反应体系中ATP的量成正比。通过该荧光反应来检测4-CL酶活反应后体系中剩余的ATP的含量，从而来反应待测4-CL蛋白的酶活性。操作步骤：1、将待测蛋白在冰上融化后，取适量蛋白，加入Mix1中，混匀，室温静置30min。2、在不同的时间点，迅速取2μl步骤1中反应好的溶液加入已经配置好的Mix2中，混匀。3、用LumatLB9501luminometer测定反应好的Mix2的荧光强度，并记录测定结果。4、根据荧光强度，制作不同样本的Luciferase活性图表，4-CL活性与其成反比。反应体系如下：4-CL催化反应体系(200μl)(Mix1)：荧光素酶检测反应体系(200μl)(Mix2)：实施例1拟南芥acos5-2及acos5-3突变体的不育表型在低温条件下得以恢复发明人利用EMS化学诱变的方式从拟南芥Ler生态型中分离到了acos5-2突变体。同时，在拟南芥Col生态型的T-DNA插入突变体库中筛选到一个外显子插入的突变体acos5-3。在正常的环境温度下(24℃)，纯合的acos5-2突变体的营养生长正常，但育性丧失，只有短小无种子的果荚，如图1A所示。遗传分析表明acos5-2突变体属于孢子体雄性不育，受到单基因隐性位点控制。申请人将acos5-2突变体在24℃培养至抽薹，将其移入18℃连续培养，其后续的果荚皆恢复育性，如图1A所示，而acos5-3突变体在低温下的育性恢复相比点突变acos5-2较为困难。在同样低温条件下，野生型植株的并没有受到影响(结果未显示)。亚历山大染色显示低温条件下acos5-2及acos5-3突变体的花粉被染成紫红色，与野生型相同，如图1B所示，而正常条件下的acos5-2及acos5-3突变体花药内并无可育花粉，如图1B所示。这个结果说明低温能够弥补acos5-2及acos5-3突变体中的雄配子体发育缺陷。实施例2acos5-2的基因定位以及ACOS5基因结构利用本实验室的拟南芥In/Del分子标记，通过对acos5-2突变体F2代中不育表型植株的初步定位，将ACOS5基因位于拟南芥第一条染色体上，与分子标记F7A10紧密连锁。此后又设计了六对精细定位引物：F24O1，F23N19，F16P17(8)，F16P17(Snp-1)，F16M19，F13O11，进一步把ACOS5基因的定位区间缩小在F16P17(23283)和F16P17(23327)两个分子标记间的44KB范围之内，该区间包含了6个候选基因，如图2中A所示。其中At1g62940基因编码一个酰基辅酶A连接酶蛋白。在acos5-2突变体中，在该基因的第三个外显子检测到一个CCA到CTA突变(脯氨酸突变为亮氨酸)的单核苷酸突变，如图2中B所示。对于T-DNA插入突变体acos5-3，申请人使用了TAIL-PCR的方法,对扩增出的边界序列进行了测序，发现acos5-3突变体的第二个外显子存在T-DNA插入，如图2中B所示。申请人利用了遗传互补实验进一步进行验证。克隆了At1g62940基因组片段，包括上游启动子区和下游区域，利用农杆菌介导转化入acos5-2/+杂合的植株。鉴定显示5个转基因株系中的2株为acos5-2/acos5-2背景，这些植株在正常温度(24℃)下恢复了育性形成了正常的果荚(结果未显示)。实施例3低温能够弥补acos5突变体中小孢子发育缺陷为了确定acos5突变体在花粉发育中的缺陷，申请人进行了花药半薄切片。在野生型中，在第6和7期，小孢子母细胞经历减数分裂形成四分体(Sandersetal.,1999)，如图3中A-B所示。随后，小孢子从四分体释放，并逐渐形成了有正常花粉壁的三核花粉粒(图3C-D,M-O)。在常温条件下(24℃)的acos5突变体中，直到花药发育第7期突变体和野生型没有观察到可见差异，这表明突变体雄配子体减数分裂不受影响(图3F)。至花药发育第8期，acos5小孢子从四分体释放，一些小孢子开始出现空泡化现象(图3G)。第10期，大部分acos5小孢子开始降解，如图3中P所示，随后，小孢子的细胞质收缩和瓦解。最终，药室内没有正常的花粉形成，如图3中R所示。另一方面，在低温状态下(17℃)，acos5小孢子在第8期从四分体中释放后，与野生型相比趋于正常，最后除去一小部分的败育花粉外，低温下的药室中产生了正常的成熟花粉粒，如图3中T-U所示。