一种测定超氧化物歧化酶活性的方法
【专利摘要】本发明提供了一种测定超氧化物歧化酶活性的方法。解决现有技术中测定超氧化物歧化酶活性的方法存在检测困难，准确度低，重现性差的技术问题。本方法是选用邻苯三酚碱性自氧化体系，结合紫外-可见分光光度法对超氧化物歧化酶对超氧阴离子的清除作用进行评价，通过检测与超氧阴离子作用后捕集剂2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2'4-二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜吸光度的变化计算出超氧化物歧化酶对超氧阴离子的清除率，进而得出超氧化物歧化酶的活性。本方法具有重现性好，准确度高，操作简便的优点。
【专利说明】一种测定超氧化物歧化酶活性的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分析化学领域，具体涉及一种测定超氧化物歧化酶活性的方法。
【背景技术】
[0002]活性氧包括超氧阴离子、羟基自由基、过氧化氢、单线态氧等，这些粒子均十分微小。由于存在未配对的自由电子，活性氧的化学性质十分活跃。活性氧往往是生物生化过程中的一种副产品，当其过量时，机体内的活性氧会对细胞和基因结构造成损坏，引发多种疾病，如细胞毒性、衰老、癌症等。超氧阴离子是其他几种活性氧的源头，超氧化物歧化酶能够清除机体中过量的超氧阴离子，它能够催化超氧阴离子发生歧化反应，产生氧气和过氧化氢，具有抗炎、抗病毒、抗衰老等作用。因此，近年来，对测定超氧化物歧化酶活性的方法的研究备受:关注。
[0003]现有的测定超氧化物歧化酶活性的方法主要是黄嘌呤氧化酶-NBT法、肾上腺素自氧化法、Marklund邻苯三酚法、化学发光法等。但是黄嘌呤氧化酶-NBT法中，NBT产物甲臜水溶性差，需要加入助溶剂增加水溶性，因此此法应用有一定的限制。肾上腺素自氧化法和Marklund邻苯三酚法是根据肾上腺素和邻苯三酚在碱性条件下自氧化，产生超氧阴离子和有色物质，根据有色物质的含量变化测定超氧化物歧化酶活性，但是有色物质不稳定，存在时间短，因此测定有误差，重现性较差。化学发光法是通过使用化学发光剂使体系产生化学发光，间接的检测超氧阴离子的方法，该方法由于发光时间短暂，测定困难并易产生误差，重现性较差。
【发明内容】
[0004]本发明为解决现有技术中测定超氧化物歧化酶活性的方法存在检测困难，准确度低，重现性差的技术问题，而提供了一种涉及紫外-可见分光光度法测定超氧化物歧化酶的活性的方法。
`[0005]为了解决上述技术问题，本发明的测定超氧化物歧化酶活性的方法的技术方案具体如下:
[0006]一种测定超氧化物歧化酶活性的方法，该方法包括以下步骤:
[0007]步骤a、超氧阴离子产生体系缓冲溶液的配制
[0008]配制pH值为8.5~9.5的30-50毫摩尔/升的碳酸氢铵缓冲溶液；
[0009]步骤b、标准品的配制
[0010]用步骤a中的碳酸氢铵缓冲溶液将标准品配成浓度为50微摩尔/升的标准溶液，所述的标准品为2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐；
[0011]步骤C、对照品、样品和空白样品的制备
[0012]对照品的制备:取40微升0.4^8毫摩尔/升乙二胺四乙酸二钠盐，加入40微升生理盐水，加入40微升50微摩尔/升的2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐，最后加入40微升I毫摩尔/升邻苯三酚水溶液，37 V反应8~20分钟后，作为对照品，供内置紫外可见分光光度计的酶标仪测定；
[0013]样品的制备:取40微升0.4、毫摩尔/升乙二胺四乙酸二钠盐，加入40微升超氧化物歧化酶溶液，加入40微升50微摩尔/升的2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)~5~ (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐，最后加入40微升I毫摩尔/升邻苯三酚水溶液，37°C反应8~20分钟后，作为样品，供内置紫外可见分光光度计的酶标仪测定；
[0014]空白样品的制备:取40微升0.4~8毫摩尔/升乙二胺四乙酸二钠盐，加入40微升超氧化物歧化酶溶液，加入40微升50微摩尔/升的2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐，最后加入40微升水溶液，370C反应8~20分钟后，作为空白样品，供内置紫外可见分光光度计的酶标仪测定；
[0015]步骤d、对照品、样品和空白样品的检测
[0016]设定紫外-可见检测波长为450纳米，在内置紫外可见分光光度计的酶标仪中对步骤c中制备的对照品、样品和空白样品进行测定，得到对照品、样品和空白样品的吸光度
