专利名称：：一种y染色体微缺失的基因检测方法
技术领域：
：本发明属于基因工程领域，更具体地说，本发明涉及一种用于检测Y染色体微缺失的方法。
背景技术：
：根据世界卫生组织(WorldHealthOrganization,WHO)的1997年的研究报告指出，在发达国家中不育夫妇占已婚育龄夫妇的15%，其中男性不育又占不育夫妇总数的50%。对于这50%的男性不育症患者，从临床资料统计来看，可将其不育的病因大体分为以下四类生精障碍、输精管道梗阻、性腺器官附属异常、及性功能异常。其中又以精子发生障碍最为常见。引起精子发生障碍的因素主要包括两个方面遗传因素和非遗传因素。遗传因素导致生精障碍而不育的比率约占不育症患者的30%,因此有关原发性无精子症及严重少精子症的遗传因素日益受到重视。Tiepolo和Zuffardi在1976年对6个无精子患者在显微镜下发现长臂1区1带(Yqll.l)远端缺失，因而推测在Yqll区上存在着Y染色体精子生成基因，提出了与精子生成密切相关的无精子因子区(azoospermiafactorregion,AZF)的概念。Vogt等人1996年的研究进一步将AZF区分为AZFa、AZFb和AZFc。Y染色体上AZF的微缺失可以造成生精障碍，导致无精症或严重少精子症。临床上利用PCR扩增的序列标签位点(STS)技术来检测Y染色体AZF微缺失，用于诊断因基因缺陷导致的无精症或严重少精子症，检出率在1%~55%之间不等。由于AZF区的部分缺失的不育男性可以通过"试管婴儿"技术生育后代，造成男性后代更为严重的Y染色体微缺失及不育，所以目前男科学要求Y染色体微缺失基因检测作为男性不育的常规检查，特别是在实行卵细胞浆内单精子注射(ICSI)和其他入工辅助生殖治疗时必须做该项检查。因此，建立一种简单、稳定的分子遗传学检测方法，对明确男性不育的病因和釆取相应的治疗方案，具有重要的临床价值。AZF区长度约为7.5Mb,利用STSs对AZF片段微缺失的定位常常需要选择多个STS位点来检测。多重PCR技术可以在同一个反应体系同时扩增多对引物(每一个位点扩增需要一对引物)，以达到简单、快速、高通量和经济地复合扩增多个基因片断的目的，是Y染色体微缺失釆用的较好的方法。但多重PCR技术相对于常规PCR方法技术含量更高。因为多重PCR要求多对引物在同一个反应条件下复合扩增，每对引物达到最适扩增效率的反应条件不一致，这就要求对复合扩增反应体系的引物使用浓度、PCR缓冲液的浓度、镁离子浓度、dNTP浓度、PCR循环数、PCR循环中的各阶段的温度、不同厂家Taq酶及用量、模板DNA用量等因素进行调整，优化复合扩增反应条件，达到最大扩增目的片断效率，同时减少非特异扩增的目的(HenegariuO.，etal.1997,BioTechniques23:504-511)。现有技术中，这一过程搡作繁瑣、失败率高，尤其是扩增效率低下导致目的片断检测不到，以及引物二聚体大量产生干扰结果判断.，对临床快速诊断带来较大麻烦。有的技术要么选择较少的引物对，要么选择添加某种化合物，以达到降低引物二聚体的目的。这样造成不能完全检测AZF片段微缺失(中国发明专利申请200410043918.0),或增加试剂成本(中国发明专利申请200710074317.X)。这是本领域一个亟待解决的技术难题。
发明内容本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种操作简单、高效、通过一次性扩增多个基因片断用于检测Y染色体微缺失的方法。本发明的目的通过下述技术方案予以实现。本发明提供了一种Y染色体微缺失的基因检测方法，该方法包括以下步1.提取人外周血基因组DNA常规煮沸裂解法或柱洗脱法提取抗凝全血250ul中的DNA，可得预期DNA产量约4-12ug，作为模板DNA;2.PCR扩增采用多重PCR引物设计，多重PCR反应体系包含N对特异扩增Y染色体AZF片断中STSs位点的嵌合引物对和1对通用引物对；多重PCR反应在N+1对引物对的参与下，在同一个反应体系中经过变性、退火、延伸循环扩增目的DNA模板的反应；3.检测扩增产物取10ulPCR产物，EB染色，经3%琼脂糖电泳。电泳电压4V/cm，电泳时间20分钟；4.结果判断a.紫外透射仪下观察电泳图谱，SRY基因作为男性性别决定基因，在实验中作为内参对照；男性标本都应扩增出内参对照条带，使用一女性样本用于监控实验的特异性和污染情况；水空白对照用来监控试剂是否被污染；b.