用于检测cpt1a基因突变的引物及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测CPT1A基因突变的引物、方法和试 剂盒。
【背景技术】
[0002] 肉毒喊棕榈酰转移酶 1A (Carnitine Palmitoyltransferase 1A, CPT1A)是长链 脂肪酸由胞浆转移到线粒体氧化供能的关键限速酶，位于线粒体外膜，催化长链脂肪酸从 酰基辅酶A转移到肉毒碱上进而从胞浆进入线粒体内部，并且进一步在位于线粒体内膜上 的肉毒碱棕榈酰转移酶2催化下进行0氧化。人类CPT1A基因定位于llql3. I~ql3.5区， 主要表达于肝、肾、肺组织。CPT1A基因全长约60 kb，包括18个编码外显子。CPT1A基因 突变引起CPT1A功能缺陷，肉碱依赖的转运系统功能将遭到破坏，从肌肉细胞浆转运到线 粒体的长链脂肪酸减少，长链脂肪酸不能被氧化，故血清游离脂肪酸增高，肌肉组织中大量 脂肪聚集，从而引起一系列生化紊乱。
[0003] 目前仅发现41种与疾病相关的CPT1A基因突变，主要为错义或无义突变，也包括 1种内含子与外显子交界区的剪切点突变。
[0004] 对于CPT1A基因突变的检测通常为针对某一个突变进行检测，尚未有关于利用多 个特异性引物对CPT1A基因多个突变同时进行测定的报道。
【发明内容】
[0005] 针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种检测CPT1A基因突变的引物和试剂 盒。
[0006] 本发明的另一目的是提供一种非诊断目的检测CPT1A基因的全部编码外显子及 外显子/内含子交界区突变的方法。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用下述技术方案： 一种检测CPT1A基因突变的引物，包括扩增CPT1A基因18个编码外显子及外显子/内 含子交界区的引物，其引物序列如SEQ ID NO. 1-SEQ ID N0. 26所示，具体如下： CPT1A-P1-F :5' -GTTAAGTGGCGAGGAAGAAC -3' ；（SEQ ID NO. 1) CPT1A-P1-R:5' -ACCTGCCTAATGGAACTGCT -3' ；（SEQ ID N0.2) CPT1A-P2-F:5' - AGGGAGGAAACTGGAATCAC -3, ；（SEQ ID N0.3) CPT1A-P2-R ：5, - AGCAGTCAGTTCAAGGGTCA -3? ； (SEQ ID NO. 4) CPT1A-P3-F ：5, - AGGAGAGTGCCCGTGAGTGT -3? ；(SEQ ID NO. 5) CPT1A-P3-R ：5, - TCAAGGTTGAGGCCCAAGTC -3? ； (SEQ ID NO. 6) CPT1A-P4-F ：5, - AGTAAGTGGTTGGCACATTG -3? ； (SEQ ID NO. 7) CPT1A-P4-R ：5, - TCCTATGAGAACCCTACCAG -3? ； (SEQ ID NO. 8) CPT1A-P5-F ：5, - AAGGCACAAGTGAGGCAAAC -3? ； (SEQ ID NO. 9) CPT1A-P5-R:5' -TTTCAGCCCTGTTATCCCTG -3' ；（SEQ ID NO. 10) CPT1A-P6-F ：5, - TCTTTCTGCCTGTCTCAACT -3? ； (SEQ ID NO. 11) CPT1A-P6-R :5' - TGGGCTACTAGGCTAACACT-3' ；（SEQ ID NO. 12) CPT1A-P7-F :5' -TACGTGAGGGTATTTGGTGC -3' ；（SEQ ID NO. 13) CPT1A-P7-R:5' -AGGCTGGTCTTGAACTGCTA -3' ；（SEQ ID NO. 14) CPT1A-P8-F :5' -CATTCTCCTGCCTCAACCT -3' ；（SEQ ID NO. 15) CPT1A-P8-R:5' -GGAATGTTCACCAGCCTAC -3' ；（SEQ ID NO. 16) CPT1A-P9-F :5' -CTGAACTTGGGACTCTTGGT -3' ；（SEQ ID NO. 17) CPT1A-P9-R:5' -ACAGTGCCATTGCATTCCAG -3' ；（SEQ ID NO. 18) CPT1A-P10-F :5' -CTAATCTTTCCGTGCTTCA -3' ；（SEQ ID NO. 19) CPT1A-P10-R :5' - TATGCCACCTTCTTTCTTAG -3' ；（SEQ ID NO. 20) CPT1A-P11-F ：5, - CTCCCCAGTTGCCTTGCGAT -3? ； (SEQ ID NO. 21) CPT1A-P11-R:5' -AGTGGCACGATCTCGGCTCA -3' ；（SEQ ID N0.22) CPT1A-P12-F :5' - TACTTGCCAGTGAAAGGAGA -3' ；（SEQ ID NO. 23) CPT1A-P12-R:5' -AACTCCCTGAGCAAACAACT -3' ；（SEQ ID N0.24) CPT1A-P13-F :5' -GCTCATGTCAGACCCGCTAC -3' ；（SEQ ID NO. 25) CPT1A-P13-R:5' -AGTCTTGGGCAGGTGTAGGA -3' ；（SEQ ID N0.26) CPT1A-P14-F :5' - CAATGTGGTGAAACCCTGTC -3' ；（SEQ ID NO. 27) CPT1A-P14-R :5' - CCTTGTCCCTACCTTTACCT -3' ；（SEQ ID NO. 28) CPT1A-P15-F :5' - TGGTCCTGAGAAGTGTCATC -3' ；（SEQ ID NO. 29) CPT1A-P15-R:5' -ACTTCCGTGCGTCTTACTGT -3' ；（SEQ ID NO. 30) CPT1A-P16-F :5' - CCCGTTCCGAATCTTACTC -3' ；（SEQ ID NO. 31) CPT1A-P16-R:5' -GCAAGACTGCCAAGGACAT -3' ；（SEQ ID N0.32) CPT1A-P17-F :5' -GATTATCAACAAGCCAGACC -3' ；（SEQ ID NO. 33) CPT1A-P17-R:5' -AGCAGGCAGTTGAATTGACT -3' ；（SEQ ID N0.34) CPT1A-P18-F :5' -GAGAACTGGCAGAAAGGAAT -3' ；（SEQ ID NO. 35) CPT1A-P18-R:5' -GTGAAGCCACAACCCTACTA -3' ；（SEQ ID N0.36) 其中，F为正向引物，R为反向引物。
[0008] CPT1A基因外显子较多。本发明通过对引物互补、发夹结构和引物交联等引物二级 结构进行了精确的分析，将CPT1A基因18个编码外显子及外显子/内含子交界区分别设计 二对引物，根据PCR扩增结果分别择优选取一对引物，分别如SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO. 36 所示。
[0009] 本发明还提供了一种检测CPT1A基因突变的试剂盒，该试剂盒中含有扩增CPT1A 基因18个编码外显子及外显子/内含子交界区的引物。
[0010] 本发明所述的试剂盒还包括用于PCR扩增反应的酶和试剂。
[0011] 用于PCR扩增反应的酶和试剂包括Taq酶、dNTP、10XPCR缓冲液和双蒸水。
[0012] 进一步的，所述试剂盒中还包括用于提取样品DNA的试剂。
[0013] 本发明还提供非诊断目的检测检测CPT1A基因的全部编码外显子及外显子/内含 子交界区突变的方法，包括如下步骤： (1)提取待测样本DNA; (2) 以样本DNA为模板，用扩增CPT1A基因18个编码外显子及外显子/内含子交界区 的引物进行PCR扩增，得到扩增产物； (3) 采用测序引物对扩增产物进行测序扩增，得到测序扩增产物； (4) 对测序扩增产物进行测序，并与数据库中正常的CPT1A基因序列进行比对，从而确 定CPT1A基因的突变位点。
[0014] 步骤（2)中，PCR扩增的条件为：94°C预变性3min 20s，94°C变性35 s，退火 35s，特异性扩增引物的退火温度为51°C-59°C，72°C延伸50 s，共30个循环；最后72°C延 伸 5min〇
[0015] 步骤（3)中，所述测序引物为PCR扩增引物对中的正向引物。
[0016] 步骤（3)中，测序扩增反应的条件是：95°C预变性120s，95°C变性30 s，50°C退 火10s，60°C延伸120 s，共25个循环。
[0017] 测序扩增反应体系采用10yL，具体组成为：DNA模板1 yL、引物(正、反向）各 1 y L、BDT 2 y L、双蒸水补足至总体积10 y L。
[0018] 步骤（4)中，测序的方法为Sanger法。
[0019] 本发明的有益效果： 本发明克服了现有技术中仅对一个突变进行检测的局限性，通过设计特异的扩增引物 即可对CPT1A基因的全部编码外显子及外显子/内含子交界区进行捕获，一次性的将多个 潜在的突变位点检测出来。
【附图说明】
[0020] 图1为CPT1A基因编码外显子及外显子/内含子交界区PCR扩增产物电泳图；其 中，M泳道：DNA marker，1~18泳道：分别为CPT1A基因18个编码外显子及交界区。
[0021] 图2A为CPT1A基因编码外显子5及外显子/内含子交界区测序的部分结果，图的 上方为NCBI数据库中标准CPT1A基因序列，其下行为检测的样本CPT1A基因序列；图2A显 示：在cDNA 622位置，G突变为A。
[0022] 图2B为CPT1A基因编码外显子8及外显子/内含子交界区测序的部分结果，图的 上方为NCBI数据库中标准CPT1A基因序列，其下行为检测的样本CPT1A基因序列；图2B显 示：在cDNA 884位置，G突变为A。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解 释本发明，并不对其内容进行限定。
[0024] 下面实施例中所用一些材料和试剂均为进口分装或国产分析纯。
[0025] 实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规的条件，例如Sambrook等的 《分子克隆：实验室手册》（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)中