用于检测y染色体微缺失的引物和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种用于检测Y染色体微缺失的引物和试 剂盒。
【背景技术】
[0002] 据估计，全球约有10% -15%育龄夫妇不能生育，其中男性因素占30% -50%。男 性不育最常见的症状是无精症和少精症。由遗传缺陷所引起的精子发生障碍占男性不育因 素的30 %左右，其中发病率最高的两种是克氏综合症和Y染色体微缺失。近年来的研宄表 明，大约5~10%的少精症和15~20%的无精症存在Y染色体的微缺失。
[0003] Y染色体是男性特有的染色体，参与生精过程。Y染色体上存在一个关键的与生育 相关因子的区域，称为无精子因子（Azoospermia factor，AZF)。目前认为，在AZF上存在 三个精子发生亚区（AZFa、AZFb、AZFc)，各亚区缺失可致患者表现为少、弱精症或无精症从 而引发不育。
[0004]自Tiepolo等报道了首例Y染色体缺失后，新的缺失类型也不断被发现与报道，以 AZF区的缺失研宄与报道最多。已报道的AZF区缺失至少有如下几种：AZFa区缺失（缺失 0. 8Mb)、AZFa区部分缺失（USP9Y缺失0. 3Mb和DBY7缺失）、AZFb区缺失、AZFb部分缺失 〇35/131)、六2?(3区缺失〇32/134缺失，3.51&)、六2?(3区部分缺失（817^1'缺失1.61&、131/133缺 失 I. 6Mb、b2/b3 缺失 I. 8Mb)、AZFb+c 区缺失（P4/distal Pl 缺失 7. 0Mb，P5/proximal Pl 缺失 6. 2Mb 和 P5/distal Pl 缺失 7. 7Mb)、AZF a+b+c 区缺失。
[0005] 目前Y染色体微缺失主要通过AZF区域的序列标签位点（Sequence tagged sites，STSs)来诊断，欧洲男科协会建议采用 AZFa(SY84、SY86)、AZFb(SY127、SY134)和 AZFc (SY254、SY255)共六个STS位点对Y染色体微缺失进行分析。
【发明内容】
[0006] 本发明提供一种新的用于检测Y染色体缺失的引物和试剂盒。
[0007] 本发明提供一种用于检测Y染色体微缺失的引物，包括四对引物，能够同时扩增Y 染色体上三个基因位点和一个内参基因；
[0008] 所述Y染色体上的三个位点为：sY1258、SY1197和SY1192位点；
[0009] 所述内参基因为：SRY ;
[0010] 特异性扩增SY1258位点的引物序列如SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2所示；
[0011] 特异性扩增SY1197位点的引物序列如SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示；
[0012] 特异性扩增SY1192位点的引物序列如SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6所示；
[0013] 特异性扩增SRY位点的引物序列如SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO:8所示。
[0014] 一种用于检测Y染色体微缺失的试剂盒，包括所述引物。
[0015] 本发明的有益效果是：发现了一种新的AZF缺失类型，该缺失仅在无精症病人中 检测到，提供了一种男性不育症的新研宄方向。
【附图说明】
[0016] 图1是Y染色体bl/b2缺失型结构示意图，其中，上图为正常人Y染色体结构；下 图是在bl和b2区发生同源重组，导致约43kb的缺失；上、下图的上方标记为特异性的STS 及其位置；上、下图的下方字母表示是不同的回文区。
【具体实施方式】
[0017] 下面通过【具体实施方式】结合附图对本发明作进一步详细说明。
[0018] -种Y染色体微缺失型基因，其是bl/b2缺失。由于bl和b2是高度同源序列，重 组可能发生在具有同源性的任何位置。检测该Y染色体微缺失的试剂盒包括：1)PCR反应 液、阴性质控对照品、阳性质控对照品和DNA Marker (分子标记）；2)分隔并集中包装这些 试剂的瓶或管以及包装盒。
[0019] PCR反应液包括：用于扩增Y染色体上sY1258、sY1197和SY1192位点和一个内参 基因 SRY的引物、常规的PCR buffer (缓冲液）、热启动Taq DNA聚合酶、dNTPs和MgCl2。 其中，引物序列如SEQ ID NO: 1~SEQ ID NO: 8所示，引物的终浓度均为0.25 μ Μ;热启动 Taq DNA聚合酶的浓度为100U/ml ;dNTPs包括dATP、dGTP、dCTP和dTTP，它们的浓度均为 200 μΜ ;]\%(：12的浓度为 2. 5mM。
[0020] 阴性质控对照品为正常男性基因组DNA。阳性质控对照品为本发明bl/b2缺失男 性基因组DNA。
[0021] 特异性扩增SY1258位点的引物序列如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示：
[0022] SEQ ID NO :15' -AACCCCATCTCTAGCAAAAATATG-3'
[0023] SEQ ID NO :25' -TAGGTGACAGGGCAGGATTCTT-3'