扫描电镜显示，acos5-2突变体在常温条件下(24℃)的药室中没有花粉粒，但其在低温(17℃)条件下的花粉粒数量与野生型基本一致,其花粉外壁结构稍有异常(图4)。透射电镜观察表明在acos5-2小孢子的花粉外壁的结构在低温条件下得以恢复。在四分体时期，在不同条件下，acos5-2小孢子质膜波浪型起伏与野生型相比都较为正常，如图5中A,D,G所示。在小孢子释放时期，野生型形成了较为正常的柱状和顶盖结构构成花粉外壁(图5B),而在正常温度(24℃)下acos5-2的小孢子缺乏正常个的花粉外壁结构，这导致了小孢子后期的破裂降解(图5E-F)。在低温条件(17℃)下，acos5-2小孢子的花粉外壁能够逐渐形成比较正常的棒状和顶盖结构(图5中H-I所示，表明低温能够克服acos5-2突变所带来的外壁合成缺陷。实施例4突变蛋白mACOS5的酰基辅酶A连接酶活性降低，其表达不受到温度诱导为了检测ACOS5蛋白的酶活，申请人利用原核表达系统对其进行表达纯化。由于acos5-2突变体为点突变，申请人同时克隆了野生型ACOS5和突变体的mACOS5基因进行原核表达(图6中A所示,并用His抗体进行了Westernblotting杂交鉴定(图6B)。酰基辅酶A连接酶催化的反应需要偶联ATP水解提供能量，因此我可以通过检测反应体系中剩余ATP的量来指示酶活性。因此Luciferase活性和酰基辅酶A连接酶活性成反比。对ACOS5和mACOS5的酶活性检测发现，acos5-2中突变后的mACOS5蛋白的确还保留有部分酶活性(图7所示。为了阐明acos5突变体温敏的机制，申请人对不同温度条件下的野生型和突变体花苞中ACOS5的转录水平进行了检测。RT-PCR检测表明，常温(24℃)与低温(17℃)条件下野生型和acos5-2突变体的ACOS5在转录水平上没有显著差异，而在T-DNA插入突变体acos5-3中没有表达，如图8中A所示。进一步的定量PCR显示，在野生型和acos5-2突变体中，ACOS5基因在低温(17℃)条件下的表达略高于常温(24℃)条件，但在acos5-3中没有表达，如图8中B所示。鉴于acos5-3的育性相比acos5-2较难恢复，这些结果表明ACOS5的表达和酶活对于花粉壁的形成和花粉的正常发育至关重要。实施例5较低的环境温度会导致拟南芥的花粉发育速度减缓上述的细胞学观察表明在常温(24℃)下大多数acos5突变体小孢子在环形空泡期降解。早期的文献表明拟南芥花粉在成熟过程中体积不断增大。申请人推测在acos5突变体中，小孢子由于不能渡过快速膨胀过程而导致花粉破裂和败育。因此，申请人测定了野生型的小孢子在雄配子体发生过程中的表面积，根据花苞的大小初步将花粉发育过程分为4个时期：小孢子释放期(releasedstage)，单核花粉期(uninucleatestage)，双核花粉期(bicellularstage)以及三核花粉期(tricellularstage)(图9中A所示。数据统计结果表明小孢子从四分体释放后的表面积大约为500um2。而经过第一次有丝分裂后，双核期的小孢子表面积大约扩大了2倍。当形成三核花粉后，花粉表面积增大到了2300um2，如图9中B所示。同时，申请人统计了不同温度下各个时期的生长速度，结果显示在常温条件(24℃)下从小孢子释放期到单核花粉期的小孢子生长速度约为8.6um2/hr；从单核花粉期到双核花粉期的小孢子生长速度约为38.9um2/hr，细胞学分析显示，大多数acos5小孢子的破裂存在于这个阶段；而双核花粉期到三核花粉期的速度为33.7um2/hr。然而，在低温条件(17℃)下，第二阶段的生长速度下降了大约3倍，如图9中C所示。经测定生长速度在野生型和acos5突变体中是相近的。实施例6花粉发育速度减缓能够部分恢复acos5突变体的不育表型拟南芥镁原卟啉Ⅸ甲基转移酶基因chlm-4的点突变体表现出植株黄化的表型，但该突变体的育性正常(Cao等，2010).在常温(24℃)条件下，chlm-4突变体的小孢子发育进程明显慢于野生型，如图10中A所示。以野生型与突变体刚刚释放小孢子为0小时，数据显示48小时之后，野生型小孢子直径从平均12.89μm发育至19.44μm，而chlm-4突变体小孢子从平均12.73μm发育至18.06μm。96小时之后，野生型小孢子直径增加至25.03μm，而chlm-4突变体小孢子仅增至22.35μm，如图10A所示。