一种运用高效液相色谱检测Tipracil或其盐酸盐有关物质的方法
【专利摘要】本发明提供了一种运用高效液相色谱检测Tipracil或其盐酸盐有关物质的方法，包括：将含有关物质的Tipracil或其盐酸盐样品用稀释液配制成检测溶液，以十八烷基硅烷键和硅胶为固定相，采用含有离子对试剂的无机盐缓冲液?有机相为流动相并进行梯度洗脱，记录HPLC谱图。与现有技术相比，本发明以十八烷基硅烷键和硅胶为填料的色谱柱，以含有离子对试剂的无机盐缓冲液体系?有机相为流动相，可以对Tipracil或其盐酸盐可能存在的杂质进行有效分离并定量测定，从而有效控制Tipracil或其盐酸盐产品的质量，专属性强，灵敏度高，准确度良好。
【专利说明】
一种运用高效液相色谱检测T i prac i I或其盐酸盐有关物质的 方法
技术领域
[0001]本发明属于分析化合物技术领域，尤其涉及一种运用高效液相色谱检测Tipracil 或其盐酸盐有关物质的方法。
【背景技术】
[0002] Tipracil或其药学上可接受的盐作为炎症性肠病治疗药的有效成分，可以提供有 效而安全的包括溃疡性结肠炎和克罗恩病的炎症性肠病治疗药。Tipracil盐酸盐(TPI)可 与核苷类似物FTD(a，a，a-三氟胸苷)组合，其中，三氟胸苷是一种核苷类抗癌药，干扰癌细 胞DNA的合成，Tipracil是胸苷磷酸化酶抑制剂，可减少三氟胸苷的降解，其组合是一种即 使在高湿度条件下也稳定的能够口服给药的医药组合物(TAS-102)，用于治疗不可切除型 或复发型晚期结直肠癌。
[0003] 2014年3月24日，大鹏药业的TAS-102获日本MHLW批准，2015年9月22日，获FDA批准 上市。Tipracil盐酸盐(TPI)化学名为5-氯-6-(2-亚氨基吡咯烷-1-基）甲基-2，4(1H，3H)_ 嘧啶二酮盐酸盐;CAS号为183204-72-0;分子式为C 9HnClN4〇2 · HC1;结构式如下：
[0004]
[0005] 在合成该化合物的过程中，有关键的中间体由于反应不完全而带到后续的反应 中，生成反应副产物;有由于起始原料纯度不高而引入的反应副产物;有由药物自身降解产 生的降解产物。以上均属于该药的有关物质，需要进行严格的质量控制，其包含的8个杂质 结构式见表1。
[0006] 表1Tipracil或其盐酸盐中杂质的结构式
[0007]
[0008] 对于Tipracil盐酸盐合成路线中引入的杂质及降解产物，在原料药需要进行严格 的质量控制。因此，实现对Tipracil盐酸盐所有潜在杂质的分离，在Tipracil盐酸盐合成工 艺的过程控制，及原料药的质量控制中均具有非常重要的意义。
【发明内容】
[0009]有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种运用高效液相色谱法检测 Tipracil或其盐酸盐有关物质的方法，该方法可对Tipracil或其盐酸盐中存在的杂质进行 有效分离并定量测定，从而有效控制Tipracil或其盐酸盐产品的质量，专属性强，灵敏度 高，准确度良好。
[0010]本发明提供了一种运用高效液相色谱检测Tipracil或其盐酸盐有关物质的方法， 包括：
[0011] 将含有关物质的Tipracil或其盐酸盐样品用稀释液配制成检测溶液，以十八烷基 硅烷键和硅胶为固定相，采用含有离子对试剂的无机盐缓冲液-有机相为流动相并进行梯 度洗脱，记录HPLC谱图。
[0012] 优选的，所述检测溶液中含有关物质的Tipracil或其盐酸盐样品的浓度为0.001 ~1·Omg/ml〇
[0013] 优选的，所述无机盐缓冲液中的无机盐为磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、 磷酸氢二钠、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵与醋酸铵中的一种或多种;所述有机相为甲醇和/或 乙腈。
[0014] 优选的，所述离子对试剂为庚烷磺酸钠和/或辛烷磺酸钠。
