一管式共用引物法检测同一突变位点不同突变类型的制作方法
【专利摘要】本发明基于LAMP（环介导恒温扩增检测）技术的一管式检测同一突变位点不同突变类型的方法或理论，该方法可以在同一个核酸检测反应管中同时检测同一个突变位点的不同突变碱基。LAMP设计需要4-6个引物，通过在环介导等温扩增检测试剂盒探针设计，对于同一突变点的不同突变类型，只改变覆盖突变点处的引物，覆盖其它位点的引物不变为共用引物（加入量也不变），这样保证了，覆盖突变点的引物与共用引物之间不发生交叉反应，只需要验证覆盖同一突变点不同突变类型处的引物之间是否发生交叉反应即可，那么覆盖此处引物只有一到两个碱基不同，也不会发生反应，这就是本检测方式的理论基础。此方法不仅可以降低成本、提高效率，更重要的是可以极大的提高对多突变类型同时存在的检测灵敏度。
【专利说明】一管式共用引物法检测同一突变位点不同突变类型
[0001]
【技术领域】
[0002]一管式共用引物法检测同一突变位点不同突变类型，此发明可以应用于环介导等温扩增检测【技术领域】，结核杆菌、乙型肝炎病毒、HIV病毒、肿瘤耐药等检测。
【背景技术】
[0003]环介导等温扩增法(loop-mediatedisothermal amplification , LAMP)是2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件(63 °C左右)保温30 - 60分钟，即可完成核酸扩增反应。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。LAMP是一种全新的核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能优于PCR技术，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。
[0004]目前在行业应用最广范的耐药检测是药敏实验和基因芯片技术，药敏实验耗时太长，基因芯片虽然能实现高通量检测但是制备成本及检测费用均较昂贵，灵敏度低，不宜大面积推广。因此急需一种检测成本低、灵敏度高切实可行的方法。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是:提供一种同时一管式检测同一突变位点不同突变类型的环介导等温扩增检测方法。
[0006]本发明的技术方案是:该方法可以在同一个核酸检测反应管中同时检测同一个突变位点的不同突变碱基。LAMP设计需要4-6个引物，通过在环介导等温扩增检测试剂盒探针设计，对于同一突变点的不同突变类型，只改变覆盖突变点处的引物，覆盖其它位点的引物不变(加入数量也不变)，这样保证了，突变点的引物与其它点位的引物之间不发生交叉反应，只需要验证覆盖同一突变点不同突变类型处的引物之间是否发生交叉反应即可，那么覆盖此处这引物只有一到两个碱基不同，也不会发生反应，这就是本检测方式的理论基础。
[0007]实施例1:
结核分支杆菌耐 利福平(RFP)药物核苷酸526点突变有如下几种情况:
【权利要求】
1.本发明基于LAMP(环介导恒温扩增检测)技术的一管式检测同一突变位点不同突变类型的方法或理论，其特征在于:通过在环介导等温扩增检测试剂盒探针设计，对于同一突变点的不同突变类型，只改变覆盖突变点处的引物，覆盖其它位点的引物不变(加入数量也不变)，这样保证了，突变点的引物与其它点位的引物之间不发生交叉反应，只需要验证覆盖同一突变点不同突变类型处的引物之间是否发生交叉反应即可，那么覆盖此处这引物只有一到两个碱基不同，也不会发生反应，这就是本检测方式的理论基础。
2.根据权利I要求我们保护的是LAMP技术一管式检测同一突变位点不同突变类型，是我们首次提出基于LAMP技术对不同基因类型的检测，只要是一管式检测不同基因突变类型都在我们的保护范围。
3.我们同时保护也是LAMP技术一管式检测同一突变位点不同突变类型的理论和方法。
4.根据权利要求1所述本技术也可以向检测不同突变位点延伸，本技术是同时检测多个突变位点的基础，多个位点引物设计除覆盖突变位点的其它引物尽量设计共用引物，避免交叉反应。
5.此方法主要应用于各种突变耐药基因(如肺结核、乙肝、艾滋病等)的检测，同时也可用于同一位点是否存在不同有 效基因形式的检测。
【文档编号】C12Q1/68GK103725769SQ201210390906
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2012年10月16日 优先权日:2012年10月16日
【发明者】王德国, 曲海涛, 张文超 申请人:哈尔滨德歌生物科技有限公司