一种基于自诱导仿生钛化固定化蛋白酶的方法与流程

本发明属于固定化酶制备技术领域，特别涉及一种基于自诱导仿生钛化固定化蛋白酶的方法。

背景技术：

酶的化学本质是蛋白质,其催化作用具有高选择性、高催化活性、反应条件温和、环保无污染等特点。但游离状态的酶对热、强酸、强碱、高离子强度、有机溶剂等稳定性较差,易失活,并且反应后混入催化产物等物质,纯化困难,不能重复使用。为了克服这些问题,酶固定化技术于应运而生。

传统的固定化方法有：吸附法、交联法、共价结合法、包埋法等，吸附法、交联法、共价结合法等均具有不同程度的缺陷，如：酶与载体的结合力弱、反应条件较激烈酶活回收率降低较大、酶易失活；与之相比，包埋法具有所需反应条件温和、酶分子不易泄漏、对生物活性单元失活作用小及可固定高浓度的生物活性单元等优点，得到的固定化酶的稳定性得以提高。包埋法所具有得较普遍的适用性，使其近年来得到了广泛的关注。

在传统固定化酶方法的基础上,着力研究性能优异的载体材料,已成为固定化酶技术目前最为活跃的研究方向之一。随着材料仿生学的不断发展，固定化酶领域的研究人员将仿生的思想，特别是结构仿生和过程仿生的思想引入到固定化酶载体这种特殊材料的设计和制备中，开发出了新型的固定化酶载体。

仿生矿化就是将生物矿化的机理引入无机材料的合成，以有机物组装体为模板，去控制无机物形成，制具有特殊备组装方式和多级结构特点的有机无机复合体，使材料具有优异的物理化学性能。在进行仿生矿化的过程中，无需特殊化学试剂、反应可在数分钟内完成、反应条件温和(室温、常压、中性ph)、仿生矿化过程所形成的无机载体具有纳米尺寸、多孔结构、载体物理化学性质稳定且形态可控等优点，基本上全面克服了传统溶胶凝胶法制备无机材料的缺点。

目前利用仿生矿化进行酶固定化的一般方法是利用精蛋白、细胞色素c等碱性蛋白作为诱导剂。由于固定化体系中加入了额外的蛋白质诱导剂，该方法不宜进行蛋白质水解酶类的固定化。本发明利用木瓜蛋白酶对仿生钛化的诱导作用实现仿生矿化固定化，固定化体系中无需加入额外的蛋白质诱导剂，克服了上述方法的不足。目前利用自诱导仿生钛化固定化木瓜蛋白酶的研究尚未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服传统固定化方法的缺陷，提供一种基于自诱导仿生钛化固定化木瓜蛋白酶的方法。

具体步骤为：

室温下，在固定化反应器中加入5～10ml浓度为0.1～0.3mol/l的钛前驱体溶液，再向固定化反应器中加入20～25ml用ph6.0～8.0、浓度0.02mol/l～0.12mol/l的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液配制的浓度为12mg/ml～22mg/ml游离蛋白酶溶液，使钛前驱体溶液与蛋白酶溶液的体积比为1:2～1:3；轻轻搅拌5min，5000rpm冷冻离心10min，收集沉淀。蒸馏水洗涤沉淀3次后，冷冻干燥，得到固定化酶。

所述游离蛋白酶为木瓜蛋白酶。

上述的钛前驱体溶液为二羟基双(乳酸铵)钛(iv)(ti-baldh)水溶液。

上述的钛前驱体溶液与蛋白酶溶液的体积比为1:2～1:3。

本发明的优点和效果在于：游离酶的固定化过程简单，条件温和，时间缩短，生物相容性好，能耗降低；固定化酶的酶活回收率和包埋率较高；固定化的酶稳定性好。本发明方法制备固定化蛋白酶的工艺简单，载体价廉易得，成本较低，有利于大规模的工业化生产。

