同时制备β-淀粉酶和大豆低聚糖的方法
【专利摘要】本发明公开了一种同时制备β-淀粉酶和高纯度大豆低聚糖的方法，包括以下步骤：（1）调节大豆蛋白废水pH值，加入助滤剂和复合沉淀剂；（2）加入除盐水，再加入钙盐；（3）采用超滤膜处理；（4）采用超滤膜处理，制得β-淀粉酶；（5）采用电渗析法降电导；（6）酵母菌发酵，超滤；（7）采用模拟移动床进行色谱分离，得到大豆低聚糖组分和果糖组分。本发明的同时制备β-淀粉酶和高纯度大豆低聚糖的方法，具有以下有益效果：1、以大豆蛋白废水为原料，不但充分利用了资源，而且节约了污水处理成本。2、得到的β-淀粉酶酶活高，而且酶的耐酸性和耐温性好。3、工艺简单，成本低，并且得到的大豆低聚糖产品纯度高。
【专利说明】同时制备淀粉酶和大豆低聚糖的方法【技术领域】
[0001]本发明涉及一种同时制备(6-淀粉酶和高纯度大豆低聚糖的方法，属于大豆蛋白废水的综合应用领域。
【背景技术】
[0002]^ -淀粉酶是一种外切型淀粉酶，作用于淀粉时，从淀粉分子非还原端切断生成麦芽糖，(6-淀粉酶广泛存在于大麦、小麦、薯类和豆类等植物中，还有不少微生物能产生
淀粉酶。(6-淀粉酶在食品工业中主要用来生产麦芽糖浆，大豆(6-淀粉酶相对大麦和薯类来源的3 -淀粉酶具有耐酸性强、耐高温和稳定性好等特点，在麦芽糖浆生产过程中利用其耐酸性能及耐温性能，适当降低糖化时的PH，提高糖化温度能有效地防止杂菌污染，降低生广成本，提闻麦芽糖的生广能力。
[0003]大豆低聚糖除含有功能组分水苏糖和棉籽糖外，还含有蔗糖、葡萄糖和果糖等非功能组分，大豆低聚糖中蔗糖、葡萄糖和果糖等非功能组分含量越低，说明其质量越好。大豆低聚糖具有调节肠道菌群平衡、润肠通便、预防癌症、调节脂肪代谢、降低血压、保护肝脏、提高人体免疫力等作用，在食品中有广泛的应用。
[0004]大豆蛋白废水中含有大量可溶性物质，如蛋白质、糖类、色素以及各种离子，其中蛋白质除了大豆蛋白外，还有部分淀粉酶和蛋白酶类等，糖类中含有水苏糖、棉籽糖、蔗糖、葡萄糖和果糖等，电导大约在5000uS/cm左右，另外，还有少部分异黄酮、卵磷脂和皂甙等。这些可溶性物质是大豆深加工企业废水的主要污染源，由于其BOD和COD很高，处理起来不但成本高，而且效果较差，并且造成双重的浪费。
[0005]中国专利2013101 77110.0提到利用大豆蛋白废水生产P -淀粉酶的方法，但是没有将其中的低聚糖进行有效的提取，大豆蛋白废水综合利用率低，并且该专利没有将大豆蛋白废水中大分子量的蛋白质与(6-淀粉酶进行分离，因此得到的(6-淀粉酶酶活低。
[0006]中国专利CN100439382C和CN101538291B均公开了高纯度大豆低聚糖的纯化方法，但是前者处理方法是间歇式操作，固定相和流动相用量大，分离产物浓度低，分离成本高，不适合工业化生产；后者采用模拟移动床提纯大豆低聚糖，但是由于原料大豆低聚糖中不但含有功能组分水苏糖和棉籽糖，还含有非功能组分蔗糖、葡萄糖和果糖，并且非功能组分种类较多，采用模拟移动床进行色谱分离时，同时将多种非功能组分与多种功能组分很好的分离难度较大，因此大豆低聚糖纯度虽然较之前有了较大的提高，但是仍然不能满足消费者对大豆低聚糖产品质量的需求。
【发明内容】
[0007]针对上述现有技术，针对大豆蛋白废水处理以及3 -淀粉酶和大豆低聚糖生产现有技术存在的不足，本发明采用大豆蛋白废水为原料生产高附加值的3-淀粉酶和大豆低聚糖，并提出了复合沉淀及两级膜超滤生产3 -淀粉酶技术，以及发酵法协同模拟移动床提纯大豆低聚糖技术。[0008]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0009]一种同时制备-淀粉酶和高纯度大豆低聚糖的方法，包括以下步骤:
[0010](I)调节大豆蛋白废水pH值至3.0~5.0 (优选pH值为4.0)，然后加入助滤剂和复合沉淀剂，静置沉淀20~30min后过滤，得到滤饼和滤液；
