一种维生素c磷酸化酶及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种维生素C磷酸化酶及其应用，包括有a)序列为SEQ?ID?NO：1酶；b)在a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有a中所述酶的活性的，由a衍生的酶。本发明提供的维生素C磷酸化酶能特异性作用于维生素C的C2位上进行磷酸化，生成相应的维生素C-2磷酸酯。因此可以利用维生素C磷酸化酶应用于工业化生产维生素C-2磷酸酯，具有很大的商业价值。
【专利说明】一种维生素C磷酸化酶及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程和酶工程领域，具体涉及一种维生素C磷酸化酶及其应用。【背景技术】
[0002]维生素C憐酸化酶(L-ascorbic acid phosphorylase)又称为维生素C_2憐酸激酶，属于酸性磷酸化酶类，是一类可以在亲核之间可以催化转移磷酸基团的酶。维生素C磷酸化酶能立体特异性作用于维生素C的C2位上进行磷酸化，生成相应的维生素C-2磷酸酯。维生素C-2磷酸酯作为维生素C的高附加值产品，克服了维生素C见光、受热易分解的缺陷，随着国内维生素C价格的持续走低，开发维生素C的高附加值产品成为了企业发展的新方向，其中维生素C-2磷酸酯就是其典型代表。目前，国内工业化生产维生素C-2磷酸酯主要是通过化学合成法，此法副产物多，产品的后提取资金投入大，而且还伴随着环境的污染等问题。利用维生素C磷酸化酶转化维生素C生产维生素C-2磷酸酯具有重要的工业应用价值。
[0003]1993 年，Tastsuro Fujio 等首次在 Pseudomonas azotocolligans ATCC12417 (即黄质杆菌)中发现了维生素C磷酸化酶从而实现了酶法生产维生素C-2磷酸酯的可能，但由于原菌 酶能力低，从而限制了其利用，因此利用基因工程策略构建维生素C磷酸化酶菌株，具有重要的现实意义。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种维生素C磷酸化酶，即一种具有工业应用价值的酶，为工业化生产维生素C磷酸酯提供了新的路径。
[0005]本发明获得的维生素C磷酸化酶基因，包含有756bp的基因，编码一个由252个氨基酸组成的蛋白质。
[0006]本发明包含的维生素C磷酸化酶，包括有:
[0007]a)序列为 SEQ ID NO:1 的酶；
[0008]b)在a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有a)中所述酶的活性的，由a)衍生的酶
[0009]编码上述维生素C磷酸化酶的核苷酸，其序列为SEQ ID NO:2。
[0010]本发明还提供用于表达上述维生素C磷酸化酶的重组表达质粒，是将序列为SEQID NO:2的核苷酸片段插入到原核表达载体中构建的。所述的原核表达载体为pET20b_。
[0011]本发明还涉及携带有表达上述维生素C磷酸化酶的重组表达质粒的重组菌。
[0012]本发明的维生素C磷酸化酶用于维生素C-2磷酸酯的应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]附图1为本发明的维生素C磷酸化酶基因DNA电泳图谱；
[0014]附图2为利用维生素C磷酸化酶能催化维生素C合成维生素C-2磷酸酯；【具体实施方式】
[0015]一、维生素C磷酸化酶筛选及检测
[0016]1、黄质杆菌(Sphingomonas trueperi)总 DNA 提取
[0017](I)将黄质杆菌(Sphingomonas trueperi)接种到MM培养基中，于30°C培养过夜。
[0018](2)按细菌基因组提取试剂盒上的方法提取。
[0019]2、编码维生素C磷酸化酶基因的扩增
[0020]通过BLAST比对得到了来黄质杆菌编码维生素C磷酸化酶的基因序列，即SEQ IDNO:1所示序列，设计一对寡核苷酸序列引物Pl和P2，其序列为:
[0021]Pl:5/ -CATGCCATGGCAATGATCCGCGGTGGCATCTTCG-3'；
[0022]P2:5/ -CCCAAGCTTTCACCAGGGGCGGACGCGAA-3'
[0023]以实例I提取的基因组DNA作为模板，扩增维生素C磷酸化酶基因。反应程序如下:95°C预变性 3min ；95°C 0.5min、60°C退火 0.5min、72°C延伸 lmin, 30 个循环；72°C延伸IOmin0得到的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测，其结果如图1。
[0024]3、表达载体及重组菌的构建
[0025]用限制性内切酶Hind III和NocI分别对载体pET20b_和质粒Τ-asp进行双酶切，胶回收pET20b_线性载体和目标基因，用T4DNA Ligase在16°C条件下连接线性载体和目标基因过夜，连接产物转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布氨苄抗生素抗性平板，通过对转化子菌落PCR和酶切验证，确认获得阳性克隆E.coli BL21 (DE3)/pET20b__asp。
[0026]4、重组菌的诱导表达和酶活力测定
[0027]接种实施例3中的重组子于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37°C，200rpm条件下培养至菌体OD值达到0.6时，添加0.4mmol/L的IPTG进行诱导，继续培养3h。取发酵液ImL于1.5mL离心管中于8000rpm下离心5min后分离上清和沉淀,沉淀用500uL的去离子水重悬并利用超声波破碎仪破碎(超4s间歇4s)，然后分别取200uL的破碎液和上清液作为粗酶液加入到800uL的酶活力测定液中，于42°C、200rpm条件下反应30min后测定菌体酶活力。
[0028]二、维生素C磷酸化酶用于合成维生素C-2磷酸酯
[0029]取30mL实施例4中培养的发酵液于50mL离心管中，于8000 Xg条件下离心5min,并收集菌体，菌体用无菌水洗涤两次后直接加入到IOmL转化液中(转化液成分为:0.4mol/L维生素C、0.2mol/L的焦磷酸钠，pH4.2)，于37°C条件下反应2.5h，每隔0.5h取样测定维生素C和维生素C-2磷酸酯的产量，结果 如图2。
【权利要求】
1.一种维生素C磷酸化酶，其特征在于，所述的维生素C磷酸化酶包括有: a)序列为SEQIDNO:1的酶; b)在a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有a)中所述酶的活性的，由a衍生的酶。
2.一种核苷酸，其特征在于所述氨基酸用于编码权利要求1所述的维生素C磷酸化酶。
3.如权利要求2所述的核苷酸，其特征在于所述的核苷酸序列为SEQID N0:2。
4.一种用于表达权利要求1所述的维生素C磷酸化酶的重组表达质粒，其特征在于，所述的重组表达质粒是将序列为SEQ ID NO:2基因插入到原核表达载体pET20b_上构建的。
5.一种重组菌，其特征在于，所述的重组菌含有权利要求4中所述的重组表达质粒。
6.权利要求1中的维生素C磷酸化酶用于工业化生产维生素C-2磷酸酯。
【文档编号】C12N9/12GK103952382SQ201410054752
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年2月17日 优先权日:2014年2月17日
【发明者】刘立明, 董晓翔 申请人:江南大学