[0015] 优选的，所述无机盐缓冲液中无机盐的浓度为0.002~0.05mol/L;所述无机盐缓 冲液的pH值范围为2.5~6.0。
[0016]优选的，所述含有离子对试剂的无机盐缓冲液中离子对试剂的浓度为1.0~1.2g/ L〇
[0017] 优选的，所述流动相的流速为〇·8~1.2ml/min。
[0018] 优选的，所述固定相的柱温为25°C~45°C。
[0019] 优选的，所述梯度洗脱中，含有离子对试剂的无机盐缓冲液为流动相A，有机相为 流动相B，以体积百分数计，洗脱程序为:0~30min，90 %~98 % A; 30~45min，50 %~70 % A; 45 ~60min，90% ~98%A。
[0020] 优选的，所述HPLC谱图为在检测波长210~282nm记录的HPLC谱图。
[0021] 本发明提供了一种运用高效液相色谱检测Tipracil或其盐酸盐有关物质的方法， 包括:将含有关物质的Tipracil或其盐酸盐样品用稀释液配制成检测溶液，以十八烷基硅 烷键和硅胶为固定相，采用含有离子对试剂的无机盐缓冲液-有机相为流动相并进行梯度 洗脱，记录HPLC谱图。与现有技术相比，本发明以十八烷基硅烷键和硅胶为填料的色谱柱， 以含有离子对试剂的无机盐缓冲液体系-有机相为流动相，可以对Tipracil或其盐酸盐可 能存在的杂质进行有效分离并定量测定，从而有效控制Tipracil或其盐酸盐产品的质量， 专属性强，灵敏度高，准确度良好。
【附图说明】
[0022] 图1为本发明实施例1中空白溶剂的色谱图；
[0023] 图2为本发明实施例1中混合溶液的色谱图；
[0024]图3为本发明实施例2中Tipracil盐酸盐粗品的色谱图；
[0025] 图4为本发明实施例3中未破坏样品的色谱图；
[0026] 图5为本发明实施例3中酸破坏样品的色谱图；
[0027] 图6为本发明实施例3中碱破坏样品的色谱图；
[0028] 图7为本发明实施例3中氧化破坏样品的色谱图；
[0029] 图8为本发明实施例3中高温破坏样品的色谱图；
[0030] 图9为本发明实施例3中光照破坏样品的色谱图；
[0031]图10为本发明实施例4中Tipracil盐酸盐粗品的色谱图。
【具体实施方式】
[0032]下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的 实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都 属于本发明保护的范围。
[0033]本发明提供了一种运用高效液相色谱检测Tipracil或其盐酸盐有关物质的方法， 包括:将含有关物质的Tipracil或其盐酸盐的样品用稀释液配制成检测溶液，以十八烷基 硅烷键和硅胶为固定相，采用含有离子对试剂的无机盐缓冲液-有机相为流动相并进行梯 度洗脱，记录HPLC谱图。
[0034]其中，所述稀释液为本领域技术人员熟知的稀释液即可，并无特殊的限制，本发明 中优选为水、无机盐缓冲液、乙腈与无机盐缓冲液的混合溶液、甲醇与无机盐缓冲液的混合 溶液、乙腈的水溶液或甲醇的水溶液;如稀释液为无机盐缓冲液或含有无机盐缓冲液的混 合溶液，其中的无机盐缓冲液优选为与流动相相一致的无机盐缓冲液;所述乙腈与无机盐 缓冲液的混合溶液及甲醇与无机盐缓冲液的混合溶液中甲醇或乙腈的最大体积浓度优选 不超过40 % ;在本发明中，最优选地，以水作为稀释液。
[0035] 将含有关物质的Tipracil或其盐酸盐样品用稀释液配制成检测溶液;所述检测溶 液中含有关物质的Tipracil或其盐酸盐样品的浓度优选为0.001~1 .Omg/ml，更优选为 0 · 01 ~1 · Omg/L，再优选为0 · 1 ~1 · Omg/L。
[0036] 将检测溶液用高效液相色谱进行检测，其进样量优选为10~20μ1。
[0037] 本发明中，所述高效液相色谱以十八烷基硅烷键和硅胶为固定相，优选为CNW Athena C18-WP或YMC-Pack 0DS-A;其规格优选为4.6X 150mm，3μπι。