如与正常生育男性对照相比出现一个或多个位点条带缺失，判断为其对应的AZF片断缺失；如A管的MsY254和B管的MsY255条带丢失，判断为AZFc缺失;如A管的MsY254、MsY127和B管的MsY255、MsY134条带丢失,判断为AZFb+c缺失。其中，所述的通用引物对YUP1:5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'YUP2:5，-TCACACAGGAAACAGCTATGAC-3'所述的Y染色体AZF片断STSs位点的嵌合引物对为sY84位点嵌合引物对《MsY84-F:5，-YUP1-AGAAGGGTCTGAAAGCAGGT-3，MsY84-R:5，-YUP2-GCCTACTACCTGGAGGCTTC-3，sY86位点嵌合引物对MsY86-F:5，-YUP1-AGACTATGCTTCAGCAGGTC-3，MsY86-R:5，-YUP2-GAACCGTATCTACCAAAGCAGC-3，sY127位点嵌合引物对MsY127-F:5，-YUP1-GGCTCACAAACGAAAAGAAA-3，MsY127-R:5'-YUP2-CTGCAGGCAGTAATAAGGGA-3'sY134位点嵌合引物对MsY134-F:5，-YUP1-GTCTGCCTCACCATAAAACG-3，MsY134-R:5，-YUP2-ACCACTGCCAAAACTTTCAA-3，sY254位点嵌合引物对MsY254-F:5'-YUP1-GGGTGTTACCAGAAGGCAAA-3'MsY254-R:5'-YUP2-GAACCGTATCTACCAAAGCAGC-3'sY255位点嵌合引物对MsY255-F:5，-YUP1-GTTACAGGATTCGGCGTGAT-3，MsY255-R:5，-YUP2-CTCGTCATGTGCAGCCAC-3，SRY位点嵌合引物对MSRY-F:5'-YUP1-GAATATTCCCGCTCTCCGGA-3'MSRY-R:5，-YUP2-GCTGGTGCTCCATTCTTGAG-3，所述的通用引物对为一对非人类同源序列的寡核苷酸链，不能与人基因组序列特异结合。所述的通用引物对中至少一条引物链的解链温度Tm大于65"C。通用引物对的退火温度范围从52i:~65°C。所述嵌合引物对的3'端为能与人类组基因序列互补的特异序列；嵌合引物对的正反引物5，端分别与通用引物YUP1和YUP2相同。嵌合引物5，端AG值大于3'端AG,所有嵌合引物的解链温度Tm大于70。CD所述多重PCR反应条件为1xPCRbuffer(50腦ol/LKC1,10mmol/LTris-HC1,pH9.0)，1.5mMMgCU200uMdNTP，5~10ng模板DNA，和1UTaqDNA聚合酶(Promega),50-200nM各嵌合引物浓度，200nM-luM通用引物浓度。PCR循环条件为95。C预变性5min，然后95。C变性40s，54°C退火40s，72。C延伸40s,反应30个循环后，72。C再延伸10min。所述多重PCR方法应可用于Y染色体微缺失的任何STS位点的检测。本发明的工作原理PCR技术，全称聚合酶链反应(Polymerasechainreaction,PCR),是在很短时间内体外酶促合成(扩增)特异模板DNA片断的生化反应。其过程以变性-退火-延伸三个基本反应步骤为一个循环，反复重复循环20-40次，使DNA得以扩增。PCR扩增的基本原理是半保留复制的原理在变性温度下，双链DNA解开成两条单链，利用人工合成的一对与模板DNA特异结合的寡核苷酸链作为引物，在退火温度下正、反引物分别与目标DNA的两条链结合，通过簡A聚合酶的作用在引物的3'端合成互补DNA,合成的起点是引物结合位点，方向为5'—3',按模板DNA序列合成互补片断。根据PCR扩增原理，本发明选择一对非人类同源序列的寡核苷酸链作为通用引物，取名为YUP1和YUP2。在检测AZF片段微缺失的每个STS位点序列两端设计一对特异引物。此对特异引物的正向引物的5'端加上一段非人类同源序列的寡核苷酸链YUPl,反向引物的5，端加上一段非人类同源序列的寡核苷酸链YUP2，合成一对新的嵌合引物。多个STSs位点的每对特异引物均在其正向引物寡核苷酸链的5'端加上YUP1，反向引物寡核苷酸链的5'端加上YUP2，形成嵌合引物组合。在检测AZF片段微缺失的多重PCR反应体系中，包含N个STSs位点的嵌合引物对，另外加上一对通用引物对，形成N+1引物对。整个PCR反应过程可以分为两个阶段。第一阶段包括PCR反应的前三个循环，使用嵌合引物对模板DNA进行扩增。