用于检测与aml预后相关的基因突变的引物、试剂盒及方法
【专利摘要】本发明属于基因工程技术领域，公开了一种用于检测与AML预后相关的基因突变的引物组合、含有该引物组合的试剂盒以及检测与AML预后相关的基因突变的方法。本发明的引物组合覆盖了FLT3、NPM1、DNMT3A和CEBPA基因全部热点突变位点，特异性强、覆盖面广。同时，本发明设计的全部引物的退火温度均在相近水平，扩增阶段可使用同一程序一次完成，对热点突变可进行联合并行检测，检测效率高。此外，本发明采用正反向扩增引物直接进行测序，通过软件直接进行突变的分析，检测直观、成本低，为急性髓细胞白血病的治疗方案确定及预后判断提供了重要的参考依据。
【专利说明】
用于检测与AML预后相关的基因突变的引物、试剂盒及方法
技术领域
[0001] 本发明设及基因工程技术领域，具体设及用于检测与AML预后相关的基因突变的 引物、试剂盒及方法。
【背景技术】
[0002] 急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一组起源于造血干细胞的 恶性血液病，具有高度异质性。目前，在AML评价预后危险度的众多因素中，细胞遗传学被认 为是重要的独立预后因素，一些特异性染色体核型异常，常被认为是指导治疗和判断预后 的标志。但仍有相当一部分患者检测不到核型异常，运些患者无论是在治疗反应还是预后 评价上都存在较大的变异。由于分子生物学技术的迅速发展，陆续鉴定出多个与AML相关的 分子标志物，运也充分证明了基因改变是AML发病的重要基础。其中化T3-ITD、NPM1和CEBPA 基因突变已经作为重要的危险分层评价指标，纳入2010年急性髓细胞白细胞NCC姆旨南中。
[0003] FLT3发生基因突变将破坏正常血细胞的增值、分化和调亡，甚至在某些情况下能 够单独或与其他细胞因子组合，为白血病细胞增值提供支持，是骨髓恶性肿瘤的重要驱动 型突变。其突变类型主要有两种形式:一种是近膜区的内部串联重复（ITD)突变，常发生于 外显子14或15;另一种是活化环D835的点突变，常发生于外显子20dFLT3-ITD在AML中的发 生率约为14%-32%，出现于FAB各亚型，其中WM5最多见。国内外研究显示伴有化T3-ITD阳 性的患者常伴有高外周血白细胞数，高骨髓原始细胞比例，还表现为较低的CR率、DFS、EFS 和OS,具有独立的不良预后意义。而D835点突变的发生率仅为7%左右，与白血病的预后相 关性存在争议，有待进一步深入验证。
[0004] NPMl基因在12号外显子上发生插入突变，改变NPMl蛋白C末端的密码子，在成人急 性髓细胞白血病患者中表达高达35 %左右，亚洲人少于欧美，是AML中发现的占比率最高的 突变，研究发现NPMl基因突变的发生率在FAB各亚型中亦具有异质性，见于除M3外的各亚 型。尽管NPMl突变的类型不一，但均属于移码突变，导致核定位信号异常，从而使核憐蛋白 由核内易位于胞质，该异常定位不但可W影响蛋白质的正常功能，同时对某些肿瘤抑制基 因 ARF、P53的正常通路及功能也会产生一定的影响。NPMl基因突变是AML预后相对较好的判 断指标。具有NPMl突变的正常核型AML患者CR率较高，EFS、DFS、OS时间也明显延长，运可能 与NPMl突变患者对化疗药物较敏感有关。在不伴有化T3-ITD突变的患者中，NPMl突变阳性 患者具有良好的预后。
[0005] D醒T3A突变在急性髓细胞白血病患者中发生率高达20%~30%，且D醒T3A阳性对 AML的治疗与预后，尤其是对正常核型的患者有重要指导意义。经国内外大宗实验证明，突 变大多集中于外显子23号，编码第882位精氨酸的基因位点的错义突变，但其在外显子11~ 22内发生的突变类型多样。作为在AML患者中发生率仅次于化T3与NPMl的突变类型，不同于 其他两种突变在AML中的高危影响，DNMT3A突变在患者处于长期完全缓解状态下，仍可能保 持阳性。但DMT3A所导致的甲基化异常，影响表观遗传学调节，与AML的发生密切相关，是近 年来白血病治疗的祀点之一，对临床医师选择药物或干细胞移植具有指导作用。
[0006] C邸PA基因突变见于约5%~15%的AML患者，WMl、M2亚型居多。其突变主要有两 种形式:一是N-端的移码突变，导致正常p42蛋白翻译提前终止，从另一个起始密码子开始 翻译成截短的p30蛋白；二是C-端发生的碱基插入、缺失、重复和替换，通常为框内突变，产 生的蛋白缺乏DNA结合及同源二聚体活性。患者既可发生单突变(CEBPA single mu化tion， CEBPAsm)，也可发生双突变(CEBPA double mutation,C邸PAdm)。因此，C邸PA基因若发生突 变，其编码的C/EBPa蛋白结构或表达异常将导致粒系分化障碍、不成熟粒系前体细胞异常 增殖，甚至引起急性髓细胞白血病的发生。目前，越来越多的研究显示只有伴有CEBPAdm的 AML患者才具有良好的预后，C邸PAdm患者CR率优于C邸PAsm和CEBPA野生型患者，多因素分析 显示伴有CEBPAdm的AML患者0S、EFS及WS均较高，对其进行精确筛查有助于临床医师为患者 选择最佳的治疗方案。