[0038] 采用含有离子对试剂的无机盐缓冲液-有机相为流动相并进行梯度洗脱;所述离 子对试剂为本领域技术人员熟知的离子对试剂即可，并无特殊的限制，本发明中优选为庚 烷磺酸钠和/或辛烷磺酸钠，更优选为庚烷磺酸钠;所述含有离子对试剂的无机盐缓冲液中 离子对试剂的浓度优选为1 .〇~1.2g/L，更优选为1. lg/L;所述无机盐缓冲液中的无机盐为 本领域技术人员熟知的可作为缓冲试剂的无机盐即可，并无特殊的限制，本发明中优选为 磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵与醋酸铵中的 一种或多种，更优选为磷酸二氢钾；所述无机盐缓冲液中无机盐的浓度优选为0.002~ 0 · 05mol/L，更优选为 0 · 005 ~0 · 03mol/L，再优选为 0 · 01 ~0 · 02mol/L，最优选为 0 · 01mol/L; 所述无机盐缓冲液的pH值优选为2.5~6.0，更优选为3~5，再优选为4~5，最优选为4.6;所 述流动相中的有机相优选为甲醇和/或乙腈，更优选为乙腈。
[0039]本发明采用加离子对的缓冲盐体系作为流动相，解决了 Tipracil或其盐酸盐及其 有关物质的分离测定问题，从而确保了 Tipracil或其盐酸盐的质量可控。
[0040] 在本发明中，所述流动相的流速优选为0.8~1.2ml/min，更优选为0.9~1. 1ml/ min，再优选为1 .Oml/min;所述固定相的柱温优选为25°C~45°C，更优选为30°C~40°C，再 优选为35°C~40°C，最优选为40°C。
[0041] 本发明采用梯度洗脱，所述梯度洗脱中，含有离子对试剂的无机盐缓冲液为流动 相A，有机相为流动相B，以体积百分数计，洗脱程序优选为为:0~30min，90 %~98 % A; 30~ 45min，50% ~70%A;45~60min，90% ~98%A;更优选为0~30min，92% ~96%A;30~ 4511^11，55%~65%八；46~60111丨11，92%~96%八 ；再优选为0~30111丨11，92%八；30~45111丨11，60% A;46 ~60min，92%A或 0 ~30min，96%A;30 ~45min，60%A;46 ~60min，96%A。
[0042] 梯度洗脱后，记录HPLC谱图，优选在检测波长210~282nm记录HPLC谱图。
[0043 ]更具体地，本发明可按照以下方法实现：
[0044]高效液相色谱仪:岛津LC-20AT，PDA检测器
[0045] 色谱柱：CNW Athena C18-WP，4.6X150mm，3ym
[0046] 流动相A:磷酸盐缓冲液(1.36g磷酸二氢钾，1. lg庚烷磺酸钠，加水1000ml)
[0047] 流动相B:乙腈
[0048] 检测波长：210nm
[0049] 流速：l.〇ml/min
[0050] 进样量：10μ1
[0051] 柱温：40 °C
[0052] 梯度程序见表2。
[0053] 表2梯度洗脱程序
[0054]
[0055] 稀释液:水
[0056] 更具体地，本发明可按照以下方法实现：
[0057] 色谱柱：YMC-Pack 0DS-A，4.6X150mm，3ym
[0058] 柱温：40 °C
[0059] 流速：l.〇ml/min
[0060] 进样量:10μ1
[0061 ] 检测波长：210nm
[0062] 流动相A:磷酸盐缓冲液（1.36g磷酸二氢钾，1. lg庚烷磺酸钠，加水1000ml)
[0063] 流动相B:乙腈 [0064]梯度洗脱程度见表3。
[0065] 表3色谱柱为YMC-Pack ODS-A时的梯度洗脱程序表
[0066]
[0067] 稀释液:水
[0068] 本发明中，所述"Tipracil或其盐酸盐"在没有明确区分的情况下，可以是 Tiprac i 1的合成品、纯品、原料药、T iprac i 1盐酸盐的合成品、纯品、原料药等以Tiprac i 1作 为主成分的产品。本发明的测定方法均适用于上述产品的质量控制，并且这些产品的有关 物质的测定方法也保护在本发明的保护范围内。
