检测染色体缺失的复合扩增体系及其检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种检测染色体缺失的复合扩增体系及其检测试剂盒，本发该扩增体系包括通用—特异嵌合引物对和通用引物的混合物，通用—特异嵌合引物对分别针对D1S468、D1S436、D1S489、D19S112、D19S217和D19S902基因位点；通用引物是FluD5-Up，通用—特异嵌合引物对中的各个正向引物5’端设有FluD5-Up的序列，所述FluD5-Up为荧光标记引物；本发明的复合扩增体系及其检测试剂盒克服了不同引物需多种荧光标记的不足，在一个PCR体系内采用单荧光标记一次检测6个1p19q基因位点，结果直观可靠，省时高效，可有效的对染色体1p19q杂合性缺失进行检测分析。
【专利说明】检测染色体缺失的复合扩增体系及其检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种PCR扩增体系，以及使用该扩增体系的检测产品，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]源自神经上皮的肿瘤统称为脑胶质瘤(胶质细胞瘤)，占颅脑肿瘤的40~50%，是最常见的颅内恶性肿瘤，年发病率约为3~8人/10万人口。世界卫生组织(WHO)将胶质瘤分为4级，恶性度从低度到高度，WHOI级为良性，WHOII级为低度恶性，WHOIII级和WHOIV级为高度恶性。近年来有关胶质瘤(glioma)发生发展的分子生物学研究日渐深入，胶质瘤的神经病理学评估，不再局限于为临床提供关于肿瘤的组织学类型和恶性级别的信息，可能需要越来越多的以组织学为基础的分子标志物的便捷检测。
[0003]少突胶质细胞瘤占胶质瘤的5~18%，是胶质瘤的一种独立类型。大多数少突胶质细胞肿瘤存在I号染色体短臂(Ip)和19号染色体长臂(19q)的杂合性缺失(loss ofheterozygosity, L0H)。Ip和19q杂合性缺失检测可用于对肿瘤初发的早期诊断。总体而言，大约80%的WHOII级的少突胶质细胞瘤，60%的WHOIII级的间变型少突胶质细胞瘤，30%~50%的少突星形细胞瘤和20%~30%的间变型少突星形细胞瘤出现Ip和19q的缺失，另外小于10 %的弥漫性星形细胞瘤，包括胶质母细胞瘤中携带这种遗传改变。研究还发现,恶性胶质瘤的一种亚类具有少突胶质瘤源性,而这种亚类与其他的恶性胶质瘤在基因型上最大的不同在于这种亚类的Ip和19q具有较高的杂合性缺失率，分别为40%和60%。
[0004]Ip和19q杂合性缺失检测还可用于肿瘤复发的诊断，且具有这一分子遗传学改变的病人，其放化疗敏感性较 高，预后较好。Caimcross (1988)和Macdonald (1990)研究表明lp/19q杂合性缺失(loss of heterozygosity, L0H)是预后良好和PCV化疗方案(甲基苄肼+洛莫司汀+长春新碱)敏感的重要标志。三个前瞻性随机III期试验也证实lp/19q联合性缺失在WHOIV级的胶质瘤中是一个强有力的预后指标。研究显示染色体lp/19q杂合性缺失的少突胶质瘤患者对化疗敏感，预后好，生存期长，手术后先行PCV方案或TMZ (替莫唑胺)组成的方案化疗，放疗可推迟，作为复发时的挽救治疗。
[0005]2009年NCCN颅内肿瘤临床治疗指南建议IP LOH或lp/19q LOH的少突胶质瘤切除后可以选择单纯化疗。2012年美国临床肿瘤学会(ASCO)年会中专家称，lp/19q联合缺失的肿瘤患者，联合放化疗是最新的标准治疗。鉴于lp/19q缺失在少突胶质细胞瘤接受辅助治疗的患者中无可争议的预后意义，国外目前已经将lp/19q LOH检测作为常规检测，而国内近几年刚开展lp/19q LOH的检测。
