一种检测甲基化dna的单分子分析方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种检测甲基化DNA的单分子分析方法，属于单分子分析技术领域。
【背景技术】
[0002]纳米孔传感器可以实现微/纳米尺度上的单分子检测，在单分子分析、单分子化学反应研究等领域具有独特的价值和显著优越性。传统的纳米孔传感器使用氯化钾或氯化钠为电解液。当电泳驱动分析物分子穿过纳米孔通道时，对孔道离子流造成瞬间阻塞效应，根据电流阻塞的振幅、滞留时间及频率，可获取所测样品的浓度和化学结构等信息。纳米孔技术作为低成本、高效率的DNA检测技术，已经取得了巨大进步。目前纳米孔传感器主要以溶血素生物纳米孔为主。α -溶血素(a -Hemolysin, a HL)是由金黄色葡萄球菌分泌的一种外毒素，可在磷脂双分子层上自组装成一个蘑菇形的七聚物孔。由于其孔道的大小仅允许单链DNA分子通过，主要应用于单链DNA与RNA、离子、小分子的检测。
[0003]DNA甲基化是一种表观遗传修饰，在DNA甲基转移酶的作用下，胞嘧啶的第5位碳原子上加上一个甲基基团，变成5-甲基胞嘧啶(5-mC)。DNA甲基化能够在不改变DNA分子一级结构的情况下调节基因组的功能，在维持正常细胞功能、胚胎发育过程、遗传印记中起着重要作用。此外，甲基化状态的变化，包括基因组整体甲基化水平的降低和CpG岛局部甲基化水平的异常升高，是引起肿瘤的重要因素之一。甲基化DNA是包括癌症在内的许多疾病的一个非常重要的生物指标。因此，甲基化DNA的检测对肿瘤的筛查和风险评估、早期诊断、分期分型、预后判断及治疗监测都具有重要的意义。
[0004]常用的检测DNA甲基化的方法是将目的序列中的甲基化胞嘧啶转化为DNA序列碱基组成的变化，基本做法分为亚硫酸氢钠法和甲基化敏感的限制性内切酶法。亚硫酸氢钠法是依赖亚硫酸氢钠对甲基化和非甲基化胞嘧啶的化学活性不同来区分二者，但操作繁琐，可能因亚硫酸氢钠处理的不完全导致假阳性。甲基化敏感的限制性内切酶法是比较传统的方法，根据甲基化胞嘧啶和非甲基化胞嘧啶对特定的酶切处理的不同反应来实现，灵敏度低，可能因酶切反应的不完全而产生假阳性，并且受限制性内切酶识别位点的限制，仅能对部分位点的甲基化状态进行检测。
[0005]纳米孔技术用于甲基化DNA检测也有报道，但需用DNA聚合酶的严格控制，甲基化DNA的选择性修饰或者DNA链关键位点的化学转化。例如，在KC1中，MspA蛋白纳米孔借助phi29 DNA聚合酶实现甲基化位点的检测，这种方法需要精确地单碱基水平控制单链DNA首先通过DNA聚合酶，并且需要严格的实现单分子DNA聚合酶和单个蛋白纳米孔的偶合；在KC1中，α -溶血素蛋白质纳米孔用于甲基化DNA检测需要ferrocene/cucurbit复合物修饰DNA链和适配体共价键和纳米孔，或者Bisulfite法化学转化碱基和选择性离子探针。上述所有方法非常复杂，结果重现性差，技术要求高。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种简单、廉价，准确度高，灵敏度高，无需DNA前处理和化学修饰，便可区分和检测不同甲基化水平DNA的单分子分析方法。
[0007]本发明实现过程如下:
一种检测甲基化DNA的单分子分析方法，其特征在于:在含四甲基铵盐、四乙基铵盐、四丙基铵盐或四丁基铵盐电解液的电解池中，纳米孔传感器通过电流电化学信号区分和检测不同甲基化水平的DNA，包括未甲基化、单甲基化和多甲基化DNA，DNA包括单链，双链和发卡结构形式。所述的电解液为溶有四甲基铵盐、四乙基铵盐、四丙基铵盐或四丁基铵盐的缓冲液。
[0008]上述纳米孔传感器为蛋白质纳米单通道或固体纳米孔传感器。蛋白质纳米单通道是将膜蛋白插入脂双层形成蛋白质纳米单通道，所述膜蛋白为α -溶血素蛋白质、MspA或Phi29。蛋白质纳米单通道通过DNA滞留时间分布和事件频率的差异区分和检测不同甲基化水平的DNA，包括未甲基化、单甲基化和多甲基化DNA，DNA包括单链，双链和发卡结构形式。
[0009]上述的固体纳米孔传感器为由无机材料、高分子聚合物、碳纳米管和石墨稀形成的纳米孔。
[0010]上述检测甲基化DNA的单分子分析方法包括:
(1)四甲基氯化铵电解液中，α-溶血素蛋白质插入脂双层形成蛋白质纳米单通道；
