一种检测p73基因及其启动子区甲基化状态的msp法检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明属于分子诊断领域，提供了一组用于检测P73基因及其启动子区甲基化状态的引物，包含该引物组的试剂盒，以及使用该试剂盒非诊断检测P73基因及其启动子区甲基化状态的MSP方法。
【专利说明】—种检测P73基因及其启动子区甲基化状态的MSP法检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于分子诊断【技术领域】，具体的说，本发明使用甲基化和非甲基化引物对以MSP法检测P73基因及其启动子区甲基化状态。
【背景技术】
[0002]DNA甲基化修饰现象广泛存在于多种有机体中，是最早发现的修饰途径之一，是表观遗传学的重要组成部分。在正常人类的DNA中，约有3-6%的胞嘧啶被甲基化。
[0003]DNA甲基化是表观遗传学的重要研究内容之一，它可以在转录水平抑制基因的表达。甲基化通常发生在胞嘧啶的C5位，形成5-甲基胞嘧啶(5mC)，甲基化的胞嘧啶多位于CpG岛上。CpG岛是CpG 二联核苷富集区域，CG含量大于50%，长约200~500bp。哺乳动物DNA甲基化的模式只有5mC这一形式，真核生物中大约2%~7%的胞嘧啶被甲基化修饰。[0004]甲基化状态的改变是引起肿瘤的一个重要因素，这种变化包含基因组整体甲基化水平降低和CpG岛局部甲基化水平的异常升高，从而导致基因组的不稳定和抑癌基因的不表达。如果抑癌基因中有活性的等位基因失活，则发生癌症的几率提高。因此，甲基化的研究为肿瘤的早期预测、分类、分级及预后评估提供了新的依据。
[0005]甲基化特异性PCR(MSP)是Herman等首先提出的一种检测基因组DNA甲基化水平的常用方法。该法是将DNA经亚硫酸氢钠处理，非甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。在PCR反应时,设计两套不同的引物对:一对引物序列针对经亚硫酸氢钠处理后的甲基化DNA链设计，若用该对引物能扩增出片段，说明该检测位点发生了甲基化；另一引物针对经亚硫酸氢钠处理后的非甲基化DNA链设计，若用该对引物能扩增出片段，说明该检测位点没有甲基化。两对引物都具有很高的特异性，与未经处理的DNA序列无互补配对。MSP引物覆盖序列中必须含有一个或一个以上的CpG岛，以保证引物的特异性，经克隆测序就检测出引物所覆盖序列的甲基化位点，引物覆盖序列中CpG岛所占比例越高，甲基化DNA检出率越高。
[0006]这种方法经济实用，灵敏度高，可用于石蜡包埋样本，且不受内切酶的限制，无需特殊仪器，因此是目前应用最为广泛的方法。在亚硫酸氢盐处理后，即可开展MS-PCR。该法不足之处在于:你要预先知道待测片段的DNA序列，并设计出好的引物，引物的选择和设计非常关键，否则易导致假阳性；如果亚硫酸氢钠对DNA处理不完全，也易导致假阳性。可通过限制性内切酶酶解法检验PCR产物作进一步判断。
[0007]P73基因位于人类染色体1ρ36.33，含有两个启动子区域Pl和P2，是1997年由Kaghad发现的p53家族成员之一，该基因在结构、功能上与p53.基因具有相似性，被认为是一个候选的抑癌基因。但是与P53基因在人类肿瘤发生中经常发生突变不同，至今极少发现P73基因发生突变。目前研究发现，在多种实体瘤和血液系统恶性肿瘤中P73基因沉寂往往与基因甲基化有关(如Pei JH et al.The association between non-Hodgkin Lymphomaand methylation of P73.Tumor Biol 2011,32 (6):1133-1138 ;Liu K et al.Loss ofP73 expression in six non-small cell lines is associated WithSj CpG islandmethylation.Exp Mol Pathol, 2008, 84 (1):59_63)。
[0008]目前，大多数针对P73基因甲基化的检测，都是只是检测第一外显子区的甲基化状态或者是只检测启动子区的甲基化状态，而根据我们研究发现，很多P73基因甲基化标本仅仅只能检测出其中一个发生甲基化，只有少数能同时检测出启动子与第一外显子区都发生甲基化；然而，不管是启动子区发生甲基化还是第一外显子发生甲基化，都会导致P73基因表达发生抑制。所以，同时检测P73基因启动子区以及第一外显子区的CpG岛将能更加准确的判断出其甲基化状态，使得检测的结果更加准确可靠。对于研究P73甲基化与相关疾病的关系，其结果将会更加准确并且更有说服力；对于疾病的辅助诊断更加可靠。
【发明内容】
[0009]针对上述问 题，本发明提供了一组用于检测P73基因及其启动子区甲基化状态的引物，由:
[0010]序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的P73基因甲基化引物对(扩增片段长62bp)、
[0011]序列为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的P73基因非甲基化引物对(扩增片段长71bp)、
[0012]序列为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的P73基因启动子区甲基化引物对(扩增片段长179bp)
[0013]序列为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的P73基因启动子区非甲基化引物对(扩增片段长191bp)，
[0014]组成。
[0015]上述引物组可以用于制备用于检测P73基因及其启动子区甲基化状态的试剂。
[0016]本发明还提供了包含上述引物组的，检测P73基因及其启动子区甲基化状态的MSP法检测试剂盒。
[0017]此外，本发明提供了使用上述试剂盒非诊断检测P73基因及其启动子区甲基化状态的MSP方法，包括从样品中提取DNA、重硫酸盐处理DNA、使用权利要求的试剂盒中的引物进行PCR反应、根据扩增片段的大小或有无确定样品的P73基因及其启动子区甲基化状态，其中PCR反应的反应体系为:
【权利要求】
1.用于检测P73基因甲基化状态的引物组，其包含一对以上根据P73基因外显子或启动子序列设计的引物。
2.权利要求1所述的引物组，由序列为SEQID NO:1和SEQ ID NO:2的P73基因甲基化引物对、序列为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的P73基因非甲基化引物对、序列为SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6的P73基因启动子区甲基化引物对以及序列为SEQ ID NO:7和SEQID NO:8的P73基因启动子区非甲基化引物对组成。
3.权利要求2的引物组在制备用于检测P73基因及其启动子区甲基化状态的试剂中的应用。
4.一种检测P73基因及其启动子区甲基化状态的MSP法检测试剂盒，包含权利要求2的引物组。
5.权利要求4所述的试剂盒，使用该试剂盒中的各对引物进行PCR时， PCR反应的反应体系为:
6.使用权利要求4的试剂盒非诊断检测P73基因及其启动子区甲基化状态的MSP方法，包括从样品中提取DNA、重硫酸盐处理DNA、使用权利要求4的试剂盒中的各对引物进行PCR反应、根据扩增片段的大小或有无确定样品的P73基因及其启动子区甲基化状态。
7.权利要求6的方法，其中PCR反应的反应体系为:
【文档编号】C12N15/11GK103911429SQ201410054962
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年2月18日 优先权日:2014年2月18日
【发明者】汤郡, 陈南, 陈颖, 何娟 申请人:广州金域医学检验中心有限公司