[0006]目前，常用于检测lpl9q LOH的方法包括:突光原位杂交(fluorescent in situhybridization, FISH)、I:匕较基因组杂交(comparative genomic hybridization, CGH)矛口以 PCR 为基础的杂合性缺失检测(polymerasechain reaction-loss of heterozygosity,PCR-L0H)，三者的检测结果具有良好的一致性。FISH检测时仅需很小的肿瘤样本，且不需要外周血作对照，但在分析时要考虑细胞断面对结果的影响，同时不同于血液系统肿瘤，实体瘤染色体的制备和显带都比较困难，需要有丰富经验的专业人员操作。CGH检测是比肿瘤细胞核型分析更敏感的检测基因组获得与缺失的方法，但非肿瘤细胞的掺杂会显著降低CGH的敏感性，因此使用时需要结合纤维切割技术，而不能实现便捷、简单的检测。PCR—LOH检测是一项比较成熟的分子生物学技术，以检测者的淋巴细胞或正常组织DNA作对照，通过有无扩增片断的出现判断是否存在某种缺失。常用的判断方法包括:限制性酶切法、银染变性聚丙酰胺凝胶电泳法、荧光标记测序、凝胶电泳法和定量PCR电泳法。但是，由于限制性酶切法与银染凝胶电泳法操作相当繁杂，且结果分析掺杂因素较多，不能便捷、准确的判定测试结果。
[0007]鉴于上述情况，提供一种改良的、便捷的、高灵敏度的染色体lpl9q杂合性缺失检测试剂盒的发明是势在必行的。
【发明内容】
[0008]本发明要解决的技术问题是提供一种具有特定核苷酸序列的通用一特异嵌合引物组合，可以有效地减弱引物间的竞争与干扰因素，检测结果准确性和灵敏度高的检测染色体缺失的复合扩增体系及其检测试剂盒，该扩增体系可以实现在一个PCR体系内采用单突光标记一次检测6个lpl9q基因位点。
[0009]本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是:一种检测染色体缺失的复合扩增体系，包括通用一特异嵌合引物对和通用引物的混合物；
所述通用一特异嵌合引物对分别针对D1S468、D1S436、D1S489、D19S112、D19S217和D19S902基因位点；所述通用一特异嵌合引物对中的正向引物是Up-DIS468、Up-DIS436、Up-DlS489、Up-D19S112、Up_D19S217 和 Up_D19S902，相应的反向引物是 D1S468-R、D1S436-R、D1S489-R、 D19S112-R、D19S217-R和 D19S902-R ；
所述通用引物是FluD5-Up，所述通用一特异嵌合引物对中的各个正向引物5’端设有FluD5-Up的序列，所述FluD5-Up为荧光标记引物；
所述通用一特异嵌合引物对和通用引物的核苷酸序列如下:
Prime Name Prime Sequences (5’ -3’)
Up-DIS468 CTATACTGAGTCGTTGATCCGACACACACTTCCCTCTCC D1S468-R TTAACCGTTTTGGTCCTACC
Up-DIS436 CTATACTGAGTCGTTGATCTGAATGTGTCTCCAGTGTTAGC
DIS436-R CTGTAGAGCAATCTGGCAATATGT
Up-DIS489 CTATACTGAGTCGTTGATCAGCCAGACCAAGTCTCAACA
D1S489-R CGCGTTAACATTGCTTATCAC
Up-D19Sl12 CTATACTGAGTCGTTGATCCAGTCATTTGAAGACCAAAGA
D19S112-R GATGGACCCACAGAAACTGA
Up-D19S217 CTATACTGAGTCGTTGATCTGAAGGGGGACCTTGAAACT
D19S217-R ATCTGGGGTTGGGGTTGATT
Up-D19S902 CTATACTGAGTCGTTGATCCCATCCTAATGAGGGCAA
D19S902-R TGCGTAGAAAATTCCCAGG
FluD5-Up CTATACTGAGTCGTTGATC。[0010]上述技术方案的一种优选是:上述引物FluD5-Up的浓度是0.9μΜ~2.ΟμΜ。
[0011]一种上述技术方案的进一步优选是:所述引物Up-DlS468、Up_D19S217的浓度与引物FluD5-Up的浓度的比值为I: 25至I: 15 ;所述引物Up_DlS436和Up_DlS489的浓度与引物FluD5-Up的浓度的比值为I: 200至I: 150 ;所述引物Up_D19S902的浓度与引物FluD5-Up的浓度的比值为I: 120至I: 70 ;所述引物Up_D19S112的浓度与引物FluD5_Up的浓度的比值为 I: 300 至 I: 250 ;所述引物 D1S468-R、D1S436-R、D1S489-R、D19S112-R、D19S217-R和D19S902-R的浓度与引物FluD5-Up的浓度的比值为1: 5至1: 4。