[0024] 特异性扩增SY1197位点的引物序列如SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所示：
[0025] SEQ ID NO :35, -CAGAAAATCAGAGATAACCAGGCAA-3'
[0026] SEQ ID NO :45' -AAAGTCCCCAAGTATCGTGAGG-3'
[0027] 特异性扩增SY1192位点的引物序列如SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6所示：
[0028] SEQ ID NO :55' -ACTACCATTTCTGGAAGCCG-3'
[0029] SEQ ID NO :65' -CTCCCTTGGTTCATGCCATT-3'
[0030] 特异性扩增SRY位点的引物序列如SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8所示：
[0031] SEQ ID NO :75' -GAATATTCCCGCTCTCCGGA-3'
[0032] SEQ ID NO :85, -GCTGGTGCTCCATTCTTGAG-3'
[0033] 本发明的引物和试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
[0034] a)利用常规方法提取待测男性外周血的基因组DNA ;
[0035] b)以上述基因组DNA、阴性质控对照品、阳性质控对照品为模板分别进行PCR扩 增。PCR反应条件为：95°C变性15min ;95°C变性lmin，60°C退火45s，72°C延伸Imin ;35个 循环后，72°C延伸IOmin ;得到PCR产物。
[0036] 对所述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，阴性质控对照品会得到968bp、470bp、 255bp和176bp四条带；阳性质控对照品仅得到968bp、470bp和255bp三条带。待检基因组 DNA的产物得到968bp、470bp、255bp和176bp四条带时，结果为阴性；仅得到968bp、470bp 和255bp三条带时，结果为阳性。
[0037] 本申请人通过靶向测序，发现了一种新的AZF缺失类型，由于AZF区的bl和b2同 源序列重组，导致了 0.43Mb序列的缺失，因此被称为bl/b2缺失。本申请人仅在无精症病 人中检测到bl/b2缺失，说明bl/b2缺失与男性不育有明显相关性。
[0038] 以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发 明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱 离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。
【主权项】
1. 一种用于检测Y染色体微缺失的引物，其特征在于，包括四对引物，能够同时扩增Y 染色体上三个基因位点和一个内参基因； 所述Y染色体上的三个位点为：sY1258、SY1197和SY1192位点； 所述内参基因为：SRY ; 特异性扩增SY1258位点的引物序列如SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2所示； 特异性扩增SY1197位点的引物序列如SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示； 特异性扩增SY1192位点的引物序列如SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6所示； 特异性扩增SRY位点的引物序列如SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO:8所示。
2. -种用于检测Y染色体微缺失的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物。
3. 如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述引物的终浓度均为0. 25 yM。
4. 如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括热启动Taq DNA聚合酶、dNTPs和 MgCl2，所述热启动Taq DNA聚合酶的浓度为100U/ml ;所述dNTPs包括dATP、dGTP、dCTP和 dTTP，其浓度均为200 y M ;所述1%(：12的浓度为2. 5mM。
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测Y染色微缺失的引物和试剂盒，包括针对sY1258、sY1197和sY1192位点和内参基因的特异性引物，通过多重PCR扩增，可以快速、准确地检测这种新的Y染色体微缺失。
【IPC分类】C12N15-11, C12Q1-68
【公开号】CN104878087
【申请号】CN201510201312
【发明人】李泽松, 蔡志明
【申请人】深圳市第二人民医院
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2015年4月24日