鉴别甘薯染色体的两个dna重复序列及fish鉴别方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于细胞遗传学和分子生物学技术领域，具体涉及鉴别甘薯染色体的两个 DNA重复序列及FISH鉴别方法。
【背景技术】
[0002] 甘薯是旋花科甘薯属植物，富含淀粉、蛋白质、纤维素、胡萝卜素和多种维生 素，被世界卫生组织列为13种最佳蔬菜的冠军。在亚、非、拉美等热带及亚热带地区广为栽 培，是一种重要的粮食、蔬菜、工业原料作物及新型能源作物。近年来，甘薯在能源、健康食 品、饲料等方面的价值越来越受到人们的重视，已经培育出了很多新型优良品种。
[0003] 甘薯属植物染色体的基础研宄薄弱，相对滞后于水稻、小麦等其他作物。甘薯属植 物染色体有2 X、4X、6 X三种倍性，栽培种基本为6 X。其染色体较小，数目较多，细胞质浓 厚和染色能力弱，较难获得清晰干净的染色体制片，难以从细胞遗传学水平进行研宄。目前 的研宄主要集中在染色体数目与减数分裂行为的观察，对甘薯多倍体的染色体组成和结构 研宄甚少。
[0004] 显带技术和原位杂交技术（ISH)是研宄染色体组成和结构比较重要的两种技术。 显带技术主要是通过不同染色体的常异染色质的位置区分。原位杂交技术主要有基因组原 位杂交技术（GISH)和荧光原位杂交技术（FISH)，GISH主要是利用物种之间DNA同源性的 差异，用另一物种的基因组DNA以适当的浓度作封阻，在靶染色体上进行原位杂交。FISH是 根据已知微生物不同分类级别上种群特异的DNA序列，以利用荧光标记的特异寡聚核苷酸 片段作为探针，与环境基因组中DNA分子杂交，通过荧光检测系统检测信号DNA序列在染色 体或DNA显微切片上的目的DNA序列，进而确定其杂交位点。
[0005] 上述现有技术均可以有效区分染色体较大、较少或区分度比较明显的物种的不同 对染色体，但对于染色体较小，且数目多，形态相近的甘薯物种，通过常规的显带、原位杂交 等技术仍然不能很好的识别不同对染色体。同样，GISH的方法对于遗传背景十分复杂的甘 薯物种也不能起到很好的识别效果。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供鉴别甘薯染色体的两个DNA重复序列。
[0007] 本发明的另一目的是提供一种以上述两个DNA重复序列为探针的荧光原位杂交 方法，直观、简便、快速、有效地鉴别甘薯染色体。
[0008] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0009] 鉴别甘薯染色体的DNA重复序列，序列Itf_l具有SEQ NO :1所示的核苷酸序列， Itf_2具有SEQ NO :2所示的核苷酸序列。
[0010] 一种利用上述DNA重复序列鉴别甘薯染色体的荧光原位杂交方法，质粒DNA提取 后，通过缺刻平移法，用生物素标记的Itf_l和用地高辛标记的Itf_2，形成Itf_l和Itf_2 探针，用于对甘薯染色体的鉴别，具体步骤包括：
[0011] 1)染色体片的制备
[0012] 按常规植物材料培养，待植株根尖长至0. 5-lcm时，切下生长旺盛的根尖，经8-羟 基喹啉在25°C下处理2h后，用卡诺氏固定液固定24h;去离子水冲洗浸泡30min，充分洗去 固定液；用含2%纤维素酶和1 %果胶酶的纤维素果胶酶在37°C酶解l_2h;去离子水冲洗 浸泡30min，充分洗去酶液；取1-2根尖于干净玻片上，用镊子尖端敲碎根尖，悬空滴加卡诺 氏固定液使其充分散开，酒精灯上烤一下，晾干；镜检，选择分散良好的染色体片-20°C保 存；
[0013] 2)荧光原位杂交
[0014] ①烤片：杂交之前，将制好的片子置于65°C烘箱中干燥30-60min ;
[0015] ②杂交液的配制：取ssDNA4 y L和Itf_l，Itf_2探针DNA各3 y L，混匀后于65°C 烘箱中烘至4 y L，再加入70 %去离子甲酰胺10 y L、50 %硫酸葡聚糖4 y L、20 X SSC 2 y L混 匀，封口膜封好备用；
[0016] @变性液的配制：取双蒸水20^、20父55(：10^、70%去离子甲酰胺70^，混 匀，封口膜封好备用；