值A *tMn°n、A样S和A舶样品；
[0017]步骤e、超氧化物歧化酶的活性的计算
[0018]超氧化物歧化酶对超氧阴离子的清除率按照以下公式计算:
[0019]I样品=[A对照品-(A样品-A空白样品)]/ A对照品X 100%
[0020]式中，I为超氧化物歧化酶对超氧阴离子的清除率；
[0021]Ams为对照品中2-(4-碘苯)-3_(4-硝基苯)-5_(2’4-二磺基苯)-2H_四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜的吸光度值，无量纲；
[0022]A#s为样品中2-(4-碘苯)-3_ (4-硝基苯)-5_ (2’4-二磺基苯)-2H_四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜的吸光度值，无量纲；
[0023]A空白样品为空白样品中2_ (4-碘苯)_3_ (4_硝基苯)-5- (2’ 4_ 二横基苯)-2H-四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜的吸光度值，无量纲；
[0024]超氧化物歧化酶活性的计算公式如下:
[0025]超氧化物歧化酶活性=I /(1-1)
[0026]式中，I为超氧化物歧化酶对超氧阴离子的清除率；超氧化物歧化酶活性单位为U。
[0027]在上述技术方案中，步骤a中所述的缓冲溶液优选pH值为9.0~9.5，最优选pH值为9.3。
[0028]在上述技术方案中，步骤c中所述的乙二胺四乙酸二钠盐的浓度优选为0.1~2毫
摩尔/升，最优选为2毫摩尔/升。
[0029]本发明的测定超氧化物歧化酶活性的方法的有益效果是:
[0030]本发明的测定超氧化物歧化酶活性的方法，是选用邻苯三酚碱性自氧化体系，结合紫外-可见分光光度法对超氧化物歧化酶清除超氧阴离子的清除率进行计算，进而可得到超氧化物歧化酶的活性，避免了黄嘌呤氧化酶-NBT法产物甲臜水溶性差，应用有一定限制的缺点。同时克服了肾上腺素法、Marklund邻苯三酚自氧化法和化学发光法产物不稳定，检测困难并易产生误差的问题。
[0031]另外，本发 明的测定超氧化物歧化酶活性的方法重现性好，准确度高，操作简便。【具体实施方式】
[0032]本发明的发明思想为:本发明是选用邻苯三酚碱性自氧化体系，结合紫外-可见分光光度法对超氧化物歧化酶清除超氧阴离子的清除率进行计算，进而可得到超氧化物歧化酶的活性。
[0033]本发明选用邻苯三酚碱性自氧化体系产生超氧阴离子，以2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐为超氧阴离子捕集剂，加入超氧化物歧化酶，产物水溶性甲臜在450纳米下具有光吸收，通过产物水溶性甲臜的吸光度变化计算出超氧化物歧化酶对超氧阴离子的清除率，进而可得到超氧化物歧化酶的活性。
[0034]超氧化物歧化酶可催化超氧阴离子发生歧化反应，生成氧气和过氧化氢，从而导致与2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐反应的超氧阴离子的量减少，致使捕集剂2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐的还原产物水溶性甲臜染料的量减少；所以超氧化物歧化酶的活性可以通过捕集剂2-(4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜染料含量的变化进行评价。
[0035]实施例1
[0036]本发明提供的一种测定超氧化物歧化酶活性的方法，该方法包括以下步骤:
[0037]步骤a、超氧阴离子产生体系缓冲溶液的配制
[0038]配制浓度为50毫摩尔/升的碳酸氢铵缓冲溶液，调节pH值为9.3 ;
[0039]步骤b、标准品的配制
[0040]用步骤a中的碳酸氢铵缓冲溶液将标准品配成浓度为50微摩尔/升的标准溶液，所述的标准品为2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)_2H_四氮唑钠盐，能和超氧阴离子反应产生水溶性甲臜染料；
[0041]步骤C、对照品、样品和空白样品的制备
[0042]对照品的制备:反应总体积160微升，先加入40微升2毫摩尔/升乙二胺四乙酸二钠盐，加入40微升生理盐水，加入40微升50微摩尔/升的2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐，最后加入40微升I毫摩尔/升邻苯三酚水溶液，37°C反应12分钟后，作为对照品，供内置紫外可见分光光度计的酶标仪测定；
[0043]样品的制备:反应总体积160微升，先加入40微升2毫摩尔/升乙二胺四乙酸二钠盐，加入40微升3.12毫克/升超氧化物歧化酶标准品溶液(生理盐水溶解的)，加入40微升50微摩尔/升的2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐，最后加入40微升I毫摩尔/升邻苯三酚水溶液，37°C反应12分钟后，作为样品，供内置紫外可见分光光度计的酶标仪测定；