嵌合引物对的3'端为人类基因组特异序列，能与模板DNA特异结合从而扩增目的DNA片断。扩增产物包含目的DNA片断和目的DNA片断5'端的非人类同源序列的寡核苷酸序列。第二阶段反应使用一对通用引物YUP1和YUP2对第一阶段的扩增产物进行扩增。经过第一阶段的扩增，最初多对特异性引物与不同STSs模板结合后的扩增产物的5'端均含有非人类同源序列的寡核苷酸序列。使用一对通用引物YUP1和YUP2与扩增产物的非人类同源序列结合并进行扩增，可以让多对引物的反应条件统一为一对通用引物的反应条件，最终达到稳定多对特异性引物的扩增效率。与现有技术相比，本发明具有以下突出的优点1.应用本发明，只需简单调整嵌合引物之间的引物浓度，无需优化其它复合扩增反应条件就能得到满意的扩增产物，同时扩增产物能够应用普通琼脂糖电泳观察，满足国内大多数分子生物学实验室的实验条件。2.通过一次性扩增多个基因片断，在常规引物5'端加上一段非人类同源序列的嵌合引物设计方法，以达到保证多对引物扩增效率相当，同时减少引物二聚体的形成。建立了一种简化PCR反应条件，扩增效率高，易于临床实验搡作的检测Y染色体微缺失的方法。图l为本发明Y染色体微缺失基因检测结果的电泳图。具体实施例方式下面结合具体实施例和附图，对发明作进一步的说明。通过实施例和附图可以对本发明有更清楚地了解，但值得强调的是，它们并不是对本发明保护范围的限定。人基因组DNA提取一一常规煮沸裂解法或柱洗脱法提取抗凝全血250ul中的DNA，可得预期DNA产量约4-12ug,作为模板DNA。PCR扩增——多重PCR扩增分成A管和B管进行。30ul的PCR反应体系为1XPCRbuffer(50醒ol/LKC1，10画1/LTris—HC1，pH9.0)，1.5mMMgCh，200uMdNTP，5~10ng模板DNA，和1UTaqDNA聚合酶(Promega);A管加入5对引物的浓度为MSRY0.12uM，MsY2540.luM,MsY1270.05我MsY860.1uM，YUP0.4uM;B管加入5对引物的浓度为MSRYO.luM,MsY1340.12uM，MsY840.12uM,MsY2550.05uM，YUP0.4uM，反应在ABI公司9700型PCR反应仪中进行。每次检测同时设立阳性对照(正常生育男性基因组DNA)、阴性对照(女性基因组DNA)和水空白对照。PCR循环条件为:95。C预变性5min，然后95。C变性40s,54。C复性40s,72。C延伸40s,反应30个循环后，72。C再延伸10min。PCR产物于4'C冰箱中储存。扩增产物检测_一取10ulPCR产物，EB染色，经3%琼脂糖电泳。电泳电压4V/cm,电泳时间20分钟。3%琼脂糖电泳反应产物条带位置，如表1所示。表1.<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>结果判断一一紫外透射仪下观察电泳图谱。SRY基因作为男性性别决定基因，在实验中充当内参对照。男性标本都应扩增出内参对照条带。使用一女性样本用于监控实验的特异性和污染情况。此外，水空白对照用来监控试剂是否被污染。如果与正常生育男性对照相比出现一个或多个位点条带缺失，可判断为其对应的AZF片断缺失。如A管的MsY254和B管的MsY255条带丢失，可判断为AZFc缺失；如A管的MsY254、MsY127和B管的MsY255、MsY134条带丢失，可判断为AZFb+c缺失，见图l。图l中，混和引物A管l道AZFc区缺失患者(MsY254缺失)；6道AZFb+c区缺失患者(MsY254,MsY127缺失);3，8道正常男性对照；混和引物B管2道AZFc区缺失患者(MsY255缺失)；7道AZFb+c区缺失患者(MsY255，MsY134缺失);4，9道:正常男性对照；5道:Mark实施例2AZF片段STS位点的选择根据欧洲男科学会EAA(临床层面)和欧洲分子遗传实验室质量控制协会EMQN(具体实验搡作层面)发布的《欧洲Y染色体微缺失分子诊断指南2004版本》推荐的标准进行(SIM0NIM.，etal.2004，InternationalJournalofAndrology，27，240-249)。