[0017] ④探针变性：取出烘箱中的染色体片，将烘箱升温至85°C，将上述变性液加 于取出的载玻片上，加上盖玻片；85 °C烘箱中变性2-4min;甩掉盖玻片，立即依次浸 入-20°C 70%、95%、100%的冰乙醇中各5min;取出玻片，空气中干燥30min以上；
[0018] ⑤杂交：将杂交液放入沸水中变性lOmin，迅速置于冰上冷却lOmin，加于上一步 干燥后的载玻片上，盖上盖玻片，室温5-10min;置于80-85°C烘箱中变性2min，放入培养皿 中，置于37 °C培养箱中培养17-2 lh;
[0019] ⑥杂交后洗脱：取出培养箱中的玻片，置于2XSSC中脱色摇床上室温洗脱 2 X 5min ;置于42°C 2 X SSC中洗脱lOmin ;2 X SSC中脱色摇床上再次洗脱5min ; 1 X TNT中 脱色摇床上洗脱5min，晾干；剪取和玻片大小吻合的封口膜，取出TNB室温融化；避光条件 下，取一个 1.5yL 的 EP 管，加入 lOOyL TNB，lyL Bio,0.5yLDig 抗体，混匀，取 lOOyL 加于晾干的玻片上，盖上封□膜，置于37 °C培养箱中培养lh;取出玻片，置于1 X TNT中脱色 摇床上洗脱3X5min;瞭干玻片5-10min;
[0020] 3)信号检测
[0021] 加13 yL DAPI，盖上盖玻片，晾干，封片，置于荧光显微镜下，根据制片坐标确定 目标染色体，对染色体进行拍照，然后依次转换滤光片，分别对两个探针的杂交信号进行拍 昭.
[0022] 4)二次杂交
[0023] ①洗片：揭掉第一次杂交的盖玻片，将载玻片置于2XSSC溶液中脱色摇床上洗脱 2X5min;置于2XSSC溶液中脱色摇床上再次洗脱2X10min;然后依次浸入70%、95%、 100%的乙醇中脱色摇床上室温洗脱各5min;置于卡诺氏固定液中固定5min，取出玻片，瞭 干，充分曝光2-3天；
[0024] ②荧光原位杂交：用45S，5S rDNA探针进行第二次荧光原位杂交，杂交过程同步 骤2,再分别对两个探针的杂交信号进行拍照；采用成像系统分析软件将染色体和杂交信 号进行图像合成，用图像处理软件对图像进行调整。
[0025] 所述Itf_l探针是这样获得的：根据SEQ N0:1所示的核苷酸序列设计引 物扩增待测模板，所述引物为，上游引物：5' -TTCCCGATGCGTGGAGTT-3'，下游引物： 5' -CTCCATTGCGGTTGTCTTA-3'，采用PCR法合成生物素标记的核苷酸序列如SEQ NO :1所示 的探针，得到Itf_l探针；
[0026] 所述Itf_2探针是这样获得的：根据SEQ N0:2所示的核苷酸序列设计引 物扩增待测模板，所述引物为，上游引物：5' -CCCCACCTTCAACCAACT-3'，下游引物： 5' -GCAGCGGTTAGGAGGTGA-3'，采用PCR法合成地高辛标记的核苷酸序列如SEQ NO :2所示 的探针，得到Itf_2探针。
[0027] 优选的，所述卡诺氏固定液是由3份无水乙醇和1份冰醋酸配制而成。
[0028] 优选的，所述荧光原位杂交步骤④中，探针在85°C烘箱中变性3min。
[0029] 与现有技术相比，本发明具有以下特点：
[0030] 本发明利用两个DNA重复序列进行荧光原位杂交，探针的荧光信号强，易于检测， 且重复性高，有效地解决了甘薯因染色体较小，数目较多，细胞质浓厚和染色能力弱等问题 而不能通过传统的方式进行分辨识别的难题；加上45S rDNA和5S rDNA探针，总共只需要 4个探针，两次杂交即可有效排列甘薯核型的效果，为甘薯染色体鉴定和结构研宄、甘薯的 进化研宄等提供了新的技术和途径。
【附图说明】
[0031] 图1为Itf_l，Itf_2,45S，5S探针分两次对甘薯二倍体野生种I. trifida(2n = 30)染色体荧光原位杂交的镜检图片，A~D为一次荧光原位杂交结果，其中A为Itf_l探 针信号，共8对（彩图中显示为红色），B为Itf_2探针信号，共4对（彩图中显示为绿色 信号），C为染色体，D为合成图；A'~D'为二次荧光原位杂交结果，其中A'为45S探针信 号，共3对（彩图中显示为黄色），B'为5S探针信号，共1对（彩图中显示为浅蓝色），C' 为染色体，D'为合成图。
[0032] 图2为Itf_l，I