[0044]空白样品的制备:反应总体积160微升，先加入40微升2毫摩尔/升乙二胺四乙酸二钠盐，加入40微升3.12毫克/升超氧化物歧化酶标准品溶液(生理盐水溶解的)，加入40微升50微摩尔/升的2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐，最后加入40微升水溶液，37°C反应12分钟后，作为空白样品，供内置紫外可见分光光度计的酶标仪测定；
[0045]步骤d、对照品、样品和空白样品的检测
[0046]对照品检测:以96孔板为载体，在内置紫外可见分光光度计的酶标仪中进行测定，设定紫外-可见检测波长为450纳米，对步骤c制备的对照品进行测定，得到对照品的
吸光度值A对照品；
[0047]样品检测:以96孔板为载体，在内置紫外可见分光光度计的酶标仪中进行测定，设定紫外-可见检测波长为450纳米，对步骤c配制的样品进行测定，得到样品的吸光度值
A样品；
[0048]空白样品检测:以96孔板为载体，在内置紫外可见分光光度计的酶标仪中进行测定，设定紫外-可见检测波长为450纳米，对步骤c配制的空白样品进行测定，得到空白样
品的吸光度值A空白样品；
[0049]步骤e、超氧化物歧化酶的活性的计算
[0050]超氧化物歧化酶对超氧阴离子的清除率按照以下公式计算:
[0051]I样品=[A对照品-(A样品-A空白样品)]/ A对照品X 100%
[0052]式中，I为超氧化物歧化酶对超氧阴离子的清除率；
[0053]A对照品为对照品中2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)_5_(2’ 4_ 二磺基苯)_2H_四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜的吸光度值，无量纲；
[0054]A#s为样品中2-(4-碘苯)-3_ (4-硝基苯)-5_ (2’4-二磺基苯)-2H_四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜的吸光度值，无量纲；
[0055]A空白样品为空白样品中2_ (4-碘苯)_3_ (4_硝基苯)-5- (2’ 4_ 二横基苯)-2H-四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜的吸光度值，无量纲；
[0056]超氧化物歧化酶活性的计算公式如下:
[0057]超氧化物歧化酶活性=I /(1-1)
[0058]根据测得的对照品、样品和空白样品中2-(4-碘苯)-3_(4-硝基苯)-5_(2’ 4_ 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜的吸光度值，经计算得到
0.78毫克/升超氧化物歧化酶标准品对超氧阴离子的清除率为42%，进而得出超氧化物歧化酶标准品的活性为5.8U/ μ go
[0059]超氧化物歧化酶标准品对超氧阴离子的清除率，是超氧化物歧化酶可催化超氧阴离子发生歧化反应，生成氧气和过氧化氢，从而导致与2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’4_ 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐反应的超氧阴离子的量减少，致使捕集剂2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐的还原产物水溶性甲臜染料的量减少；所以超氧化物歧化酶对超氧阴离子的清除率是通过捕集剂2-(4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜染料含量的变化计算得到，进而得出超氧化物歧化酶标准品的活性。
[0060]实施例2
[0061]本发明提供的一种测定超氧化物歧化酶活性的方法，其包括以下步骤:
[0062]步骤a、超氧阴离子产生体系缓冲溶液的配制
[0063]配制浓度为30毫摩尔/升的碳酸氢铵缓冲溶液，调节pH值为9.5 ;
[0064]步骤b、标准品的配制
[0065]用步骤a中的碳酸氢铵缓冲溶液将标准品配成浓度为50微摩尔/升的标准溶液，所述的标准品为2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)_2H_四氮唑钠盐，能和超氧阴离子反应产生水溶性甲臜染料；[0066]步骤C、对照品、样品和空白样品的制备