[0011](2)将步骤(1)中得到的滤饼加入到5~10°C的除盐水(采用低温除盐水的目的是防止滤饼在磨碎过程中产生热量造成(6-淀粉酶的失活)中并磨碎分散，然后调PH至6.0~
8.0，溶解后再加入钙盐将溶出的复合沉淀剂进行沉淀，然后过滤，得到滤渣和滤液；
[0012](3)步骤(2)中得到的滤液采用截留分子量为80000~90000Da的一级超滤膜处理，从而将包括脂肪氧合酶在内的大分子量的蛋白质去除，得到透过液；
[0013](4)步骤(3)中得到的透过液采用截留分子量为10000~30000Da的二级超滤膜处理，去除小分子量的蛋白质和其它杂质，得到主要成分为(6-淀粉酶的浓缩液，然后向浓缩液中加入稳定剂和防腐剂，制得(6-淀粉酶产品；
[0014](5)步骤(1)中得到的滤液采用电渗析法降电导，然后进行反渗透浓缩，得浓缩液；
[0015](6)将步骤(5)中得到的浓缩液pH值调至4.0~6.0，灭菌后接入酵母菌进行发酵，以去除其中的葡萄糖和蔗糖(采用能发酵蔗糖和葡萄糖而不能发酵水苏糖和棉籽糖的酵母将其中的蔗糖和葡萄糖去除，减少非功能组分的种类，提高后续模拟移动床色谱提纯的分离效果)，发酵完成后离心，并将离心液采用截留分子量为3000~5000Da的超滤膜进行超滤，继续去除菌体、蛋白以及其它杂质，得透过液；
`[0016](7)将步骤(6)中得到的透过液蒸发浓缩至固形物质量浓度为40~55%，然后采用模拟移动床进行色谱分离，得到大豆低聚糖组分和果糖组分，分别蒸发浓缩后，得到纯度90%以上的大豆低聚糖产品和果糖产品。
[0017]所述步骤(1)中，大豆蛋白废水为低温豆柏分离蛋白废水。低温豆柏为经过低温脱溶生产得到的豆柏，低温豆柏蛋白质变性程度低，因此蛋白废水中P -淀粉酶酶活高，适合用于(6-淀粉酶的生产。
[0018]所述步骤(1)中，助滤剂选自硅藻土或珍珠岩，添加量为大豆蛋白废水质量的
0.5~1.0%，优选添加量为0.7%。助滤剂的作用一方面是加快过滤速度，另一方面是有利用滤饼溶解过程中3 -淀粉酶的分散，提高生产效率。
[0019]所述步骤(1)中，复合沉淀剂选自聚丙烯酸,添加量为大豆蛋白废水质量的0.1~
0.3%，优选添加量为0.2%。
[0020]所述步骤(2)中，除盐水的添加量为滤饼质量的5~8倍；钙盐选自氯化钙或碳酸钙，添加量为滤饼质量的3~6%。
[0021]所述步骤(3)中，超滤温度维持在15~25°C，压力为0.5~1.0MPa0
[0022]所述步骤(4)中，超滤温度维持在15~25°C，压力为0.5~1.0MPa，浓缩倍数为10~12倍。
[0023]所述步骤(5)中，电渗析条件为:电流密度为8~12mA/cm2，流量10~14L/h，温度 15 ~35°C。
[0024]所述步骤(6)中，酵母菌选自面包酵母或啤酒酵母，接种时，接种活化后的种子液；发酵条件为:接种量为5% (种子液占发酵液的体积数)，温度30~35°C，通气量为1:0.1~1:0.4,搅拌转速为50~100r/min,发酵时间为9~15h ;超滤膜进行超滤时,温度为20~50°C，压力为 0.5 ~1.0MPa0
[0025]所述步骤(7)中，模拟移动床色谱提纯条件为:分离剂为ZGSPC106Na、DTF_02Na或DTF-02H型离子交换树脂，洗脱剂为除盐水，分离温度为60~80°C，切换时间为15~20min，进料流速为2.5~3.5L/h。
[0026]本发明的同时制备P -淀粉酶和高纯度大豆低聚糖的方法，具有以下有益效果:
[0027]1、本发明以大豆蛋白废水为原料，不但充分利用了资源，而且节约了污水处理成本，符合国家节能减排、循环经济和废弃物资源综合利用政策。