申请人构建的chlm-4acos5-2双突变体在常温下进显示出了部分育性恢复的表型，如图10B所示。因此，这个结果暗示低温所延缓的生长发育时间是弥补acos5小孢子缺陷的重要原因。实施例7水稻中OsACOS5蛋白的突变也会造成雄性不育的表型根据GenBank数据库的序列比对信息，ACOS5几乎在有花植物中皆有直系同源蛋白。申请人选取了拟南芥，水稻，大麦，小麦，番茄，葡萄和苜蓿的蛋白序列进行了同源性比对，结果显示AMP结构域在有花植物中高度保守。基于neighbor-joining方法分析得出的无根进化树显示，不同物种中的直系同源基因在双子叶植物和单子叶植物有清晰的分岔，如图11所示。由于不同植物中ACOS5蛋白的同源性都比较高，申请人获得了水稻OsACOS5(LOC_Os04g24530)的T-DNA插入突变体osacos5，其在第一个外显子上有一个AAG到TAG的提前终止突变，如图12中A所示。该突变体显示出完全不育的表型，其花药相比野生型，显示干瘪和较白的状态，如图12中B所示，亚历山大染色显示与野生型的紫色饱满的花粉粒相比，osacos5突变体的花药中没有任何可见的花粉粒，如图12中C所示。根据上述的实验结果可以确定，水稻的OsACOS5蛋白与拟南芥ACOS5具有同样的生物学功能，降低水稻中OsACOS5蛋白的表达或活性可以培育水稻不育系。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。参考文献：AliJ,SiddiqEA,ZamanFU,AbrahamMJ,AhmedIlyas.Identificationandcharacterizationoftemperaturesensitivegenicmalesterilitysourcesinrice(OryzasativaL.).IndJofGenet55:243-259(1995).AlonsoJ.M.,Stepanova,A.N.,Leisse,T.J.,Kim,C.J.,Chen,H.,Shinn,P.,Stevenson,D.K.,Zimmerman,J.,Barajas,P.&Cheuk,R.Genome-wideinsertionalmutagenesisofArabidopsisthaliana.Science301:653–657(2003).deAzevedoSouzaC,KimSS,KochS,KienowL,SchneiderK,McKimSM,HaughnGW,KombrinkE,DouglasCJ.AnovelfattyAcyl-CoAsynthetaseisrequiredforpollendevelopmentandsporopolleninbiosynthesisinArabidopsis.PlantCell21:507-525(2009).Ding,J.,Lu,Q.,Ouyang,Y.,Mao,H.,Zhang,P.,Yao,J.,Xu,C.,LiX.,Xiao,J.,&Zhang,Q.AlongnoncodingRNAregulatesphotoperiod-sensitivemalesterility,anessentialcomponentofhybridrice.ProcNatlAcadSciUSA.109:2654-2659(2012).Ebling,F.J.PhotoperiodicdifferencesduringdevelopmentinthedwarfhamstersPhodopussungorusandPhodopuscampbelli.GenCompEndocrinol.95(3):475-482.(1994).Hong,Y.,Wang,T.W.,Hudak,K.A.,Schade,F.,Froese,C.D.&Thompson,J.E.Anethylene-inducedcDNAencodingalipaseexpressedattheonsetofsenescence.ProcNatlAcadSciUSA97:8717–8722(2000).Hu,W.,Wang,Y.,Bowers,C.