[0067]对照品的制备:反应总体积160微升，先加入40微升4毫摩尔/升乙二胺四乙酸二钠盐，加入40微升生理盐水，加入40微升50微摩尔/升的2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐，最后加入40微升I毫摩尔/升邻苯三酚水溶液，37°C反应8分钟后，作为对照品，供内置紫外可见分光光度计的酶标仪测定；
[0068]样品的制备:反应总体积160微升，先加入40微升4毫摩尔/升乙二胺四乙酸二钠盐，加入40微升大鼠肝脏匀浆液(生理盐水溶解的)，加入40微升50微摩尔/升的2- (4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐，最后加入40微升I毫摩尔/升邻苯三酚水溶液，37°C反应8分钟后，作为样品，供内置紫外可见分光光度计的酶标仪测定;
[0069]空白样品的制备:反应总体积160微升，先加入40微升4毫摩尔/升乙二胺四乙酸二钠盐，加入40微升大鼠肝脏匀浆液(生理盐水溶解的)，加入40微升50微摩尔/升的2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐，最后加入40微升水溶液，37°C反应10分钟后，作为空白样品，供内置紫外可见分光光度计的酶标仪测定；
[0070]步骤d、对照品、样品和空白样品的检测
[0071]对照品检测:以96孔板为载体，在内置紫外可见分光光度计的酶标仪中进行测定，设定紫外-可见检测波长为450纳米，对步骤c制备的对照品进行测定，得到对照品的
吸光度值A5iws ；
[0072]样品检测:以96孔板为载体，在内置紫外可见分光光度计的酶标仪中进行测定，设定紫外-可见检测波长为450纳米，对步骤c配制的样品进行测定，得到样品的吸光度值
A样品；
[0073]空白样品检测:以96孔板为载体，在内置紫外可见分光光度计的酶标仪中进行测定，设定紫外-可见检测波长为450纳米，对步骤c配制的空白样品进行测定，得到空白样
品的吸光度值A空白样品；
[0074]步骤e、超氧化物歧化酶对超氧阴离子的清除率的计算
[0075]超氧化物歧化酶对超氧阴离子的清除率按照以下公式计算:
[0076]I样品=[A对照品-(A样品一A空白样品)]/ A对照品X 100%
[0077]式中，I为超氧化物歧化酶对超氧阴离子的清除率；
[0078]Ams为对照品中2-(4-碘苯)-3_(4-硝基苯)-5_(2’4-二磺基苯)-2H_四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜的吸光度值，无量纲；
[0079]A#s为样品中2-(4-碘苯)-3_ (4-硝基苯)-5_ (2’4-二磺基苯)-2H_四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜的吸光度值，无量纲；
[0080]A空白样品为空白样品中2_ (4-碘苯)_3_ (4-硝基苯)-5- (2’ 4_ 二横基苯)-2H-四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜的吸光度值，无量纲；
[0081]超氧化物歧化酶活性的计算公式如下:
[0082]超氧化物歧化酶活性=I /(1-1)
[0083]根据测得的对照品、样品和空白样品中2-(4-碘苯)-3_(4-硝基苯)-5_(2’ 4_ 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜的吸光度值，经计算得到健康大鼠肝脏中超氧化物歧化酶对超氧阴离子的清除率，再根据样品质量以及稀释倍数，换算得到健康大鼠肝脏中超氧化物歧化酶的活性为19100U/g。
[0084]健康大鼠肝脏中超氧化物歧化酶对超氧阴离子的清除率，是健康大鼠肝脏中超氧化物歧化酶可催化超氧阴离子发生歧化反应，生成氧气和过氧化氢，从而导致与2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐反应的超氧阴离子的量减少，致使捕集剂2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐的还原产物水溶性甲臜染料的量减少；所以健康大鼠肝脏中超氧化物歧化酶对超氧阴离子的清除率是通过捕集剂2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜染料含量的变化计算得到，进而得出健康大鼠肝脏中超氧化物歧化酶的活性。
[0085]实施例3
[0086]本发明提供的一种测定超氧化物歧化酶活性的方法，其包括以下步骤:
[0087]步骤a、超氧阴离子产生体系缓冲溶液的配制
[0088]配制浓度为45毫摩尔/升的碳酸氢铵缓冲溶液，调节pH值为9.0 ;
[0089]步骤b、标准品的配制
[0090]用步骤a中的碳酸氢铵缓冲溶液将标准品配成浓度为50微摩尔/升的标准溶液，所述的标准品为2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)_2H_四氮唑钠盐，能和超氧阴离子反应产生水溶性甲臜染料；