[0012]一种上述技术方案的更进一步优选是:所述引物FluD5_Up的浓度是1.8μΜ，引物D1S468-R、D1S436-R、D1S489-R、D19S112-R、D19S217-R 和 D19S902-R 的浓度是 0.4μΜ，引物Up-DlS468 和 Up-D19S217 的浓度是 0.08μΜ，引物 Up_DlS436、Up_DlS489 的浓度是 0.Ο?μΜ,Up-D19S902 的浓度是 0.02μΜ，引物 Up_D19S112 的浓度是 0.007μΜ。
[0013]上述FluD5_Up的荧光标记为Cy5、Cy3或FAM。
[0014]上述扩增体系的总体积为ΙΟμΙ~20μ1。
[0015]上述检测染色体缺失的复合扩增体系还包括PCR缓冲液、1.5mM~2mM的Mg2+、0.2mM的dNTP、0.4U~0.6U的热启动酶和IOng~200ng的DNA模板。
[0016]本发明为解决上述技术问题提出的另一种技术方案是:一种采用上述复合扩增体系的检测染色体缺失的试剂盒。
[0017]本发明的积极效果在于:
I)本发明检测染色体缺失的复合扩增体系利用荧光标记通用引物结合6对特异性引物建立的多重PCR-CE体系，克服了普通PCR只能在一个反应体系内检测一个基因位点的不足，实现了在一个PCR体系内同时检测6个lpl9q基因位点，节约了成本，提高了效率。由于采用了特定的通用一特异嵌合引物，并且应用非生物源性通用引物做单荧光标记，避免了普通多重PCR需进行引物多种荧光标记的繁琐，既减弱了引物间的竞争与干扰因素，又节约了费用。
[0018]2)本发明的扩增体系中通用-特异嵌合引物对中的正向引物和反向引物的浓度会直接影响多重PCR的结果，尤为重要。本发明的扩增体系在配制时，使得正向引物Up-DlS468、Up-DlS436、Up_DlS489、Up_D19S112、Up_D19S217 和 Up_D19S902 的浓度低于通用引物FluD5-Up浓度，并且各个引物的浓度控制在适宜的范围内。引物FluD5-Up的浓度优选 1.8μΜ，引物 D1S468-R、D1S436-R、D1S489-R、D19S112-R、D19S217-R 和 D19S902-R的浓度优选0.4μΜ，引物Up-DlS468和Up_D19S217的浓度优选0.08μΜ,引物Up_DlS436、Up-DlS489的浓度优选0.0^M,Up-D19S902的浓度优选(λ 02μΜ，引物Up_D19S112的浓度优选0.007μΜ，该浓度配比可以有效地减弱了引物间的竞争与干扰因素，使得多重PCR的结果更加可靠。
[0019]3)本发明试剂盒进行片段分析应用的毛细管电泳片段分析技术不同于传统凝胶电泳分析模式，使PCR结果分析更直观、简洁、可靠，易于识别判断，更有利于标准化操作。
[0020]4)本发明检测试剂盒结构简单、操作便捷、使用条件可以模式化，便于大规模推广应用。
【专利附图】
【附图说明】[0021]图1是本发明的检测试剂盒的多重PCR反应原理示意图；
图2是实施例1的检测试剂盒检测样本I的血样的分型图谱；
图3是实施例1的检测试剂盒检测样本I的肿瘤组织DNA的分型图谱；
图4是实施例1的检测试剂盒检测样本I的血样和肿瘤组织DNA叠加的分型图谱；
图5是实施例1的检测试剂盒检测样本2的血样的分型图谱；
图6是实施例1的检测试剂盒检测样本2的肿瘤组织DNA的分型图谱；
图7是实施例1的检测试剂盒检测样本2的血样和肿瘤组织DNA叠加的分型图谱。
【具体实施方式】
[0022]实施例1
本实施例的检测染色体缺失的检测试剂盒至少由固定在纸质包装盒内的六只装有相应试剂的试管组成，六只试管分别是扩增缓冲液试管、Mg2+试管、dNTP试管、热启动酶试管、引物混合物试管和超纯水试管。上述试管在包装盒内的排列放置的顺序没有特别要求，只要清楚标示即可。
[0023]本实施例的检测试剂盒的开发原理及使用方法为:
A.脑胶质瘤lpl9q LOH基因位点引物设计、合成及筛选: 根据国际癌症学会推荐的脑胶质瘤lpl9q的6个基因(D1S468、D1S436、D1S489、D19S112、D19S217、D19S902)位点进行引物设计。收集脑胶质瘤者静脉全血(抗凝全血)及组织标本(新鲜肿瘤组织或石蜡切片)，使用DNA裂解液和蛋白酶K提取上述两种不同性质的人源基因组DNA，获得样本浓度区间为lOng/μΙ~lOOng/μΙ，高浓度样本用水稀释至IOOng/μ? ;以上述2例待测DNA样品先进行单重扩增筛选，再进行多重扩增，使用01igo7.0软件进行性能评价，筛选出六对引物。
[0024]通用-特异嵌合引物对中的正向引物(Up-STR_F)5’端为通用引物FluD5_Up的序列，3’端为特异引物序列段，分别命名为Up-DlS468、Up_DlS436、Up_DlS489、Up_D19S112、Up-D19S217和Up-D19S902 ;其反向引物(STR-R)采用lpl9q基因位点特异引物即可，分别命名为 D1S468-R、D1S436-R、D1S489-R、D19S112-R、D19S217-R 和 D19S902-R。
[0025]通用引物采用文献上已记载的引物。通用引物5’端做荧光素标记，分别使用FAM、CY3和CY5报告基团均可，此通用引物命名为FluD5-Up。
[0026]B.1pl9q LOH基因位点多重PCR-CE体系构建:
本实施例的试剂盒采用的PCR反应体系为多重PCR反应体系，即6个基因位点特异引物和荧光标记通用引物放在同一个PCR管内进行扩增。采用ΙΟμΙ~20μ1体系均可较好进行扩增。在考虑成本因素及经过PCR实验反复调整和优化后，优选的多重PCR反应体系总体积为10μ1，包括IOng~200ng基因组DNA、PCR缓冲液、2mM的Mg2+、0.2mM的dNTP、0.5U的热启动酶，以及引物 FluD5-Up 1.8PM，D1S468-R、D1S436-R、D1S489-R、D19S112-R、D19S217-R、D19S902-R各 0.4μΜ，Up_DlS468、Up_D19S217 各 0.08μΜ，Up_DlS436、Up_DlS489 各 0.Ο?μΜ,Up-D19S902 0.02Μ，Up-D19S112 0.007μΜ。
[0027]在多重PCR反应体系中，通用一特异嵌合引物对中的正向引物Up-STR-F的浓度为通用引物FluD5-Up浓度的数分之一，其浓度因各个基因PCR扩增效率的不同来调整。由于Up-STR-F具有lpl9q位点互补的基因序列，故PCR反应过程中，引物Up-STR-F和STR-R在热启动酶作用下首先对lpl9q基因进行5~10个循环的扩增，产生5’端带有Up的互补片段。当Up-STR-F耗尽后，FluD5-Up和STR-R在热启动酶作用下对上述PCR扩增产物进行后续扩增，产生5’端带有荧光标记的互补基因片段。上述PCR反应的原理如图1所示。
[0028]本实施例的检测试剂盒优选的PCR反应条件为:95°C预热5分钟；然后94°C变性10秒，54°C退火10秒，72°C延伸30秒，共40个循环；最后72°C延伸5分钟，4°C保温。
[0029]经上述步骤所得的PCR产物进行毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE)。利用多重荧光PCR结合毛细管电泳技术检测lpl9q基因位点，具有高效、稳定、灵敏度高、分析结果可靠等优点。优选的毛细管电泳方案为:每个样本CE体系总体积为20μ1，包括上述 PCR 产物 ?μ? ~5μ1、DNA-Size 标准液 0.2μ1 ~0.5μ1，及上样缓冲液(Sample LoadingSolution, SLS)，最后覆盖I滴石蜡油。电泳所得荧光图谱进行片段分析。
[0030]C.脑胶质瘤lpl9q LOH基因片段分析判断:
将全血和肿瘤组织标本DNA经扩增后进行毛细管电泳，所得图谱进行比对。根据图谱中标示的基因片段大小和荧光峰值峰形比较，若肿瘤组织较全血样本出现某一基因条带荧光信号减少50%以上或条带缺失即判断为Ip或19q杂合性缺失。
[0031]本实施例的检测试剂盒的使用步骤是:先进行脑胶质瘤患者肿瘤组织及对照的DNA提取；再应用多重扩增体系进行扩增；最后扩增产物经毛细管电泳后所得图谱进行lpl9q LOH分析判断。
[0032]以下是对两例脑胶质瘤患者进行lp/19q LOH检测的具体实施情况:
1、全血和肿瘤组织石蜡切片DNA提取:
取样本I或2全血样本400μ1，`加入Iml双蒸水，混匀后离心5分钟，弃去上层液1ml，加入400μ1裂解液和20μ1蛋白酶K，70°C金属浴10分钟，过离心柱，500μ1清洗液先后清洗两次后，加入50μ1洗脱液离心洗脱，测样本DNA浓度值。
[0033]取样本I或2的肿瘤组织石蜡切片5片，刮片入1.5ml离心管，加Iml 二甲苯脱腊，Iml乙醇清洗两次后，加400μ1裂解液和20μ1蛋白酶K，60°C金属浴16小时，过离心柱，500μ1清洗液先后清洗两次后，加入50μ1洗脱液离心洗脱，测样本DNA浓度值。
[0034]2、lp/19q LOH检测，具体操作步骤如下:
A.每个反应体系中加入 10XPCR 缓冲液 ?μ1、100πιΜ Mg2+。.2μ1、2.5mM dNTP 0.8μ1、5υ热启动酶 0.?μ? ；10μΜ 的 Up_DlS468、Up_DlS436、Up_DlS489、Up_D19S112、Up_D19S217 和Up-D19S902 分别按 1: 5、1:40、1:40、1:60、1: 5、1:20 的稀释比例稀释后各取 0.4μ1 ； 10μΜ 的D1S468-R、D1S436-R、D1S489-R、D19S112-R、D19S217-R 和 D19S902-R 各取 0.4μ1 ；50μΜ 的FluD5-Up取0.36μ1 ;上述DNA模板2μ1 ;最后补水至ΙΟμΙ。
[0035]所采用引物的序列如下(5’ -3’ ):
D1S468引物
Up-DIS468 CTATACTGAGTCGTTGATCCGACACACACTTCCCTCTCC D1S468-R TTAACCGTTTTGGTCCTACC D1S436引物
Up-DIS436 CTATACTGAGTCGTTGATCTGAATGTGTCTCCAGTGTTAGC DIS436-R CTGTAGAGCAATCTGGCAATATGT D1S489引物Up-DIS489 CTATACTGAGTCGTTGATCAGCCAGACCAAGTCTCAACA D1S489-R CGCGTTAACATTGCTTATCAC D19S112 引物
Up-D19Sl12 CTATACTGAGTCGTTGATCCAGTCATTTGAAGACCAAAGA D19S112-R GATGGACCCACAGAAACTGA D19S217 引物
Up-D19S217 CTATACTGAGTCGTTGATCTGAAGGGGGACCTTGAAACT D19S217-R ATCTGGGGTTGGGGTTGATT D19S902 引物
Up-D19S902 CTATACTGAGTCGTTGATCCCATCCTAATGAGGGCAA D19S902-R TGCGTAGAAAATTCCCAGG 带荧光标记的通用引物 FluD5-Up CTATACTGAGTCGTTGATC。
[0036]B.将PCR反应管置于扩增仪上，运行的PCR反应程序为:95°C预热5分钟；然后94°C变性10秒，54°C退火10秒，72°C延伸30秒，共40个循环；最后72°C延伸5分钟。4°C保存。
[0037]C.所得PCR产物置于Beckman GenomelabGeXP遗传分析仪上，按仪器使用说明进行毛细管电泳，每个CE体系总体积为20μ1，包括上述PCR产物?μ?、DNA_Size标准液0.5μ1、Sample Loading Solution 18.5μ1，最后覆盖I滴石蜡油。CE所得荧光图谱进行基因片段分析。`
[0038]3、脑胶质瘤lpl9q基因片段分析:
将上述样本I或2的全血和肿瘤组织样本CE图谱进行基因片段分析，根据图谱中标示的基因片段大小和荧光峰值峰形作同步比较，如图2至图7所示，横坐标为基因片段碱基数值，纵坐标为荧光数值，横坐标从左到右的基因片段顺序依次为针对D19S112、D1S489、D1S468、D1S436、D19S217、D19S902的扩增片段，其中图2和图5为全血样本基因片段分析图，图3和图6为肿瘤组织样本片段分析图，图4和图7为叠加后的比较图。其中样本I均未出现基因片段的缺失现象，故判定为Ip和19q未缺失；样本2的肿瘤组织样本D19S902基因片段出现条带缺失现象，故此判定为19q L0H。