[0007] 在当前国内外广泛使用的分子生物学检测白血病基因突变方法中，巧光原位杂交 技术(FISH)只能进行定性检测、操作复杂；巧光定量PCR存在着检测通量的局限性，对于 CEBPA与NMPl等没有明确突变热点的情形，需要设计多对引物及探针，成本高且存在漏检的 可能性，所W都还不能真正满足临床诊断检测的需要。因此，目前亟需一种特异性强、快速、 成本低、漏检率低的检测与ML预后相关基因突变的方法，该方法能够真正满足临床诊断检 测的需求。
【发明内容】
[0008] 本发明针对现有技术中存在的上述缺陷，基于Genbank公布的最新的与AML预后相 关的各突变基因的序列，重新设计了覆盖化T3、NPM1、DNMT3A和CEBPA基因全部热点突变位 点的引物W及对化T3、NPMl、DNMT3A和CEBPA基因突变进行联合并行检测的方法。
[0009] 为此，本发明一方面提供了一种用于检测与AML预后相关的基因突变的引物组合， 其由SEQ ID NO. 1-34所示的引物组成。
[0010] 在本发明优选的实施方案中，本发明的引物组合进一步由第1-4组引物组成，其中 第1组由SEQ ID NO. 1-4所示的引物组成，第2组由SEQ ID NO.5-6所示的引物组成，第3组由 SEQ ID NO.7-26所示的引物组成，第4组由SEQ ID NO.27-34所示的引物组成。
[0011] 在本发明进一步优选的实施方案中，本发明在进行PCR扩增时，每条引物的浓度优 选为如M;在进行测序反应时，每条引物的浓度优选为3.
[0012] 本发明另一方面提供了一种用于检测与AML预后相关的基因突变的试剂盒，其包 含本发明所述的引物组合。
[0013] 在本发明优选的实施方案中，本发明在进行PCR扩增时，每条引物的浓度优选为扣 M;在进行测序反应时，每条引物的浓度优选为3.2]iM。
[0014] 本发明另一方面提供了本发明的引物组合在制备用于检测与AML预后相关的基因 突变的试剂盒中的应用。
[001引本发明再一方面提供了本发明所述的引物组合，或者本发明所述的试剂盒在检测 与AML预后相关的基因突变中的应用。
[0016] 本发明最后一方面提供了一种检测与AML预后相关的基因突变的方法，其包含W 下步骤：
[0017] 1、获取待测样品DNA;
[0018] 2、采用本发明所述的引物组合，或采用本发明所述的试剂盒，W步骤I中获取的 DNA为模板，进行PCR扩增；
[0019] 3、PCR扩增产物经电泳鉴定后，进行测序反应；
[0020] 4、测序反应产物经纯化、变性后，上测序仪测序；
[0021] 5、对测序峰图进行分析，对与ML预后相关的基因突变类型进行识别。
[0022] 在本发明优选的实施方案中，本发明在进行PCR扩增时，每条引物的浓度优选为扣 M;在进行测序反应时，每条引物的浓度优选为3.2]iM。
[0023] 在本发明进一步优选的实施方案中，本发明在进行测序反应之前，采用邮碱性憐 酸酶(Alkaline Phospha1:as(9i;rimp))和外切酶化xonuclease I)对步骤2获得的扩增产物 进行消化处理，W去除双链DNA之外的杂质。
[0024] 由上述描述可知，与现有技术相比，本发明具备如下优点。
[0025] 1、本发明基于Genbank公布的最新的与AML预后相关的各突变基因序列，重新设计 了覆盖化T3、NPMl、面MT3A和CEBPA基因全部热点突变位点的引物，引物特异性强、覆盖面 广。
[0026] 2、本发明所设计的全部引物的退火溫度均在相近水平，扩增阶段可使用同一程序 一次完成，对化T3、NPM1、D醒T3A和C邸PA基因的热点突变可W进行联合并行检测，检测效率 局。
[0027] 3、本发明采用正反向扩增引物直接进行测序，通过软件直接进行突变的分析，检 测直观、成本低。
[0028] 综上所述，本发明提供了一种快速，简便、准确、直观的检测与AML预后相关的基因 突变的方法，可为急性髓细胞白血病的治疗方案确定及预后判断提供重要的参考依据。
【附图说明】
[00巧]图1:突变型D醒T3A与野生型测序峰对比图。
[0030] 图2:突变型CEBPA与野生型测序峰对比图。
【具体实施方式】