AZFa区选择sY84和sY86位点特异性扩增AZFa区sY84的引物碱基序列为sY84-F:5，-AGAAGGGTCTGAAAGCAGGT-3'sY84-R:5，-GCCTACTACCTGGAGGCTTC-3，特异性扩增AZFa区sY86的引物碱基序列为sY86-F:5'-AGACTATGCTTCAGCAGGTC-3'sY86-R:5'-GAACCGTATCTACCAAAGCAGC-3'AZFb区选择sY127和sY134位点特异性扩增AZFb区SY127的引物碱基序列为sY127-F:5，-GGCTCACAAACGAAAAGAAA-3'sY127-R:5'-CTGCAGGCAGTAATAAGGGA-3'特异性扩增AZFb区sY134的引物碱基序列为sY134-F:5'—GTC丁GCCTCACCATAAAACG—3'sY134-R:5'-ACCACTGCCAAAACTTTCAA-3'AZFc区选择sY254和sY255位点特异性扩增AZFc区sY254的引物碱基序列为sY254-F:5，-GGGTGTTACCAGAAGGCAAA-3，sY254-R:5，-GAACCGTATCTACCAAAGCAGC-3，特异性扩增AZFc区sY255的引物碱基序列为sY255-F:5，-GTTACAGGATTCGGCGTGAT-3，sY255-R:5，-CTCGTCATGTGCAGCCAC-3，设置男性性别决定基因SRY(sexdeterminingregionY)作为内对照特异性扩增Y染色体SRY基因的引物碱基序列为SRY-F:5'-GAATATTCCCGCTCTCCGGA-3'SRY-R:5，-GCTGGTGCTCCATTCTTGAG-3，根据所述方法，Y染色体微缺失检测的各STS位点嵌合引物的碱基序列设计如下非人类同源序列通用引物YUP的引物碱基序列为YUPl:5，_CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3，YUP2:5，-TCACACAGGAAACAGCTATGAC-3，在每个特异性扩增STS位点的正、反引物5，端分别加上YUPl或YUP2寡核苷酸序列，合成嵌合引物的碱基序列，如表2所示。表2.<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>实施例3提取人外周血基因组DNA。PCR反应，多重PCR以15ul的PCR反应体系为例。反应体系(pH8.5)包括以下试剂PCR反应液，Taq酶，dATP，dGTP，dCTP，dTTP,MgCL,引物,模板DNA。dNTP反应终浓度均为200uM;MgCL反应终浓度为1.5mM。PCR扩增分成两管进行A管复合扩增5对引物；B管复合扩增5对引物，两管均设计MSRY引物作为内对照。引物对分组如下A组MSRY，MsY254(AZFc)，MsY127(AZFb)，MsY86(AZFa),YUPB组MSRY,MsY134(AZFb)，MsY84(AZFa)，MsY255(AZFc),YUPPCR循环条件95。C预变性5min，然后95。C变性40s，54。C退火40s，72。C延伸40s，反应30个循环后，72。C再延伸10min。3%琼脂糖电泳检测扩增产物。通用引物设计遵循以下条件l.通用引物为非人类同源序列，不能与人基因组序列特异结合；2.引物长度通常为18-30bp，通用引物富含GC，嵌合引物5'端AG值大于3'端AG，所有嵌合引物的解链温度Tm〉70。C;3.通用引物不能有二级结构和3'端互补碱基数尽量少。本发明设计的通用引物除具备上述条件外，其退火温度范围从52匸至65°C，适合于大多数特异扩增人基因组序列引物的退火温度条件，简化了最初引物设计的难度。权利要求1.一种Y染色体微缺失的基因检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(1)提取人外周血基因组DNA常规煮沸裂解法或柱洗脱法提取抗凝全血250ul中的DNA，可得预期DNA产量约4-12ug，作为模板DNA；(2)PCR扩增采用多重PCR引物设计，多重PCR反应体系包含N对特异扩增Y染色体AZF片断中STSs位点的嵌合引物对和1对通用引物对；多重PCR反应在N+1对引物的参与下，在同一个反应体系中经过变性、退火、延伸循环扩增目的DNA模板的反应；(3)检测扩增产物取10ulPCR产物，EB染色，经3％琼脂糖电泳。电泳电压4V/cm，电泳时间20分钟；(4)结果判断a.紫外透射仪下观察电泳图谱，SRY基因作为男性性别决定基因，在实验中作为内参对照；男性标本都应扩增出内参对照条带，使用一女性样本用于监控实验的特异性和污染情况；水空白对照用来监控试剂是否被污染；b.如与正常生育男性对照相比出现一个或多个位点条带缺失，判断为其对应的AZF片断缺失；如A管的MsY254和B管的MsY255条带丢失，判断为AZFc缺失；如A管的MsY254、MsY127和B管的MsY255、MsY134条带丢失，判断为AZFb+c缺失。