[0039]对样本I和2的血样和肿瘤组织样本，分别采用:(1)D1S468引物+通用引物；(2)D1S436引物+通用引物；(3)D1S489引物+通用引物；(4)D19S112引物+通用引物；(5)D19S217引物+通用引物；(6)D19S902引物+通用引物，进行单重PCR扩增后采用毛细管电泳分析，判定结果与上述多重PCR结果一致。
[0040]实施例2
本实施例的检测染色体缺失的复合检测试剂盒的其余部分与实施例1相同，不同之处在于:通用一特异嵌合引物对中的正向引物和反向引物的浓度不同。
[0041]实施例3
本实施例的检测染色体缺失的复合检测试剂盒的其余部分与实施例1相同，不同之处在于:通用一特异嵌合引物对中的正向引物和反向引物的浓度不同。
[0042]对比例I至对比例3对比例I至对比例3的检测试剂盒的其余部分与实施例1相同，不同之处在于:通用一特异嵌合引物对中的正向引物和反向引物的浓度不同。
[0043]实施例1至3以及对比例I至3的检测试剂盒中的正向引物和反向引物的浓度如表1所示:
表1引物浓度表
【权利要求】
1.一种检测染色体缺失的复合扩增体系，其特征在于:包括通用一特异嵌合引物对和通用引物的混合物； 所述通用一特异嵌合引物对分别针对D1S468、D1S436、D1S489、D19S112、D19S217和D19S902基因位点；所述通用一特异嵌合引物对中的正向引物是Up-DIS468、Up-DIS436、Up-DlS489、Up-D19S112、Up_D19S217 和 Up_D19S902，相应的反向引物是 D1S468-R、D1S436-R、D1S489-R、D19S112-R、D19S217-R和 D19S902-R ； 所述通用引物是FluD5-Up，所述通用一特异嵌合引物对中的各个正向引物5’端设有FluD5-Up的序列，所述FluD5-Up为荧光标记引物； 所述通用一特异嵌合引物对和通用引物的核苷酸序列如下:
2.根据权利要求1所述的检测染色体缺失的复合扩增体系，其特征在于:所述引物FluD5-Up 的浓度是 0.9μΜ ~2.ΟμΜ。
3.根据权利要求2所述的检测染色体缺失的复合扩增体系，其特征在于:所述引物Up-DlS468、Up-D19S217的浓度与引物FluD5-Up的浓度的比值为I: 25至I: 15 ;所述引物Up-DlS436和Up-DlS489的浓度与引物FluD5_Up的浓度的比值为1: 200至1: 150 ;所述引物Up-D19S902的浓度与引物FluD5-Up的浓度的比值为1: 120至1: 70 ;所述引物Up-D19S112的浓度与引物FluD5-Up的浓度的比值为I: 300至I: 250 ;所述引物 D1S468-R、D1S436-R、D1S489-R、D19S112-R、D19S217-R 和 D19S902-R 的浓度与引物FluD5-Up的浓度的比值为1: 5至1: 4。
4.根据权利要求3所述的检测染色体缺失的复合扩增体系，其特征在于:所述引物FluD5-Up 的浓度是 1.8μΜ,引物 D1S468-R、D1S436-R、D1S489-R、D19S112-R、D19S217-R和D19S902-R的浓度是0.4μΜ,引物Up_DlS468和Up_D19S217的浓度是0.08μΜ,引物Up-DlS436 和 Up-DlS489 的浓度是 0.Ο?μΜ, Up-D19S902 的浓度是 0.02μΜ，引物 Up_D19S112的浓度是0.007μΜ。
5.根据权利要求1至4之一所述的检测染色体缺失的复合扩增体系，其特征在于:所述FluD5-Up的荧光标记为Cy5、Cy3或FAM。
6.根据权利要求1至4之一所述的检测染色体缺失的复合扩增体系，其特征在于:所述扩增体系的总体积为10μL~20μ1。
7.根据权利要求1至4之一所述的检测染色体缺失的复合扩增体系，其特征在于:还包括PCR缓冲液、1.5mM~2mM的Mg2+、0.2mM的dNTP、0.4U~0.6U的热启动酶和IOng~200ng的DNA模板。
8.一种采用如权利要求1所述的复合扩增体系的检测染色体缺失的试剂盒。
【文档编号】C12Q1/68GK103805707SQ201410055170
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年2月19日 优先权日:2014年2月19日
【发明者】赵新泰, 王明 申请人:上海赛安生物医药科技有限公司