附图说明

附图1为温度对木瓜蛋白酶热稳定性的影响。

附图2为固定化木瓜蛋白酶(a)、木瓜蛋白酶(b)和二氧化钛(c)的ftir谱图。

附图3为碱催化(a)、精蛋白诱导(b)和木瓜蛋白酶诱导(c)生成氧化钛的sem照片。

附图4为碱催化(a)、精蛋白诱导(b)和木瓜蛋白酶诱导(b)生成氧化钛的eds能谱。

具体实施方式

以下将通过具体的实施例进一步阐明本说明，但本发明技术方案不局限于以下所列的具体实施方式。

实施例1

室温下，在固定化反应器中加入7.5ml0.25mol/lti-baldh溶液，再向固定化反应器中加入22.5ml用ph7.5、浓度为0.06mol/l磷酸盐缓冲液配制的浓度为18mg/ml游离木瓜蛋白酶溶液，使ti-baldh溶液与木瓜蛋白酶溶液的体积比为1:3；轻轻搅拌5min，5000rpm冷冻离心10min，收集沉淀。蒸馏水洗涤沉淀3次，收集洗液、合并上清液，然后将沉淀冷冻干燥24h，所得的固定化酶酶活回收率为51.76％，木瓜蛋白酶包埋率为78.67％。

实施例2

取20mg实施例1中所获的固定化木瓜蛋白酶及游离蛋白酶在55℃水浴中保温，每1h取样品加入最适ph的磷酸盐缓冲液后，与酪蛋白于37℃水浴中振荡反应10min，测定残留酶活力，以未经保温处理的样品酶活力为100％，其它折算为相对酶活，考察固定化木瓜蛋白酶的温度稳定性。附图1是在ph7.5下，与55℃水浴下孵化5h的游离和固定化木瓜蛋白酶的相对酶活。由图可见，游离酶孵化在55℃水浴中1h后能够保持80％以上的相对酶活，但是随着孵化时间的延长，游离木瓜蛋白酶的相对活性下降迅速，在孵化5h后仅保持最初酶活的39％。而在相同条件的固定化酶却能够保持较高的酶活力，在55℃水浴中孵化5h后仍维持着高达90％以上的活性。结果显示，木瓜蛋白酶在自诱导仿生钛化固定化后的温度稳定性得到了显著性提高。

实施例3

实施例1中所获的固定化木瓜蛋白酶，样品研细后，溴化钾压片，采用傅立叶红外光谱仪测定其红外光谱，并与木瓜蛋白酶和氨水催化合成tio2的红外光谱进行比较，附图2所示。从图中可见，与谱线b对比，谱线a出现多个特征基团的吸收峰。其中，1372cm^-1为ti-o-ti反对称伸缩振动吸收峰；1116cm^-1为ti-o-h伸缩振动吸收峰；668cm^-1为ti-o-ti对称伸缩振动吸收峰；537cm^-1为ti-o-ti弯曲振动吸收峰，进一步证明了tio2的生成。此外，1652和1516cm^-1处出现的吸收峰归属于蛋白中酰胺基团(酰胺ⅰ带和ⅱ带)的振动吸收；2872cm^-1归属于蛋白中的烷基；3274cm^-1为蛋白中酰胺基团的n-h的振动吸收峰，进一步证明了生成的沉淀粒子中有木瓜蛋白酶的存在，即木瓜蛋白酶被包埋在tio2粒子中。

实施例4

实施例1中所获的固定化木瓜蛋白酶，样品研细后，采用扫描电子显微镜(sem)表征包埋菠萝蛋白酶的氧化锆的形貌和尺寸，sem附带的x射线能谱仪(eds)分析产物的元素组成。利用5ml氨水和5mlti-baldh在100℃水浴下反应1.5h以及室温下将精蛋白溶液加入到钛前驱体溶液中混合产生的沉淀作为对照。sem谱图和eds能谱分别如附图3和附图4所示。如附图3所示，氨水催化制备的氧化钛(a)和精蛋白诱导合成的氧化钛(b)均为不规则的块状颗粒，而木瓜蛋白酶诱导生成的氧化钛(c)呈层状的团聚体。eds能谱如附图4所示，氨水催化制备的氧化钛(a)中只检出氧和钛元素，而精蛋白诱导合成的氧化钛(b)和木瓜蛋白酶诱导生成的氧化钛(c)中除了氧、钛元素，还检出了与蛋白质相关的碳、氮、磷、硫等元素，证明了蛋白质的模板作用。