[0028]2、本发明提出两级膜对P -淀粉酶进行提纯，得到的P -淀粉酶酶活高，而且酶的耐酸性和耐温性好，大豆P -淀粉酶作用pH为4.5~6.0，作用温度为55~64°C，大麦等其它来源的P -淀粉酶作用pH为5.1~6.0，作用温度为55~60°C，特别适合超高麦芽糖浆的生产。
[0029]3、本发明提出利用发酵法及模拟移动床色谱法进行大豆低聚糖的提纯，工艺简单，成本低，并且得到的大豆低聚糖产品纯度高。
【专利附图】
【附图说明】
[0030]图1为本发明的工艺流程图。
【具体实施方式】
[0031]下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0032]实施例1以大豆蛋白废水同时制备P -淀粉酶和大豆低聚糖
`[0033]步骤如下(工艺流程如图1所示):
[0034](I)复合沉淀
[0035]取大豆蛋白废水I吨,其中P -淀粉酶酶活为5237u/mL，调pH至5.0，加入大豆蛋白废水质量1.0%的硅藻土，再加入大豆蛋白废水质量0.3%的聚丙烯酸，20min后过滤，得到滤饼和滤液。
[0036](2)3-淀粉酶的分离
[0037]将步骤I中滤饼加入到8倍质量5~10°C的除盐水中进行研磨分散，然后调pH至
8.0溶解，再加入滤饼质量6%的氯化钙对加入的聚丙烯酸进行沉淀，然后过滤得到滤液和滤渣。
[0038](3) —级超滤
[0039]将步骤I中滤液通过截留分子量为80000~90000Da的超滤膜，超滤温度为25°C，压力为1.0MPa，得到透过液，通过酶活测定得知P -淀粉酶的透过率为87.1%。
[0040](4) 二级超滤
[0041]将步骤3中的透过液通过截留分子量为10000~30000Da的超滤膜，超滤温度为25°C，压力为1.0MPa，得到浓缩倍数为12倍的浓缩液，P -淀粉酶的截留率为83.3%，向浓缩液中加入稳定剂和防腐剂制得P -淀粉酶产品9.6公斤，收率为68.5%，酶活为93.7万u/
mLo
[0042](5)电渗析降电导[0043]将步骤I中的滤液采用电渗析法降电导，电流密度为12mA/cm2，流量为14L/h，温度为35°C，通过电渗析滤液电导率有由6430us/cm降至835us/cm，离子去除率达到87%，然后采用反渗透将滤液浓缩至干物质质量浓度12.5%。
[0044](6)发酵
[0045]将步骤5反渗透的浓缩液灭菌后接入酵母菌进行发酵，接种量为5%，发酵温度350C，通气量为1:0.4，搅拌转速为100r/min，发酵15h后离心，并经截留分子量为3000~5000Da的超滤膜超滤后得透过液，测定透过液中大豆低聚糖含量由原来的54.2%升高至78.8%。
[0046](7)模拟移动床提纯
[0047]将步骤6中的透过液蒸发浓缩至质量浓度为55%，采用ZGSPC106Na型离子交换树脂进行分离，进料流速为3.5L/h，分离温度为80°C，采用去离子水洗脱，每20min切换一次，提纯得到大豆低聚糖纯度为95.2%，收率为92%，蒸发浓缩后得到大豆低聚糖产品8.6公斤。
[0048]实施例2以大豆蛋白废水同时制备P -淀粉酶和大豆低聚糖
[0049]步骤如下:
[0050](I)复合沉淀
[0051]将大豆蛋白废水I吨,其中(6-淀粉酶酶活为5237u/mL，调pH至4.0，加入大豆蛋白废水质量0.7%的珍珠岩，再加入大豆蛋白废水质量0.2%的聚丙烯酸，20min后过滤，得到滤饼和滤液。
[0052](2)3-淀粉酶的分离
`[0053]将步骤I中滤饼加入到6倍质量5~10°C的除盐水中进行研磨分散，然后调pH至
7.0溶解，再加入滤饼质量4%的碳酸钙对加入的聚丙烯酸进行沉淀，然后过滤得到滤液和滤渣。
[0054](3) —级超滤
[0055]将步骤I中滤液通过截留分子量为80000~90000Da的超滤膜，超滤温度为20°C，压力为0.8MPa，得到透过液，通过酶活测定得知P -淀粉酶的透过率为85.4%。
[0056](4) 二级超滤
