一种利用内源酶制备蓝蛤蛋白源ace抑制肽的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于水产品精深加工和生物技术领域，具体涉及一种利用内源酶制备蓝蛤蛋白源ACE抑制肽的方法。
【背景技术】
[0002]蓝蛤(Aloididae aloidis)是盛产于我国沿海的一种重要低值海洋贝类，肉质鲜美，壳薄肉丰满，但由于蓝蛤个体较小，食用价值不大等原因，造成丰富的蓝蛤资源未得到充分利用，多被作为对虾活饵料。蓝蛤中富含多种蛋白质，且蛋白质含量高达60%，氨基酸组成全面，其氨基酸总量和必需氨基酸总量均与贻贝相当，并且精氨酸的含量较高，根据其特性可以多角度实现蓝蛤蛋白资源的利用。
[0003]活性肽具有多种生物活性，并且易于机体吸收，同时兼具化学合成和化学修饰的便利性，吸引了越来越多的食品科学、生物学、化学及其交叉领域研宄人员的研宄兴趣。随着活性肽研宄的快速发展，伴随已有陆地蛋白资源的有限性，利用海洋低值蛋白资源开发生物活性肽将成为研宄的热点。中国国家统计局(http://www.stats.gov.cn/tjsj/)发布的数据表明2013年我国贝类海水产品产量已达1327.56万吨，高于鱼类海水产品产量(1119.32万吨)，占我国海水产品产量(3138.83万吨)的42%，居世界第一位。长期以来，我国贝类主要以鲜销为主，销售半径小，且由于难于保活、保鲜，容易死亡、变质，造成很大经济损失。利用低值贝类蛋白资源开展活性肽的研宄，实现贝类精深加工和高值化利用，不仅解决了制约贝类产业链延伸与升级所涉及的基础研宄中存在的重要瓶颈问题，而且也开辟了新的优质蛋白资源。蓝蛤等低值贝类蛋白资源活性肽的研宄逐渐受到重视。生物活性肽可细分为感官肽和生理活性肽，感官肽主要包括鲜味肽等，赵谋明等人系统深入的开展了蓝蛤蛋白源鲜味肽的制备、纯化等方面的基础和应用研宄。目前，对于蓝蛤蛋白源生理活性肽的研宄较少，未见相关报道。
【发明内容】
[0004]本发明为了解决现有技术的不足，提供了一种利用内源酶制备蓝蛤蛋白源ACE抑制肽的方法，以解决目前蓝蛤蛋白加工利用低造成优质蛋白资源浪费的问题。
[0005]本发明通过以下技术方案实现上述发明目的:所述的一种利用内源酶制备蓝蛤蛋白源ACE抑制肽的方法，包括以下步骤:
[0006]一种利用内源性蛋白酶制备蓝蛤蛋白源ACE抑制肽的方法，包括新鲜蓝蛤预处理、匀浆、内源酶激活、酶解、灭酶、脱腥、离心、冷冻干燥，其特征在于所述的内源酶激活是紫外线30W照射10-60分钟；所述的酶解是调节蓝蛤匀浆pH至4.0-11.0，并在酶解过程中不断滴加碱以维持PH恒定，温度至40-80°C条件下，利用新鲜蓝蛤内源性蛋白酶进行酶解1-10小时；所述的灭酶是100°C维持10分钟；所述脱腥是采用活性炭对酶解液进行吸附，加入占酶解液重量5%的活性炭不断搅拌吸附30分钟。
[0007]本发明所采用的ACE抑制活性的测定，具体步骤为:
[0008]取30 μ L马尿酰组胺酰亮氨酸(HHL)底物液，加入10 μ L抑制剂混合均匀，在370C ±0.5°C恒温水浴中预热3-5分钟，然后加入20 μ L血管紧张素转化酶(ACE)液充分混合，37°C保温30分钟后，再加入60 μ L的lmol/LHCl终止反应，得到反应液。同时用10 μ LpH为8.3的硼酸缓冲液替代抑制剂溶液作为空白对照组。该反应液用0.45 μ m滤膜过滤后直接用HPLC系统进行分析。色谱条件:柱温25 °C，流速0.5mL/min，流动相乙腈/水(0.05 %TFA)比例为25/75等度洗脱，检测波长228nm。
[0009]ACE抑制活性计算公式如下:
[0010]ACE 抑制活性(% ) = 100 (M-N)/M
[0011]式中:M为空白对照组中马尿酸的峰面积。
[0012]N为添加抑制剂组中马尿酸的峰面积。