[0069] 针对现有文献对Tipracil或其盐酸盐原料及其制剂杂质鉴定研究的缺失，本发明 通过工艺试制、强制降解试验对Tipracil盐酸盐杂质进行富集、分离提纯，鉴定了 8个主要 已知杂质，并且对杂质进行了溯源归属，包括Tipracil盐酸盐的起始原料和催化剂（SM1、 512、081])、合成中间体〇?1-1)、11?瓜(^1盐酸盐合成副产物(杂质4、杂质8)及降解杂质（杂 质C、杂质D)。作为对比，通过等度洗脱分离各已知杂质，但TPI-1和SM2间分离度不符合要 求。本发明采用梯度洗脱法，经对流动相组成及比例的优化筛选，确定分析方法。同时按中 国药典2015年版第四部通则0512(高效液相色谱法)进行专属性验证，结果表明该方法可以 对Tipracil或其盐酸盐所有可能存在的杂质进行有效分离并定量测定，为Tipracil或其盐 酸盐有关物质研究提供了可靠的杂质谱参考，具有较大的积极进步效果和实际应用价值。
[0070] 由以上技术方案可知，本发明以十八烷基硅烷键和硅胶为填料的色谱柱，以含有 离子对试剂的无机盐缓冲液体系-有机相为流动相，可以对Tipracil或其盐酸盐可能存在 的杂质进行有效分离并定量测定，从而有效控制Tipracil或其盐酸盐产品的质量，专属性 强，灵敏度高，准确度良好。
[0071] 为了进一步说本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种运用高效液相色谱检 测Tipracil或其盐酸盐有关物质的方法进行详细描述。
[0072] 以下实施例中所用的试剂均为市售。
[0073] 实施例1
[0074] 仪器:岛津LC-20AT高效液相色谱仪及其工作站，PDA检测器
[0075] 色谱柱：CNW Athena C18-WP，4.6X150mm，3ym
[0076] 流动相A:磷酸盐缓冲液（1.36g磷酸二氢钾，1. lg庚烷磺酸钠，加水1000ml)
[0077] 流动相B:乙腈 [0078] 检测波长：210nm
[0079] 流速：1.0mL/min
[0080] 进样量:10yL
[0081] 柱温：40°C
[0082] 梯度洗脱程序见表4。
[0083] 表4实施例1梯度洗脱程序
[0084]
[0085] 稀释液:水
[0086] 分别取Tipracil盐酸盐、杂质A、杂质B、杂质(：、311、312、了？1-1和081]适量，加稀释 液制成含Tipracil盐酸盐约为lmg/mL、其余各物质单体约为lyg/mL的混合溶液。
[0087] 取空白溶剂即稀释液和混合溶液，按上述色谱条件进行测定，记录色谱图。
[0088] 典型色谱图见图1，图2。
[0089]图2中保留时间为10.897min的色谱峰为Tipracil盐酸盐色谱峰，其余各峰为 Tipracil盐酸盐7个杂质的色谱峰，图中各色谱峰依次为SM1、杂质C、杂质B、SM2、TPI-1、 Tipracil盐酸盐、杂质A、DBU。由图中可以看出，空白溶剂不干扰测定，杂质A与DBU间为DUB 引入杂质，非样品杂质;Tipracil盐酸盐与其各杂质均能达到良好的分离，符合中国药典的 要求。
[0090] 实施例2
[0091] 仪器:岛津LC-20AT高效液相色谱仪及其工作站，PDA检测器
[0092] 色谱柱：CNW Athena C18-WP，4.6X150mm，3ym
[0093] 流动相A:磷酸盐缓冲液（1.36g磷酸二氢钾，1. lg庚烷磺酸钠，加水1000ml)
[0094] 流动相B:乙腈
[0095] 检测波长:210nm
[0096] 流速：1.0mL/min
[0097] 进样量：10yL
[0098] 柱温：40°C
[0099] 梯度洗脱程序见表5。
[0100]表5实施例2梯度洗脱程序
[0101]
[0102] 稀释液:水
[0103] 取Tipracil盐酸盐粗品，加稀释液制成含Tipracil盐酸盐约为lmg/mL的粗品溶 液。
[0104] 取Tipracil盐酸盐粗品溶液，按上述色谱条件进行测定，记录色谱图。
[0105] 典型色谱图见图3。