[0057]将步骤3中的透过液通过截留分子量为10000~30000Da的超滤膜，超滤温度为20°C，压力为0.8MPa，得到浓缩倍数为10倍的浓缩液，P -淀粉酶的截留率为85.9%，向浓缩液中加入稳定剂和防腐剂制得P -淀粉酶产品10.4公斤，收率为74%，酶活为91.2万u/
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[0058](5)电渗析降电导
[0059]将步骤I中的滤液采用电渗析法降电导，电流密度为10mA/cm2，流量为12L/h，温度为25°C，通过电渗析滤液电导率有由6430us/cm降至707us/cm，离子去除率达到89%，然后采用反渗透将滤液浓缩至干物质质量浓度13%。
[0060](6)发酵
[0061]将步骤5反渗透的浓缩液灭菌后接入酵母菌进行发酵，接种量为5%，发酵温度33°C，通气量为1:0.3，搅拌转速为75r/min，发酵12h后离心，并经截留分子量为3000~5000Da的超滤膜超滤后得透过液，测定透过液中大豆低聚糖含量由原来的54.2%升高至76.38%o[0062]( 7 )模拟移动床提纯
[0063]将步骤6中的透过液蒸发浓缩至质量浓度为50%，采用DTF_02Na型离子交换树脂进行分离，进料流速为3.0L/h,分离温度为70°C，采用去离子水洗脱，每ISmin切换一次，提纯得到大豆低聚糖纯度为97.6%，收率为90.2%，蒸发浓缩后得到大豆低聚糖产品8.1公斤。
[0064]实施例3以大豆蛋白废水同时制备P -淀粉酶和大豆低聚糖
[0065]步骤如下:
[0066](I)复合沉淀
[0067]将大豆蛋白废水I吨,其中P -淀粉酶酶活为5237u/mL，调pH至3.0，加入大豆蛋白废水质量0.5%的硅藻土，再加入大豆蛋白废水质量0.1%的聚丙烯酸，30min后过滤，得到滤饼和滤液。
[0068](2)3-淀粉酶的分离
[0069]将步骤I中滤饼加入到5倍质量5~10°C的除盐水中进行研磨分散，然后调pH至
6.0溶解，再加入滤饼质量3%的碳酸钙对加入的聚丙烯酸进行沉淀，然后过滤得到滤液和滤渣。
[0070](3) —级超滤
[0071]将步骤I中滤液通过截留分子量为80000~90000Da的超滤膜，超滤温度为15°C，压力为0.5MPa，得到透过液，通过酶活测定得知P -淀粉酶的透过率为82.9%。
[0072](4) 二级超滤
`[0073]将步骤3中的透过液通过截留分子量为10000~30000Da的超滤膜，超滤温度为15°C，压力为0.5MPa，得到浓缩倍数为11倍的浓缩液，@ -淀粉酶的截留率为87.1%，向浓缩液中加入稳定剂和防腐剂制得P -淀粉酶产品8.7公斤，收率为62%，酶活为90.3万u/
mLo
[0074](5)电渗析降电导
[0075]将步骤I中的滤液采用电渗析法降电导，电流密度为8mA/cm2，流量为10L/h，温度为15°C，通过电渗析滤液电导率有由6430us/cm降至707us/cm，离子去除率达到86%，然后采用反渗透将滤液浓缩至干物质质量浓度12%。
[0076](6)发酵
[0077]将步骤5反渗透的浓缩液灭菌后接入酵母菌进行发酵，接种量为5%，发酵温度30°C，通气量为1:0.1，搅拌转速为50r/min，发酵9h后离心，并经截留分子量为3000~5000Da的超滤膜超滤后得透过液，测定透过液中大豆低聚糖含量由原来的54.2%升高至73.33%。
[0078](7)模拟移动床提纯
[0079]将步骤6中的透过液蒸发浓缩至质量浓度为40%，采用DTF-02H型离子交换树脂进行分离，进料流速为2.5L/h，分离温度为60°C，采用去离子水洗脱，每15min切换一次，提纯得到大豆低聚糖纯度为91.2%，收率为87.3%，蒸发浓缩后得到大豆低聚糖产品10.7公斤。
【权利要求】