[0013]本发明所提及的一种利用内源酶制备蓝蛤蛋白源ACE抑制肽的方法，制备过程中不需要添加任何外源蛋白酶，充分利用蓝蛤自身的内源性蛋白酶进行酶解，并且利用紫外线照射激活蓝蛤内源性蛋白酶进而提高蓝蛤蛋白自溶的效率。该方法操作便捷，容易控制，相对外源酶制备方法成本相对较低，适于工业化生产，而且获得的蓝蛤蛋白源ACE抑制肽产品更符合当今人们追求的天然、绿色、健康的保健理念。
【具体实施方式】
[0014]下面结合实施例对本发明进一步阐述，但不限于此。
[0015]实施例1:
[0016]新鲜蓝蛤去壳，洗净并匀浆，然后置于酶解瓶中；用紫外线30W照射10分钟；用0.1摩尔/升盐酸溶液调节蓝蛤匀浆pH至4.0，控制蓝蛤匀浆温度至80°C，利用蓝蛤内源性蛋白酶进行酶解10小时，酶解过程中不断加入0.1摩尔/升氢氧化钠维持pH恒定；酶解完成后100°C维持10分钟灭酶，冷却至室温；加入占酶解液重量5%的活性炭进行脱腥，脱腥过程中不断搅拌使活性炭与酶解液充分混合；活性炭与酶解液的混合液利用分离机进行分离；获得的澄清液进行冷冻干燥，冻干的粉末为蓝蛤蛋白源ACE抑制肽粉末，经ACE抑制活性的测定，其对ACE活性的抑制率> 40%。
[0017]实施例2:
[0018]新鲜蓝蛤去壳，洗净并匀浆，然后置于酶解瓶中；用紫外线30W照射60分钟；用0.1摩尔/升氢氧化钠溶液调节蓝蛤匀浆pH至11.0，控制蓝蛤匀浆温度至40°C，利用蓝蛤内源性蛋白酶进行酶解I小时，酶解过程中不断加入0.1摩尔/升氢氧化钠维持pH恒定；酶解完成后100°C维持10分钟灭酶，冷却至室温；加入占酶解液重量5%的活性炭进行脱腥，脱腥过程中不断搅拌使活性炭与酶解液充分混合；活性炭与酶解液的混合液利用分离机进行分离；获得的澄清液进行冷冻干燥，冻干的粉末为蓝蛤蛋白源ACE抑制肽粉末，经ACE抑制活性的测定，其对ACE活性的抑制率> 30%。
[0019]实施例3:
[0020]新鲜蓝蛤去壳，洗净并匀浆，然后置于酶解瓶中；用紫外线30W照射30分钟；用0.1摩尔/升氢氧化钠溶液调节蓝蛤匀浆pH至8.0，控制蓝蛤匀浆温度至60°C，利用蓝蛤内源性蛋白酶进行酶解5小时，酶解过程中不断加入0.1摩尔/升氢氧化钠维持pH恒定；酶解完成后100°C维持10分钟灭酶，冷却至室温；加入占酶解液重量5%的活性炭进行脱腥，脱腥过程中不断搅拌使活性炭与酶解液充分混合；活性炭与酶解液的混合液利用分离机进行分离；获得的澄清液进行冷冻干燥，冻干的粉末为蓝蛤蛋白源ACE抑制肽粉末，经ACE抑制活性的测定，其对ACE活性的抑制率> 50%。
【主权项】
1.一种利用内源酶制备蓝蛤蛋白源ACE抑制肽的方法，包括新鲜蓝蛤预处理、匀浆、内源酶激活、酶解、灭酶、脱腥、离心、冷冻干燥，其特征在于所述的内源酶激活是紫外线30W照射10-60分钟；所述的酶解是调节蓝蛤匀浆pH至4.0-11.0，并在酶解过程中不断滴加碱以维持pH恒定，温度至40-80°C条件下，利用新鲜蓝蛤内源性蛋白酶进行酶解1-10小时；所述的灭酶是100°C维持10分钟；所述脱腥是采用活性炭对酶解液进行吸附。
【专利摘要】本发明属于水产品精深加工和生物技术领域，具体涉及一种利用内源酶制备蓝蛤蛋白源ACE抑制肽的方法。本发明利用蓝蛤体内的内源性蛋白酶进行酶解，通过自溶获得天然ACE抑制肽，制备过程中不加入任何外源蛋白酶，整个制备过程包括新鲜蓝蛤预处理、匀浆、内源酶激活、酶解、灭酶、脱腥、离心、冷冻干燥。本发明不仅解决了制约贝类产业链延伸与升级所涉及的基础研究中存在的重要瓶颈问题，而且也开辟了新的优质蛋白资源。
【IPC分类】C12P21-06, C07K1-14
【公开号】CN104593466
【申请号】CN201510074989
【发明人】于志鹏, 赵文竹, 密更, 励建荣
【申请人】渤海大学
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年2月9日