[0106] 图3中，保留时间为10.844min的色谱峰为Tipracil盐酸盐色谱峰，7.266min为杂 质C、9.309min为SM2、9.845min为中间体l、16.129min为杂质A、其他为未知杂质。Tipracil 盐酸盐与其各杂质均能达到良好的分离，符合中国药典的要求。
[0107] 实施例3
[0108] 仪器:岛津LC-20AT高效液相色谱仪及其工作站，PDA检测器
[0109] 色谱柱：CNW Athena C18-WP，4.6X150mm，3ym
[0110] 流动相A:磷酸盐缓冲液（1.36g磷酸二氢钾，1. lg庚烷磺酸钠，加水1000ml)
[0111] 流动相B:乙腈
[0112] 检测波长：210nm [0113]流速：1.0mL/min
[0114] 进样量:10yL
[0115] 柱温：40 Γ
[0116] 梯度洗脱程序见表6。
[0117] 表6实施例3梯度洗脱程序
[0118]
[0119] 稀释液:水
[0120] 未破坏:取Tipracil盐酸盐10mg，置10ml量瓶中，加稀释液溶解并定容至刻度，作 为未破坏样品。
[0121] 酸破坏:取Tipracil盐酸盐10mg，置10ml量瓶中，加 O.lmol/L盐酸溶液2ml，置60°C 水浴30分钟，加0. lmol/L氢氧化钠溶液2ml中和，静置至室温，加稀释液稀释至刻度，摇匀， 作为酸破坏样品。
[0122] 碱破坏:取Tipracil盐酸盐10mg，置10ml量瓶中，加0 · lmol/L氢氧化钠溶液2ml，置 60°C水浴2分钟，加0. lmol/L盐酸溶液2ml中和，静置至室温，加稀释液稀释至刻度，摇匀，作 为碱破坏样品。
[0123] 氧化破坏：取Tipracil盐酸盐10mg，置10ml量瓶中，加3%过氧化氢溶液2ml，置60 °C水浴2小时，静置至室温，加稀释液稀释至刻度，摇匀，作为氧化破坏样品。
[0124] 高温破坏:取Tipracil盐酸盐10mg，置10ml量瓶中，置60°C条件下6小时，静置至室 温，加稀释液溶解并定容至刻度，作为高温破坏样品。
[0125] 光照破坏:取Tipracil盐酸盐10mg，置10ml量瓶中，置5000±5001 UX条件下10天， 加稀释液溶解并定容至刻度，作为光照破坏样品。
[0126] 分别取上述溶液，按上述色谱条件进行测定，记录色谱图。
[0127] 典型色谱图见图4至图9,其中图4为未破坏样品的色谱图；图5为酸破坏样品的色 谱图；图6为碱破坏样品的色谱图；图7为氧化破坏样品的色谱图，其中图7中B图为A图的局 部放大图；图8为高温破坏样品的色谱图；图9为光照破坏样品的色谱图。
[0128] 图4中保留时间为11.345min的色谱峰为Tipracil盐酸盐色谱峰，各峰分离度良 好。
[0129] 图5中保留时间为11.312min的色谱峰为Tipracil盐酸盐色谱峰，新增主要两个降 解杂质，保留时间分别为5.56311^11，7.6321^11，其中7.6321^11为杂质(：。各峰分离度良好。 [0130]图6中保留时间为11.323min的色谱峰为Tipracil盐酸盐色谱峰，新增两个主要降 解杂质，保留时间分别为5.82411^11，7.6471^11，其中7.6471^11为杂质(：。各峰分离度良好。
[0131] 图7中保留时间为11.343min的色谱峰为Tipracil盐酸盐色谱峰，新增三个主要降 解杂质，保留时间分别为6.619111丨11，7.115111丨11，7.651111丨11，其中7.115111丨11为杂质0,7.65111^11 为杂质C。各主要杂质峰分离度良好。
[0132] 图8和图9中无明显新增杂质。各峰分离度良好。
[0133] 图1至图9表明，本发明的方法简便、快捷、准确度高，可以清楚的将Tipracil盐酸 盐与其各已知或未知杂质良好分离，从而有效的控制Tipracil或其盐酸盐产品的质量。
[0134] 实施例4
[0135] 仪器:岛津LC-6AD高效液相色谱仪及其工作站，紫外检测器