[0031] 下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，旨在用于说明本发明而非限定本 发明。应当指出，对于本领域技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下，还可W对本发 明进行若干改进和修饰，运些改进和修饰也同样落入本发明的保护范围之内。
[0032] 实施例1:设计用于检测与AML预后相关的基因突变的引物
[0033] 根据GenBank公布的与AML预后相关的各个突变基因的序列，利用Primer Premier 5.0引物设计软件进行引物设计，所设计的引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合 成。同时，为了减少测序峰图底峰，应最大限度地保障测序引物的纯度。本发明设计的具体 引物情况如表1所示。
[0034] 表1、本发明检测与AML预后相关的基因突变的引物情况表
[0036]
[0037] *C邸PA基因只有单独的一个外显子，此处数字代表引物数量并非扩增外显子号。
[0038] 本发明所设计的引物不仅针对化T3、NPMl基因的热点突变区，而且基本覆盖了 DNMT3A基因的11~23号外显子内多发突变区，W及基本覆盖了CEBPA基因的全长。
[0039] 其中，引物化13-口0斗（569 10^.1)、引物化13-口0-尺（569 10^.2)、引物 化13-1'邸斗（569 10^.3)、引物^；13-1'邸-1?(569 10^.4)用于检测^；13基因的内部串联 重复突变和〇835点突变。引物肥]?1斗(56〇10^.5)、肥]\11-1?(沈〇10顯.6)用于检测肥]\11 基因突变。D醒T3A基因的10对引物，分别对应SEQ ID NO.7~NO.26,用于检测D醒T3A基因的 各类型突变，包括23号外显子上的R882热点突变。引物CEBPA-1F(SEQ ID N0.27)、CEBPA-1R (WQIDN0.28)、(EBPA-2F(WQIDN0.29)、CEBPA-2R(SEQIDN0.30)、CEBPA-3F(WQID 側.31)、〔68?4-31?(沈9 10側.32)、〔68?4-4尸（沈9 10側.33)、〔68?4-41?(沈9 10側.34)集 中扩增CEBPA已知突变发生区。
[0040] 此外，本发明所有的测序引物与PCR扩增引物保持一致，W便于进行双向测序，减 少漏检的可能性。同时，本发明全部引物的退火溫度均在相近水平约57°C，从而保证了在扩 增阶段可W使用同一程序一次完成。
[0041] 实施例2:对样本中与AML预后相关的基因突变进行检测
[0042] (一)试剂与材料
[004；3] 1、检测体系 PCR 反应液：10XPCR Buffer、dNTPs(2.5mM)、LA Taq DM Polymerase、d 地2〇 等。
[0044] 2、测序体系：
[0045] (1 )PCR产物消化反应液:邮碱性憐酸酶(Alkal ine Phosphatas (化rimp))和外切 酶化 xonuclease 1),1:1混合；
[0046] (2)测序纯化液:抓TA(125mmol) ,85%无水乙醇，75%无水乙醇，HIDI(高度去离子 甲酯胺）；
[0047] (3)测序反应液：ABIPRISM" Bigdye''Terminator V3 . Icycle sequencing Kit。
[004引（二）工作流程
[0049] UPCR 扩增
[0050] 检测体系PCR反应液的配制如表2所示。
[0051 ]表2检测体系PCR反应液配制表
[0053] 其中，DNA为待测样品经QIAamp DNA Blood Mini kit试剂盒提取后获得，引物序 列如表1所述。
[0054] 阳性对照品：含有患者DNA的溶液。
[0055] 阴性对照品：含有正常人DNA的溶液。
[0化6] 空白对照：不添加样本DNA的溶液或2.加1 dd出0。
[0057] 扩增反应条件:96°C预变性2min;96°C变性30s 一 58。(：退火3〇3一72。(：延伸1111111，共 进行35个循环;72°C延伸5min。
[0化引 2、电泳鉴定
[0化9] 1.5%琼脂糖凝胶电泳，150V，30min，凝胶成像系统观察。
[0060] 3、Sanger 测序
[0061 ] 取Iul测序消化反应液加入到扩增产物中，依靠 Alkaline Phosphatase水解残余 的dNTP，Exonuc 1 ease I水解单链核酸，从而去除双链DNA之外的杂质。
[0062] 消化反应条件:37°C，60min;80°C，15min;4°C保存。