(2)电解池顺式(蛋白质纳米单通道茎部)边单独或混合加入未甲基化、单甲基化和多甲基化DNA，呈现不同的电流信号特征，随着发卡DNA甲基化位点数增多，电流信号的长滞留事件比例降低，DNA滞留时间减小，事件频率增加。
[0011 ] 具体地说，检测发卡结构甲基化DNA的单分子分析方法包括:
(1)四甲基氯化铵电解液中，野生型α-溶血素蛋白质插入脂双层形成蛋白质纳米单通道；
(2)电解池顺式分别加入茎部区域含有0/1/2个甲基化胞嘧啶的发卡结构DNA，记录三种DNA电流信号。随着发卡DNA甲基化位点数增多，〉30ms的长滞留事件比例降低，滞留时间减小，事件频率增加。
[0012]检测单链甲基化DNA的单分子分析方法包括:
(1)四甲基氯化铵电解液中，α-溶血素蛋白质插入脂双层，形成蛋白质纳米单通道；
(2)在电解池顺式加入发卡探针和互补配对的含有0/1/2个甲基化胞嘧啶的目标单链DNA，记录三种DNA混合物电流信号，随着单链DNA甲基化位点数增多，>300 ms的长滞留事件比例降低，事件频率增加。
[0013]相对于传统的氯化钾电解液，四甲基氯化铵电解液中可以明显区分不同程度的甲基化DNA，并且随甲基化位点数增加，电流信号的变化趋势统一。随着发卡结构DNA甲基化位点数的增多，DNA在纳米孔中滞留时间变短，长滞留事件比例减小，穿过纳米孔频率增加。使用四甲基氯化铵代替传统的氯化钾或氯化钠或氯化锂电解液，可区分和检测不同甲基化程度的DNA，无需纳米孔和DNA修饰，无需DNA扩增，无需标记，具有单碱基分辨率。
[0014]本发明的创新点和积极效果:
(1)本发明检测甲基化DNA的方法是单分子分析方法，与现有的检测方法不同，需要样品量少，灵敏度高，具有单碱基分辨率；
(2)本发明无需对纳米孔和DNA修饰，无需DNA扩增，无需标记，操作简单易行； (3)本发明可以直接检测不同甲基化水平的发卡结构DNA，包括未甲基化、单甲基化和多甲基化DNA，并且，仅使用一个DNA探针可以同时检测不同甲基化程度的单链DNA，具有良好的应用性。
【附图说明】
[0015]图1是四甲基氯化铵电解液中，发卡结构甲基化DNA的检测结果(电压为+40 mV); 图2是氯化钾电解液中，发卡结构甲基化DNA的检测结果(电压为+120 mV);
图3是单链甲基化DNA与探针混合样品的检测结果(电压为+40 mV)0
【具体实施方式】
[0016]以下实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例所涉及的仪器为单分子电子检测系统(主要包括Axon 200B放大器，数-模转换器和函数发生器)。应理解，这些实施例仅用于说明发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动和修改，这些等价形式同样落于本申请所附后权利要求书限定的范围。
[0017]本发明所涉及的基于蛋白纳米通道的单分子检测技术已被广泛应用于金属离子，有机小分子、蛋白质、酶等物质的检测及第三代的DNA测序技术。但在纳米孔单分子检测中，仅使用一个DNA探针检测不同甲基化程度的DNA (包括未甲基化，单甲基化和多甲基化DNA)未见报道，本发明实施例以发卡结构DNA和单链DNA为代表性DNA，在四甲基氯化铵电解液体系中，采用α -溶血素纳米孔设计了一种检测不同甲基化程度DNA的单分子分析方法。
[0018]本发明所用的DNA序列(四甲基氯化铵更倾向于与Α-Τ碱基对作用，而poly (dG)自身又容易形成杂交结构，因此，发卡DNA采用poly (dC)作为尾巴，双螺旋区域为C-G碱基对)
0个甲基化胞嘧啶发卡DNA:
5，-CGCGCGCCCCCGCGCGCGCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3’
1个甲基化胞嘧啶发卡DNA (下划线部分为甲基化胞嘧啶):
5， -CGCGECGCCCCCGCGCGCGCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3’
2个甲基化胞嘧啶发卡DNA (下划线部分为甲基化胞嘧啶):
5，-CGCG^GCCCCCGTGCGCGCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-S ’
设计的发卡探针(阴影部分为与目标DNA互补配对区域。C-G碱基对的稳定性高于A-T碱基对，如果双螺旋区域全部为C-G碱基对，