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，(1)通用引物对YUP1:5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'YUP2:5，-TCACACAGGAAACAGCTATGAC-3，(2)Y染色体AZF片断STSs位点的嵌合引物对sY84位点嵌合引物对MsY84-F:5，-YUP1-AGAAGGGTCTGAAAGCAGGT-3，MsY84-R:5'-YUP2-GCCTACTACCTGGAGGCTTC-3'sY86位点嵌合引物对MsY86-F:5'-YUP1-AGACTATGCTTCAGCAGGTC-3'MsY86-R:5,-YUP2-GAACCGTATCTACCAAAGCAGC-3，sY127位点嵌合引物对MsY127-F:5'-YUP1-GGCTCACAAACGAAAAGAAA-3'MsY127-R:5'-YUP2-CTGCAGGCAGTAATAAGGGA-3'sY134位点嵌合引物对MsY134-F:5,-YUPl-GTCTGCCTCACCATAAAACG-3，MsY134-R:5'-YUP2-ACCACTGCCAAAACTTTCAA-3'sY254位点嵌合引物对MsY254-F:5'-YUP卜GGGTGTTACCAGAAGGCAAA-3'MsY254-R:5，-YUP2-GAACCGTATCTACCAAAGCAGC-3，sY255位点嵌合引物对MsY255-F:5，-YUPl-GTTACAGGATTCGGCGTGAT-3，MsY255-R:5，-YUP2-CTCGTCATGTGCAGCCAC-3，SRY位点嵌合引物对MSRY-F:5'-YUPl-GAATATTCCCGCTCTCCGGA-3'MSRY-R:5'-YUP2-GCTGGTGCTCCATTCTTGAG-3'。3.根据权利要求l所述的检测方法，其特征在于，所述通用引物对为一对非人类同源序列的寡核苷酸链。.4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述通用引物对中至少一条引物链的解链温度Tm大于65°C。通用引物对的退火温度范围从52°C~65°C。5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述嵌合引物对的3，端为能与人类基因组序列互补的特异序列；嵌合引物对的正反引物5，端分别与通用引物YUPl和YUP2相同。嵌合引物5，端AG值大于3，端AG，所有嵌合引物的解链温度Tm大于7(TC。6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述多重PCR反应条件为lxPCRbuffer(50mmol/LKCl，10,ol/LTris-HC1，pH9.0)，1.5mMMgCU200uMdNTP，5~10ng模板DNA,和1UTaqDNA聚合酶(Promega),50~200nM各嵌合引物浓度，200nM-luM通用引物浓度。PCR循环条《牛为95。C预变性5min，然后95。C变性40s,54。C退火40s，72。C延伸40s，反应30个循环后，72。C再延伸10min。7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述多重PCR方法应用于Y染色体微缺失的任何STS位点的检测。全文摘要本发明公开了一种Y染色体微缺失的基因检测方法。该方法提取人外周血基因组DNA后，采用多重PCR引物设计，多重PCR反应体系包含N对特异扩增Y染色体AZF片断中STSs位点的嵌合引物对和1对通用引物对。多重PCR反应在N+1对引物的参与下，在同一个反应体系中经过变性、退火、延伸循环扩增目的DNA模板的反应；取10ulPCR产物，EB染色，经3％琼脂糖电泳。电泳电压4V/cm，电泳时间20分钟；然后紫外透射仪下观察电泳图谱对结果作出判断。从而建立了一种简化PCR反应条件，扩增效率高，易于临床实验操作的检测方法。文档编号C12Q1/68GK101575647SQ200910094618公开日2009年11月11日申请日期2009年6月19日优先权日2009年6月19日发明者叶峻杰,张雨龙,李宗芳,李江川,君沈,磊王,王跃力,途昕明,海郭,慧阎申请人:成都军区昆明总医院