&Ma,H.Isolation,sequenceanalysis,andexpressionstudiesofXorallyexpressedcDNAsinArabidopsis.PlantMolBiol53:545–563(2003).Kienow,L.,Schneider,K.,Bartsch,M.,Stuible,H.P.,Weng,H.,Miersch,O.,Wasternack,C.,andKombrink,E.Jasmonatesmeetfattyacids:functionalanalysisofanewacyl-coenzymeAsynthetasefamilyfromArabidopsisthaliana.J.Exp.Bot.59:403–419.(2008).Matsui,K.,Fukutomi,S.,Ishii,M.,&Kajiwara,T.A.tomatolipasehomologoustoDAD1(LeLID1)isinducedinpost-germinativegrowingstageandencodesatriacylglycerallipase.FEBSLett569:195–200(2004).Oh,I.S.,Park,A.R.,Bae,M.S.,Kwon,S.J.,Kim,S.Y.,Lee,J.E.,Kang,N.Y.,Lee,S.,CheongH.,&Park,O.K.SecretomeanalysisrevealsanArabidopsislipaseinvolvedindefenseagainstAlternariabrassicicola.PlantCell17:2832–2847.(2005).Sanders,P.M.,Bui,A.Q.,Weterings,K.,McIntire,K.N.,Hsu,Y.C.,Lee,P.Y.,Truong,M.T.,Beals,T.P.&Goldberg,R.B.AntherdevelopmentaldefectsinArabidopsisthalianamalesterilemutants.Sex.PlantReprod,11:297–322(1999).Shi,M.Thediscoveryandpreliminarystudiesofthephotoperiod-sensitiverecessivemalesterilerice(OryzasativaL.subsp.japonica).SciAgricSin2:44–48(1985).Yoo,S.D,,Cho,Y.H.&Sheen,J.Arabidopsismesophyllprotoplasts:aversatilecellsystemfortransientgeneexpressionanalysis.NatProtoc2,1565–1572.(2007).YuanL.Hybridricetechnologyforfoodsecurityintheworld.CropRes18:185–186(2004).Zhang,Z.B.,Zhu,J.,Gao,J.F.,Wang,C.,Li,H.,Zhang,H.Q.,Zhang,S.,Wang,D.M.,Wang,Q.X.,Huang,H.,Xia,H.J.&Yang,Z.N.TranscriptionfactorAtMYB103isrequiredforantherdevelopmentbyregulatingtapetumdevelopment,callosedissolutionandexineformationinArabidopsis.PlantJ.52,528-538(2007).Zhou,H.etal.RNaseZ(S1)processesUbL40mRNAsandcontrolsthermosensitivegenicmalesterilityinrice.Nat.Commun.5,4884(2014).Zhu,Y.X.&Davies,P.J.TheControlofApicalBudGrowthandSenescencebyAuxinandGibberellininGeneticLinesofPeas.PlantPhysiol.113:631-637(1997).当前第1页1 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