[0091]步骤C、对照品、样品和空白样品的制备
[0092]对照品的制备:反应总体积160微升，先加入40微升0.4毫摩尔/升乙二胺四乙酸二钠盐，加入40微升生理盐水，加入40微升50微摩尔/升的2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐，最后加入40微升I毫摩尔/升邻苯三酚水溶液，37°C反应16分钟后，作为对照品，供内置紫外可见分光光度计的酶标仪测定；
[0093]样品的制备:反应总体积160微升，先加入40微升0.4毫摩尔/升乙二胺四乙酸二钠盐，加入40微升大鼠肾脏匀浆液(生理盐水溶解的)，加入40微升50微摩尔/升的
2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’4-二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐，最后加入40微升I毫摩尔/升邻苯三酚水溶液，37°C反应16分钟后，作为样品，供内置紫外可见分光光度计的酶标仪测定；
[0094]空白样品的制备:反应总体积160微升，先加入40微升0.4毫摩尔/升乙二胺四乙酸二钠盐，加入40微升大鼠肾脏匀浆液(生理盐水溶解的)，加入40微升50微摩尔/升的2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐，最后加入40微升水溶液，37°C反应16分钟后，作为空白样品，供内置紫外可见分光光度计的酶标仪测定；
[0095]步骤d、对照品、样品和空白样品的检测
[0096]对照品检测:以96孔板为载体，在内置紫外可见分光光度计的酶标仪中进行测定，设定紫外-可见检测波长为450纳米，对步骤c制备的对照品进行测定，得到对照品的
吸光度值A5iws ；
[0097]样品检测:以96孔板为载体，在内置紫外可见分光光度计的酶标仪中进行测定，设定紫外-可见检测波长为450纳米，对步骤c配制的样品进行测定，得到样品的吸光度值
A样品；
[0098]空白样品检测:以96孔板为载体，在内置紫外可见分光光度计的酶标仪中进行测定，设定紫外-可见检测波长为450纳米，对步骤c配制的空白样品进行测定，得到空白样品的吸光度值A空白样品；
[0099]步骤e、超氧化物歧化酶对超氧阴离子的清除率的计算
[0100]超氧化物歧化酶对超氧阴离子的清除率按照以下公式计算:
[0101]I样品=[A对照品-(A样品一A空白样品)]/ A对照品X 100%
[0102]式中，I为超氧化物歧化酶对超氧阴离子的清除率；
[0103]A对照s为对照品中2-(4-碘苯)-3_(4-硝基苯)-5_(2’4-二磺基苯)-2H_四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜的吸光度值，无量纲；
[0104]A#s为样品中2-(4-碘苯)-3_(4-硝基苯)-5_(2’4-二磺基苯)-2H_四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜的吸光度值，无量纲；
[0105]A空白样品为空白样品中2_ (4-碘苯)_3_ (4-硝基苯)-5- (2’ 4_ 二横基苯)-2H-四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜的吸光度值，无量纲；
[0106]超氧化物歧化酶活性的计算公式如下:
[0107]超氧化物歧化酶活性=I /(1-1)
[0108]根据测得的对照品、样品和空白样品中2-(4-碘苯)-3_(4-硝基苯)-5_(2’ 4_ 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜的吸光度值，经计算得到健康大鼠肾脏中超氧化物歧化酶对超氧阴离子的清除率，再根据样品质量以及稀释倍数，换算得到健康大鼠肾脏中超氧化物歧化酶的活性为4900U/g。
[0109]健康大鼠肾脏中超氧化物歧化酶对超氧阴离子的清除率，是健康大鼠肾脏中超氧化物歧化酶可催化超氧阴离子发生歧化反应，生成氧气和过氧化氢，从而导致与2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐反应的超氧阴离子的量减少，致使捕集剂2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐的还原产物水溶性甲臜染料的量减少；所以健康大鼠肾脏中超氧化物歧化酶对超氧阴离子的清除率是通过捕集剂2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜染料含量的变化计算得到，进而得出健康大鼠肾脏中超氧化物歧化酶的活性。
[0110]实施例4
[0111]本发明提供的一种测定超氧化物歧化酶活性的方法，其包括以下步骤:
[0112]步骤a、超氧阴离子产生体系缓冲溶液的配制
[0113]配制浓度为40毫摩尔/升的碳酸氢铵缓冲溶液，调节pH值为8.5 ；
[0114]步骤b、标准品的配制
[0115]用步骤a中的碳酸氢铵缓冲溶液将标准品配成浓度为50微摩尔/升的标准溶液，所述的标准品为2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)_2H_四氮唑钠盐，能和超氧阴离子反应产生水溶性甲臜染料；
[0116]步骤C、对照品、样品和空白样品的制备
[0117]对照品的制备:反应总体积160微升，先加入40微升8毫摩尔/升乙二胺四乙酸二钠盐，加入40微升生理盐水，加入40微升50微摩尔/升的2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐，最后加入40微升I毫摩尔/升邻苯三酚水溶液，37°C反应20分钟后，作为对照品，供内置紫外可见分光光度计的酶标仪测定；
[0118]样品的制备:反应总体积160微升，先加入40微升4毫摩尔/升乙二胺四乙酸二钠盐，加入40微升大鼠血清(生理盐水稀释的)，加入40微升50微摩尔/升的2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐,最后加入40微升I毫摩尔/升邻苯三酚水溶液，37°C反应20分钟后，作为样品，供内置紫外可见分光光度计的酶标仪测定;
[0119]空白样品的制备:反应总体积160微升，先加入40微升4毫摩尔/升乙二胺四乙酸二钠盐，加入40微升大鼠血清(生理盐水稀释的)，加入40微升50微摩尔/升的2- (4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐，最后加入40微升水溶液，37 °C反应20分钟后，作为空白样品，供内置紫外可见分光光度计的酶标仪测定；
[0120]步骤d、对照品、样品和空白样品的检测
[0121]对照品检测:以96孔板为载体，在内置紫外可见分光光度计的酶标仪中进行测定，设定紫外-可见检测波长为450纳米，对步骤c制备的对照品进行测定，得到对照品的
吸光度值A5iws ；
[0122]样品检测:以96孔板为载体，在内置紫外可见分光光度计的酶标仪中进行测定，设定紫外-可见检测波长为450纳米，对步骤c配制的样品进行测定，得到样品的吸光度值
A样品；
[0123]空白样品检测:以96孔板为载体，在内置紫外可见分光光度计的酶标仪中进行测定，设定紫外-可见检测波长为450纳米，对步骤c配制的空白样品进行测定，得到空白样
品的吸光度值A空白样品；
[0124]步骤e、超氧化物歧化酶对超氧阴离子的清除率的计算
[0125]超氧化物歧化酶对超氧阴离子的清除率按照以下公式计算:
[0126]I样品=[A对照品-(A样品一A空白样品)]/ A对照品X 100%
[0127]式中，I为超氧化物歧化酶对超氧阴离子的清除率；
[0128]Ams为对照品中2-(4-碘苯)-3_(4-硝基苯)-5_(2’4-二磺基苯)-2H_四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜的吸光度值，无量纲；
[0129]A#s为样品中2-(4-碘苯)-3_ (4-硝基苯)-5_ (2’4-二磺基苯)-2H_四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜的吸光度值，无量纲；
[0130]A空白样品为空白样品中2_ (4-碘苯)_3_ (4-硝基苯)-5- (2’ 4_ 二横基苯)-2H-四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜的吸光度值，无量纲；
[0131]超氧化物歧化酶活性的计算公式如下:
[0132]超氧化物歧化酶活性=I /(1-1)
[0133]根据测得的对照品、样品和空白样品中2-(4-碘苯)-3_(4-硝基苯)-5_(2’ 4_ 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜的吸光度值，经计算得到大鼠血清中超氧化物歧化酶对超氧阴离子的清除率，再根据样品体积以及稀释倍数，换算得到大鼠血清中超氧化物歧化酶的活性为1100U/mL。
[0134]大鼠血清中超氧化物歧化酶对超氧阴离子的清除率，是大鼠血清中超氧化物歧化酶可催化超氧阴离子发生歧化反应，生成氧气和过氧化氢，从而导致与2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐反应的超氧阴离子的量减少，致使捕集剂2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐的还原产物水溶性甲臜染料的量减少；所以大鼠血清中超氧化物歧化酶对超氧阴离子的清除率是通过捕集剂2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜染料含量的变化计算得到，进而得出大鼠血清中超氧化物歧化酶的活性。