[0136] 色谱柱：YMC-Pack 0DS-A，4.6X150mm，3ym
[0137] 柱温：40°C
[0138] 流速：1.0ml/min
[0139] 进样量:10μ1
[0140] 检测波长:210nm
[0141] 流动相A:磷酸盐缓冲液(1.36g磷酸二氢钾，1. lg庚烷磺酸钠，加水1000ml)
[0142] 流动相B:乙腈
[0143] 梯度洗脱程序见表7。
[0144] 表7实施例4梯度洗脱程序
[0145]
[0146] 稀释液:水
[0147] 取Tipraci 1盐酸盐粗品，加稀释液制成含Tipraci 1盐酸盐约为lmg/mL的粗品溶 液。
[0148] 取Tipracil盐酸盐粗品溶液，按上述色谱条件进行测定，记录色谱图。
[0149] 典型色谱图见图10,其中图10中B图为A图的局部放大图。
[0150] 图10中，保留时间为13.378min的色谱峰为Tipracil盐酸盐色谱峰，9.636min为杂 质C、11.451min为杂质B、11.676min 为中间体l、12.346min为SM2、17.756min为杂质A、其他 为未知杂质。Tipracil盐酸盐与其各杂质均能达到良好的分离，符合中国药典的要求。
【主权项】
1. 一种运用高效液相色谱检测Tipracil或其盐酸盐有关物质的方法，其特征在于，包 括： 将含有关物质的Tipracil或其盐酸盐样品用稀释液配制成检测溶液，以十八烷基硅烷 键和硅胶为固定相，采用含有离子对试剂的无机盐缓冲液-有机相为流动相并进行梯度洗 脱，记录HPLC谱图。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测溶液中含有关物质的Tipracil或 其盐酸盐样品的浓度为0.001~1 .〇mg/ml。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无机盐缓冲液中的无机盐为磷酸二氢 钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵与醋酸铵中的一种或多 种;所述有机相为甲醇和/或乙腈。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离子对试剂为庚烷磺酸钠和/或辛烷 磺酸钠。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无机盐缓冲液中无机盐的浓度为 0.002~0.05mol/L;所述无机盐缓冲液的pH值范围为2.5~6.0。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有离子对试剂的无机盐缓冲液中离 子对试剂的浓度为1. 〇~1.2g/L。7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相的流速为0.8~1.2ml/min。8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固定相的柱温为25°C~45°C。9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱中，含有离子对试剂的无机 盐缓冲液为流动相A，有机相为流动相B，以体积百分数计，洗脱程序为:0~30min，90 %~ 98%A;30 ~45min，50% ~70%A;45 ~60min，90% ~98%A。10. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述HPLC谱图为在检测波长210~282nm 记录的HPLC谱图。
【文档编号】G01N30/02GK105974033SQ201610597277
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年7月26日
【发明人】陈婷, 付红波, 苏晓会, 张秋佳, 方胜, 邹德超, 陈先红, 王珂
【申请人】北京科莱博医药开发有限责任公司