[0063] 取Iul消化产物分别与各测序引物的正反向引物按表3的体系混合。
[0064] 表3测序体系PCR反应液配制表
[00 化 I
[UU66J 测斤仅化观 h :96 -U，加 in;96 -U，IUs一扣-U，bs一6U-U，yus，巧巧化化个循许；lb °c保存。
[0067] 4、测序反应后纯化
[0068] 纯化操作前，需预冷离屯、机至4°C。此步骤是将测序反应体系中除目标单链核酸片 段之外的杂质尽可能去除，W减少3730毛细管电泳时杂质对峰图质量的影响。
[0069] 每加1反应体系加入0.125mol/L邸TA-Nas溶液，85%无水乙醇30ul，盖上硅胶垫， 充分振荡3~5分钟，离屯、3000g，4°C，30分钟。EDTA作为金属离子馨合剂，能与测序PCR反应 体系里的离子结合从而去除离子。
[0070] 离屯、结束后，倒去上清液，至185g时立即停止。再向每孔中加入70%无水乙醇 50ul，DNA片段在70%乙醇中溶解度低，能通过离屯、沉淀下来。盖上硅胶垫，充分振荡3分钟， 离屯、3000g，4°C，15分钟，离屯、结束后，再次倒去上清液。
[0071] 5、变性处理
[0072] 上述纯化产物避光通风20分钟后，在生物安全柜中操作，每孔加入8ul HI-DI甲酯 胺进行变性处理。变性程序:95°C，3min;4°C冷却。变性结束后，上测序仪(ABI 3730)进行测 序。
[0073] 6、结果分析
[0074] 获得测序峰图后，经严格改名加载入软件化riant Reporter software vl. 1，自 动与Genbank野生型序列进行比对，并同时采用阴性对照进行控制。根据实际突变情况，分 析编码氨基酸的改变，对比图参见说明书附图1和附图2。
[0075] 图1中样本FG95为发现D醒T3A突变的测序峰图，对比野生型(ZP)，此突变为错义突 变(R827C)，现有COSMIC数据库中未见报道，临床意义暂不明确。
[0076] 图2中样本FG87为发现CEBPA突变的测序峰图，对比野生型(A570)，此突变为同义 突变(1481 )，不引起氨基酸改变，无致病性。
[0077] 此外，通过报告可发现本发明所呈现的峰图背景清晰、信号值高，大大降低了对突 变的分析难度。
【主权项】
1. 一种用于检测与AML预后相关的基因突变的引物组合，其由SEQ ID NO.1-34所示的 引物组成。2. 根据权利要求1所述的引物组合，其进一步由第1-4组引物组成，其中第1组由SEQ ID NO. 1-4所示的引物组成，第2组由SEQ ID NO.5-6所示的引物组成，第3组由SEQ ID NO.7-26 所示的引物组成，第4组由SEQ ID NO.27-34所示的引物组成。3. 根据权利要求1或2所述的引物组合，其中在进行PCR扩增时，每条引物的浓度为5μΜ; 在进行测序反应时，每条引物的浓度为3.2μΜ。4. 一种用于检测与AML预后相关的基因突变的试剂盒，其包含权利要求1-3中任一项所 述的引物组合。5. 根据权利要求4所述的试剂盒，其中在进行PCR扩增时，每条引物的浓度为5μΜ;在进 行测序反应时，每条引物的浓度为3.2μΜ。6. 权利要求1-3中任一项所述的引物组合在制备用于检测与AML预后相关的基因突变 的试剂盒中的应用。7. 权利要求1-3中任一项所述的引物组合，或者权利要求4或5中所述的试剂盒在检测 与AML预后相关的基因突变中的应用。8. -种检测与AML预后相关的基因突变的方法，其包含以下步骤： (1) 获取待测样品DNA; (2) 采用权利要求1-3中任一项所述的引物组合，或采用权利要求4或5中所述的试剂 盒，以步骤(1)中获取的DNA为模板，进行PCR扩增； (3) PCR扩增产物经电泳鉴定后，进行测序反应； (4) 测序反应产物经纯化、变性后，上测序仪测序； (5) 对测序峰图进行分析，对与AML预后相关的基因突变类型进行识别。9. 根据权利要求8所述的方法，其中在进行PCR扩增时，每条引物的浓度为5μΜ;在进行 测序反应时，每条引物的浓度为3.2μΜ。10. 根据权利要求9所述的方法，其中在进行测序反应之前，采用虾碱性磷酸酶 (Alkaline Phosphatas(Shrimp))和外切酶(Exonuclease I)对步骤(2)获得的扩增产物进 行消化处理，以去除双链DNA之外的杂质。
【文档编号】C12N15/11GK105861674SQ201610268837
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月27日
【发明人】郑仲征, 杜金伟, 安雪茹, 郁晓晨, 徐郁尚
【申请人】上海荻硕贝肯生物科技有限公司