[0135] 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
【权利要求】
1.一种测定超氧化物歧化酶活性的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: 步骤a、超氧阴离子产生体系缓冲溶液的配制 配制PH值为8.5~9.5的30-50毫摩尔/升的碳酸氢铵缓冲溶液； 步骤b、标准品的配制 用步骤a中的碳酸氢铵缓冲溶液将标准品配成浓度为50微摩尔/升的标准溶液，所述的标准品为2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐； 步骤C、对照品、样品和空白样品的制备 对照品的制备:取40微升0.1-8毫摩尔/升乙二胺四乙酸二钠盐，加入40微升生理盐水，加入40微升50微摩尔/升的2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐，最后加入40微升I毫摩尔/升邻苯三酚水溶液，37°C反应8~20分钟后，作为对照品，供内置紫外可见分光光度计的酶标仪测定； 样品的制备:取40微升0.4^8毫摩尔/升乙二胺四乙酸二钠盐，加入40微升超氧化物歧化酶溶液，加入40微升50微摩尔/升的2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)~5~ (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐，最后加入40微升I毫摩尔/升邻苯三酚水溶液，37°C反应8~20分钟后，作为样品，供内置紫外可见分光光度计的酶标仪测定； 空白样品的制备:取40微升0.4^8毫摩尔/升乙二胺四乙酸二钠盐，加入40微升超氧化物歧化酶溶液，加入40微升50微摩尔/升的2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)~5~ (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐，最后加入40微升水溶液，37°C反应8~20分钟后，作为空白样品，供内置紫外可见分光光度计的酶标仪测定； 步骤d、对照品、样品和空白样品的检测 设定紫外-可见检测波长为450纳米，在内置紫外可见分光光度计的酶标仪中对步骤c中制备的对照品、样品和空白样品进行测定，得到对照品、样品和空白样品的吸光度值Aw照品、A样品矛卩A空白样品； 步骤e、超氧化物歧化酶的活性的计算 超氧化物歧化酶对超氧阴离子的清除率按照以下公式计算: 1样品=[A对照品"(A样品"A空白样品)]/ A对照品X 100% 式中，I为超氧化物歧化酶对超氧阴离子的清除率； AwmsS对照品中2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜的吸光度值，无量纲； A#s为样品中2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’4-二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜的吸光度值，无量纲； A空白样品为空白样品中2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二横基苯)-2H-四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜的吸光度值，无量纲； 超氧化物歧化酶活性的计算公式如下: 超氧化物歧化酶活性=I / ( 1-1 ) 式中，I为超氧化物歧化酶对超氧阴离子的清除率；超氧化物歧化酶活性单位为U。
2.如权利要求1所述的测定超氧化物歧化酶活性的方法，其特征在于，步骤a中所述的缓冲溶液PH值为9.0~9.5。
3.如权利要求2所述的测定超氧化物歧化酶活性的方法，其特征在于，步骤a中所述的缓冲溶液pH值为9.3。
4.如权利要求1所述的测定超氧化物歧化酶活性的方法，其特征在于，步骤c中所述的乙二胺四乙酸二钠盐的浓度为0.1~2毫摩尔/升。
5.如权利要求4所述的测定超氧化物歧化酶活性的方法，其特征在于，步骤c中所述的乙二胺四乙酸二钠盐的浓度为2毫摩尔/升。
【文档编号】G01N21/33GK103674870SQ201210341599
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年9月14日 优先权日:2012年9月14日
【发明者】刘志强, 徐晨, 刘舒, 邢俊鹏, 宋凤瑞, 郑重, 刘淑莹 申请人:中国科学院长春应用化学研究所