1.一种同时制备3 -淀粉酶和高纯度大豆低聚糖的方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)调节大豆蛋白废水PH值至3.0~5.0，然后加入助滤剂和复合沉淀剂，静置沉淀20~30min后过滤,得到滤饼和滤液；(2)将步骤(1)中得到的滤饼加入到5~10°C的除盐水中并磨碎分散，然后调pH至6.0~8.0，溶解后再加入钙盐将溶出的复合沉淀剂进行沉淀，然后过滤，得到滤渣和滤液； (3)步骤(2)中得到的滤液采用截留分子量为80000~90000Da的一级超滤膜处理，得到透过液； (4)步骤(3)中得到的透过液采用截留分子量为10000~30000Da的二级超滤膜处理，得到浓缩液，然后向浓缩液中加入稳定剂和防腐剂，制得(6-淀粉酶； (5)步骤(1)中得到的滤液采用电渗析法降电导，然后进行反渗透浓缩，得浓缩液； (6)将步骤(5)中得到的浓缩液pH值调至4.0~6.0，灭菌后接入酵母菌进行发酵，发酵完成后离心，并将离心液采用截留分子量为3000~5000Da的超滤膜进行超滤，得透过液； (7)将步骤(6)中得到的透过液蒸发浓缩至固形物质量浓度为40~55%，然后采用模拟移动床进行色谱分离，得到大豆低聚糖组分和果糖组分，分别蒸发浓缩后，得到大豆低聚糖和果糖。
2.根据权利要求1所述的同时制备3-淀粉酶和高纯度大豆低聚糖的方法，其特征在于:所述步骤(1)中，大豆蛋白废水为低温豆柏分离蛋白废水。
3.根据权利要求1所述的同时制备3-淀粉酶和高纯度大豆低聚糖的方法，其特征在于:所述步骤(1)中，助滤剂选自硅藻土或珍珠岩，添加量为大豆蛋白废水质量的0.5~1.0%。
4.根据权利要求1所述的同时制备3-淀粉酶和高纯度大豆低聚糖的方法，其特征在于:所述步骤(1)中，复合沉淀剂选自聚丙烯酸，添加量为大豆蛋白废水质量的0.1~0.3%。
5.根据权利要求1所述的同时制备3-淀粉酶和高纯度大豆低聚糖的方法，其特征在于:所述步骤(2)中，除盐水的添加量为滤饼质量的5~8倍；钙盐选自氯化钙或碳酸钙，添加量为滤饼质量的3~6%。
6.根据权利要求1所述的同时制备3-淀粉酶和高纯度大豆低聚糖的方法，其特征在于:所述步骤(3)中，超滤温度维持在15~25°C，压力为0.5~1.0MPa0
7.根据权利要求1所述的同时制备3-淀粉酶和高纯度大豆低聚糖的方法，其特征在于:所述步骤(4)中，超滤温度维持在15~25°C，压力为0.5~1.0MPa，浓缩倍数为10~12倍。
8.根据权利要求1所述的同时制备3-淀粉酶和高纯度大豆低聚糖的方法，其特征在于:所述步骤(5)中，电渗析条件为:电流密度为8~12mA/cm2，流量10~14L/h，温度15~35。。。
9.根据权利要求1所 述的同时制备3-淀粉酶和高纯度大豆低聚糖的方法，其特征在于:所述步骤(6)中，酵母菌选自面包酵母或啤酒酵母，接种时，接种活化后的种子液；发酵条件为:接种量为5%，温度30~35°C，通气量为1:0.1~1:0.4，搅拌转速为50~IOOr/min，发酵时间为9~15h ;超滤膜进行超滤时，温度为20~50°C，压力为0.5~1.0MPa0
10.根据权利要求1所述的同时制备(6-淀粉酶和高纯度大豆低聚糖的方法，其特征在于:所述步骤(7)中，模拟移动床色谱提纯条件为:分离剂为ZGSPC106Na、DTF_02Na或DTF-02H型离子交换树脂，洗脱剂为除盐水，分离温度为60~80°C，切换时间为15~20min，进料流速为2 .5~3.5L/h。
【文档编号】C12N9/24GK103756987SQ201410054913
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年2月18日 优先权日:2014年2月18日
【发明者】任尚美, 信成夫, 景文利, 于丽, 刘建, 范静, 张延秀 申请人:山东绿健生物技术有限公司